Summary
תאים מטאפלסטיים של הלבלב הם מבשרי תאים ממאירים המעוררים גידולים בלבלב. עם זאת, בידוד תאי לבלב שלמים הוא מאתגר. כאן, אנו מציגים שיטה יעילה לדיסוציאציה של רקמת הלבלב. התאים יכולים לשמש לריצוף רנ"א חד-תאי (scRNA-seq) או לתרבית משותפת דו-ממדית או תלת-ממדית.
Abstract
הלבלב כולל שתי מערכות עיקריות: המערכת האנדוקרינית, המייצרת ומפרישה הורמונים, והמערכת האקסוקרנית, המהווה כ-90% מהלבלב וכוללת תאים המייצרים ומפרישים אנזימי עיכול. אנזימי העיכול מיוצרים בתאי הלבלב האצינאריים, מאוחסנים בשלפוחיות הנקראות זימוגנים, ולאחר מכן משוחררים לתריסריון דרך צינור הלבלב כדי להתחיל תהליכים מטבוליים. האנזימים המיוצרים על ידי תאי אצינר יכולים להרוג תאים או לפרק RNA ללא תאים. בנוסף, תאים אצינאריים הם שבירים, ופרוטוקולי דיסוציאציה נפוצים גורמים למספר רב של תאים מתים ופרוטאזות ו-RNases נטולי תאים. לכן, אחד האתגרים הגדולים ביותר בעיכול רקמת הלבלב הוא שחזור תאים שלמים וברי קיימא, במיוחד תאים אצינריים. הפרוטוקול המוצג במאמר זה מציג שיטה דו-שלבית שפיתחנו כדי לענות על צורך זה. הפרוטוקול יכול לשמש לעיכול לבלב תקין, לבלב הכולל נגעים טרום ממאירים, או גידולי לבלב הכוללים מספר רב של תאי סטרומה ומערכת החיסון.
Introduction
אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) היא אחד מסוגי הסרטן האגרסיביים ביותר1. ראיות קליניות תומכות ברעיון כי PDAC מתפתח מתאי מערכת אקסוקרינית, כולל תאים אצינריים, במשך שנים רבות, מונע על ידי מוטציות בפרוטו-אונקוגןKRAS 2.
גידולי לבלב כוללים סוגי תאים רבים ושונים, והוכח כי תאים ממאירים מהווים רק 20%-50% ממסת הגידול3. סוגי תאים שונים מתקשרים עם תאי האפיתל, תומכים בטרנספורמציה שלהם ומשפרים את היווצרות הגידול וצמיחתו. אירועים מוקדמים גורמים למטאפלזיה אצינרית, אשר מעוררת נגעים מיקרוסקופיים הנקראים ניאופלזיה תוך-אפיתליאלית של הלבלב (PanINs), אשר יכולים במקרים מסוימים להתפתח ל-PDAC4.
יש צורך קריטי לחקור אינטראקציות אלה ולכוון אותות מרכזיים. ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) היא שיטה רבת עוצמה החושפת ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד, ובכך עוקבת אחר השינויים שעוברים תאי אפיתל, ובכך מאפשרת לחקור את התפתחות סרטן הלבלב.
דיסקציה ועיכול רקמות לתאים בודדים היא השלב הראשון בניסוי scRNA-seq. מספר גורמים הופכים את עיכול רקמת הלבלב למאתגר במיוחד: 1) תאי אצינר מהווים יותר מ-90% מהלבלב ותאי אצינר מכילים כמויות גדולות של אנזימי עיכול, כולל פרוטאזות ו-RNases המפחיתים את איכות הספריות מבוססות RNA; (ii) תאים אצינאריים רגישים מאוד ועשויים לשכב אם משתמשים בפרוטוקולים סטנדרטיים; (iii) תאי אצינר מבטאים מספר קטן של גנים ברמות גבוהות מאוד. לכן, אם תאים אלה הם lysed במהלך הניסוי, זה יכול לזהם את פרופיל ביטוי גנים שנצפה של תאים אחרים; (iv) רקמת הלבלב שהתאוששה מגידולים היא דסמופלסטית, ולכן קשה לנתח אותה מבלי לפגוע בתאים. לכן, למרות שנדרשת שמירה על כדאיות גבוהה של כל סוגי התאים, מספרם הרב ורגישותם של התאים האצינאריים מוסיפים מורכבות נוספת. גורמים אלה מערימים קשיים בהשגת תרחיף חד-תאי שהוא בר-קיימא ביותר מ-80% ואין לו גושים, כפי שנדרש בניסויי scRNA-seq.
