Undersøkelse av beige fettbiologi og metabolisme ved hjelp av CRISPR SunTag-p65-HSF1 aktiveringssystem
Summary
Denne protokollen presenterer bruk av CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) i adipocytter (AdipoSPH) som en alternativ strategi til adenoassosiert virus (AAV) for å undersøke beige fettbiologi. In vivo injeksjon av AAV-bærende sgRNA rettet mot det endogene Prdm16-genet er tilstrekkelig til å indusere beige fettutvikling og forbedre det termogene genprogrammet.
Abstract
Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) teknologi har ført til en revolusjon i biologi, og nyere verktøy har blitt brukt langt utover den opprinnelig beskrevne genredigering. CRISPR-aktiveringssystemet (CRISPRa) kombinerer det katalytisk inaktive Cas9 (dCas9) proteinet med distinkte transkripsjonsmoduler for å indusere endogent genuttrykk. SunTag-p65-HSF1 (SPH) er en nylig utviklet CRISPRa-teknologi som kombinerer komponenter av synergistiske aktiveringsformidlere (SAMs) med SunTag-aktivatorene. Dette systemet tillater overekspresjon av enkle eller flere gener ved å designe et tilpasset enkeltveis RNA (sgRNA). I denne studien ble en tidligere utviklet SPH mus brukt til å generere en betinget mus som uttrykker SPH i adipocytter (adiponektin Cre avstamning), kalt AdipoSPH. For å indusere en hvit-til-beige fett () fenotype, ble et adenoassosiert virus (AAV) som bærer sgRNA rettet mot det endogene Prdm16-genet (en veletablert transkripsjonsfaktor relatert til brun og beige fettutvikling) injisert i det inguinale hvite fettvevet (iWAT). Denne musemodellen induserte uttrykket av endogen Prdm16 og aktiverte det termogene genprogrammet. Videre forbedret in vitro SPH-indusert Prdm16-overekspresjon oksygenforbruket av beige adipocytter, og fenokopierte resultatene fra en tidligere Prdm16 transgen musemodell. Dermed beskriver denne protokollen en allsidig, kostnadseffektiv og tidseffektiv musemodell for å undersøke fettvevsbiologi.
Introduction
Beige (eller brite) adipocytter er frakoblingsprotein 1 (UCP1) -uttrykkende og mitokondrierike adipocytter som ligger i hvite fettvev (WAT) depoter. Beige fett kommer fra en delmengde av adipocytprogenitorer eller modne hvite adipocytter som respons på kald eksponering og andre stimuli 1,2. Beige adipocytter kan konvertere energi til varme på en UCP1-avhengig eller uavhengig måte3. Uavhengig av sin termogene funksjon, kan beige fett også forbedre metabolsk helse på andre måter, for eksempel sekresjon av adipokiner og antiinflammatoriske og antifibrotiske aktiviteter. Studier på mus og mennesker har vist at induksjon av beige fett forbedrer hele kroppen glukose og lipid homeostase3. Men selv om vår kunnskap om beige fettbiologi har utviklet seg raskt de siste årene, er de fleste av dens metabolske fordeler og relaterte mekanismer fortsatt ikke fullt ut forstått.
Klyngede regelmessig interspacede korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) ble først beskrevet i eukaryote celler som et verktøy som er i stand til å generere et dobbeltstrengbrudd (DSB) på et bestemt sted i genomet gjennom nukleaseaktiviteten til Cas9-proteinet 4,5. Cas9 styres av et syntetisk enkeltveis RNA (sgRNA) for å målrette mot en bestemt genomisk region, noe som fører til en DNA DSB. I tillegg til å bruke nukleasen Cas9 til redigeringsformål, har CRISPR-Cas9-teknologien utviklet seg til å bli brukt som et sekvensspesifikt genreguleringsverktøy6. Utviklingen av et katalytisk inaktivt Cas9-protein (dCas9) og assosiasjonen av transkripsjonsmoduler som er i stand til å forbedre genuttrykk, har gitt opphav til CRISPR-aktiveringsverktøy (CRISPRa). Flere CRISPRa-systemer har dukket opp, for eksempel VP647,8, synergistisk aktiveringsmekler (SAM) 9, SunTag10,11, VPR12,13 og SunTag-p65-HSF1 (SPH) 14, som kombinerer komponentene til SAM- og SunTag-aktivatorer. Det har nylig blitt vist at det induserte uttrykket av nevrogene gener i N2a-neuroblaster og primære astrocytter er høyere ved bruk av SPH sammenlignet med andre CRISPRa-systemer14, noe som demonstrerer SPH som et lovende CRISPRa-verktøy.