כאן, פיתחנו פרוטוקול באמצעות טריפסין C ו collagenase P, יחד עם ניטור רקמות תכוף. זה תומך בדיסוציאציה לתאים בודדים תוך שמירה על כדאיות גבוהה לתמיכה בהצלחת ניסויי scRNA-seq 5,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ועדת האתיקה המשותפת (הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים) של האוניברסיטה העברית (ירושלים, ישראל) והמרכז הרפואי הדסה (ירושלים, ישראל) אישרה את פרוטוקול המחקר לרווחת בעלי חיים (MD-18-15417-5 "דינמיקה של רקמות בסרטן הלבלב בעכברים"), והפרוטוקול המוצג כאן עמד בכל התקנות האתיות הרלוונטיות לניסויים ומחקר בבעלי חיים. האוניברסיטה העברית היא אגודה להערכה והסמכה של המכון הבינלאומי לטיפול בחיות מעבדה.
הערה: מלאי זן העכבר #007908, מלאי #019378 ומלאי #008179 התקבלו מהמעבדה של ג'קסון. PRT (Kras+/LSL-G12D; Ptf1a-CreER; עכברי Rosa26LSL-tdTomato) נוצרו על ידי חציית הזנים הנ"ל. עכברים משני המינים, בגילאי 6 שבועות עד 15 חודשים, שימשו למחקר. טמוקסיפן הוכן על ידי המסת האבקה בשמן תירס. עכברים בוגרים (בני 6-8 שבועות, נקבות וזכרים), קיבלו הזרקה תת עורית של טמוקסיפן בימים 0 ו-2 במינון של 400 מ"ג/ק"ג ונבדקו פעמיים בשבוע לאחר ההזרקה. לא ניתן היה למדוד גידולים מכיוון שהם היו ממוקמים באופן פנימי; לכן, המתת חסד בוצעה אם נצפו סימנים קליניים חריגים על פי הפרוטוקול האתי. עכברים הומתו בנקודות זמן שונות לאחר השראת טמוקסיפן, באמצעות איזופלורן ונקע צוואר הרחם.
1. דיסקציה של הלבלב
הערה: לקבלת תפוקה אופטימלית במהלך החילוץ וכדי להבטיח כדאיות תאים טובה, דיסקציה מהירה היא קריטית. כדי לקצר את הזמן הדרוש לבידוד הלבלב, כל המכשירים והציוד חייבים להיות מוכנים על קרח לפני המתת העכבר.
- יש להרדים את העכבר על ידי חנקCO2 ולוודא באמצעות נקע צוואר הרחם. משלב זה ואילך, כל ההליכים חייבים להתבצע עם מכשירי ניתוח סטריליים.
- תקן את העכבר ורסס את הבטן עם 70% אתנול. בצע חתך בצורת V של 2.5 ס"מ באזור איברי המין עם מספריים ומלקחיים ולהמשיך כלפי מעלה כדי לפתוח באופן מלא את חלל הבטן.
- אתר את הבטן בצד שמאל של העכבר. אתר את הלבלב, שנמצא ליד הטחול. מפרידים את הלבלב מהקיבה והתריסריון באמצעות שתי מלקחיים (ללא קריעה). המשיכו להפריד את הלבלב מהמעי הדק, הג'ג'ונום והאיליאום.
- הזז את הלבלב לצד ימין של העכבר. להפריד את החיבורים הנותרים בין הלבלב לבין חלל החזה עם מלקחיים כדי לנתק לחלוטין את הלבלב ואת הטחול המחובר.
- מוציאים את הלבלב ופורסים אותו לבדיקה בצלוחית פטרי על קרח.
הערה: יש להקפיד במהלך שלב זה להסיר רק את הלבלב, ולא להסיר רקמת שומן מזנטרי או רקמה סמוכה אחרת יחד עם הלבלב, כדי למנוע זיהום תאי.
2. דיסוציאציה אנזימטית ומכנית של הלבלב
- הכינו מראש את המאגרים הבאים.
- חיץ דיסוציאציה 1: 4 מ"ל של טריפסין C + 6 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) (ראה טבלה 1) עבור כל דגימה.
- חיץ דיסוציאציה 2: 9 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת הנקס′ (HBSS) 1x; אלבומין בסרום בקר 4% (BSA); 1 מ"ל של collagenase P (10 מ"ג / מ"ל); 200 μL של מעכב טריפסין (10 מ"ג / מ"ל); ו-200 μL של DNase I (10 מ"ג/מ"ל) (ראה טבלה 1).