Her benyttet vi oss av en tidligere utviklet SPH mus14 for å generere en betinget musemodell som uttrykker SPH spesifikt i adipocytter ved bruk av adiponektin Cre-avstamningen (AdipoSPH). Ved å bruke et adenoassosiert virus (AAV) som bærer gRNA rettet mot det endogene Prdm16-genet, ble (hvit til beige konvertering) av inguinal WAT (iWAT) indusert for å øke ekspresjonen av det termogene genprogrammet. Videre økte in vitro Prdm16-overekspresjon oksygenforbruket. Derfor gir denne protokollen en allsidig PH-musemodell for å utforske mekanismene for beige fettutvikling i fettvev.
Protocol
Representative Results
Discussion
En av de mest nyttige ikke-redigeringsapplikasjonene til CRISPR-teknologi er undersøkelsen av genfunksjon gjennom aktivering av endogene gener ved bruk av CRISPRa-systemer6. SPH er en kraftig CRISPRa som opprinnelig ble beskrevet for å indusere omdannelsen av astrocytter til aktive nevroner ved å målrette flere nevrogene gener14. I denne studien ble AdipoSPH vist å være et egnet verktøy for å undersøke beige fettbiologi ved å aktivere uttrykket av endogen Prdm16 i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker støtten mottatt fra Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp, for genereringen av AdipoPH-mus, Inmmunometabolism and Cell Signaling Laboratory, og National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology (INFABIC) for all eksperimentell støtte. Vi takker den økonomiske støtten fra Sao Paulo Research Foundation (FAPESP): 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.
Materials
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| AAVpro 293T Cell Line | Takarabio | 632273 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter | Merckmillipore | UFC510008 | 100 KDa |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement | Gibco | 10565-018 | high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Excelta Self-Opening Micro Scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk) | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8225 | |
| Maxiprep purification kit | Qiagen | 12162 | |
| Microliter syringe | Hamilton | 80308 | Model 701 |
| NEB 10-beta/Stable | New England Biolabs | C3019H | E. coli competent cells |
| pAAV2/8 | Addgene | 112864 | |
| pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry | Addgene | 91947 | |
| pAdDeltaF6 | Addgene | 112867 | |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 23966 | Linear, MW 25000 |
| Povidone-iodine | Rioquímica | 510101303 | Antiseptic |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| SacI enzyme | New England Biolabs | R0156 | |
| Surgical Design Premier Adson Forceps | Fisher Scientific | 22-079-741 | |
| Syringe | Hamilton | 475-40417 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M180B | |
| T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| T4 PNK enzyme kit | New England Biolabs | M0201S | |
| Tramadol Hydrochloride | SEM | 43930 | |
| Vidisic Gel | Bausch + Lomb | 99620 |
References
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
- Cohen, P., Kajimura, S. The cellular and functional complexity of thermogenic fat. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (6), 393-409 (2021).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. Beyond editing: Repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 5-15 (2016).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
- Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
- Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
- Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
- Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
- Chavez, A., et al. Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).
- Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).
- Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Björklund, T., Davidsson, M. AAV production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house aav vector production based on chloroform extraction. Current Protocols in Neuroscience. 93 (1), 103 (2020).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Wang, Q., et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).
- Oeckl, J., Bast-Habersbrunner, A., Fromme, T., Klingenspor, M., Li, Y. Isolation, culture, and functional analysis of murine thermogenic adipocytes. STAR Protocols. 1 (3), 100118 (2020).
- Cohen, P., et al. Ablation of PRDM16 and beige adipose causes metabolic dysfunction and a subcutaneous to visceral fat switch. Cell. 156 (1-2), 304-316 (2014).
- Harms, M., Seale, P. Brown and beige fat: development, function and therapeutic potential. Nature Medicine. 19 (10), 1252-1263 (2013).
- Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nature Metabolism. 4 (8), 978-994 (2022).
- Seale, P., et al. Prdm16 determines the thermogenic program of subcutaneous white adipose tissue in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (1), 96-105 (2011).
- Valet, P., Tavernier, G., Castan-Laurell, I., Saulnier-Blache, J. S., Langin, D. Understanding adipose tissue development from transgenic animal models. Journal of Lipid Research. 43 (6), 835-860 (2002).
- Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: an emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Guangping, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 87-104 (2018).
- Deshmukh, A. S., et al. Proteomics-based comparative mapping of the secretomes of human brown and white adipocytes reveals EPDR1 as a novel batokine. Cell Metabolism. 30 (5), 963-975 (2019).
- Sponton, C. H., et al. The regulation of glucose and lipid homeostasis via PLTP as a mediator of BAT-liver communication. EMBO reports. 21 (9), 49828 (2020).