- חיץ שטיפה: 50 מ"ל של HBSS 1x; 2 גרם של BSA; 1 מ"ל של מעכב טריפסין (10 מ"ג / מ"ל); ו-1 מ"ל DNase 1 (10 מ"ג/מ"ל).
- תמיסת עצירת פעילות אנזימים: HBSS 1x המכיל 5% סרום בקר עוברי (FBS) ו-150 גרם DNase I (0.2 מ"ג/מ"ל).
- מניחים את הלבלב בצינור 50 מ"ל על קרח. שטפו את הלבלב ב-10% FBS ב-HBSS 1x. רקמת השומן תצוף והלבלב ישקע. זוהי דרך קלה לדמיין ולהסיר במהירות את רקמת השומן הלבן המזהמת עדיין מחובר ללבלב.
- מעבירים את רקמת הלבלב של העכבר לצלחת פטרי סטרילית המכילה 5 מ"ל HBSS 1x על קרח. חתכו את הלבלב לחתיכות קטנות של 1 עד 3 מ"מ3 באמצעות מספריים Noyes ואזמל (איור 2A). במקרה של יותר מדגימה אחת, יש לשמור את הדגימות על קרח ב-10% FBS/HBSS 1x.
- מעבירים את הרקמות לצינור צנטריפוגה. צנטריפוגה ב 350 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות. שאפו והשליכו את הסופרנאטנט כדי להסיר שברי תאים ותאי דם.
- השהה מחדש את החלקים במאגר דיסוציאציה 1 המכיל 0.02% טריפסין C-0.05% EDTA למשך 10 דקות ב-37°C עם תסיסה (180 סל"ד). יש לשטוף מיד עם 10% FBS/Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM). צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 350 גרם ב 4 ° C.
- יש לשטוף שוב על ידי השעיית הגלולה ב-10 מ"ל של חיץ כביסה וצנטריפוגה ב-350 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס לפני שלב הדיסוציאציה הבא.
- לדגור על הלבלב בחיץ דיסוציאציה 2 למשך 15 דקות ב-37°C עם תסיסה (180 סל"ד).
- לאחר 15 דקות, לבצע דיסוציאציה מכנית על ידי pipeting נמרצות את שברי הלבלב למעלה ולמטה פיפטות סטריליות בגודל הולך ופוחת (25, 10, ו 5 מ"ל פיפטות סרולוגיות) 10 פעמים ולהביא בחזרה ל 37 ° C.
- לאחר 5 דקות נוספות, חזור על הדיסוציאציה המכנית והשתמש במיקרוסקופ אור כדי לפקח על הדיסוציאציה בהתאם לכמות ההשעיה של תא בודד. בדרך כלל אם בשלב זה, פחות מ -90% מההשעיה מורכבת מתאים בודדים מבודדים, יש צורך בזמן דגירה ארוך יותר. השתמש בכחול טריפאן כדי לפקח על כדאיות התא.
- המשך עם הדגירה ולקחת דגימות כדי לזהות את הדיסוציאציה כל 5 דקות.
הערה: זמן הדגירה הכולל תלוי ברקמה ויכול להשתנות בין דגימות. הדגירה ודיסוציאציה של רקמות אמורות להסתיים כאשר 90% מהתאים מופרדים לתאים בודדים או כאשר מתגלה ירידה בכדאיות.
- לאחר שרקמת הלבלב מנותקת היטב (בהתאם להיעלמות מקטעי הלבלב ולעכירות הגוברת של התמיסה) (איור 2), עצרו את התגובה האנזימטית על-ידי שטיפה פעמיים עם תמיסת עצירת פעילות האנזים למשך 5 דקות ב-4°C. משלב זה, שמור את תרחיף התא על קרח.
- העבירו את מתלה התא דרך רשת ניילון של 70μm ובדקו את כדאיות התא תחת המיקרוסקופ. גדלים קטנים יותר של רשת ניילון עשויים להפחית את כדאיות התא.
- להשהות ולשטוף את הגלולה עם 5-10 מ"ל של תמיסת כביסה חוצצת קרה כקרח. ספור את התאים.
- אם נצפים מספר תאי דם אדומים, יש לטפל בתאים עם חיץ ליזה של תאי דם אדומים למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. במקרים בהם נצפים גושים, יש לטפל שוב במדגם עם טריפסין, כמתואר בשלב 2.5. הכדאיות מזוהה עם כחול טריפאן מתחת למיקרוסקופ, ואם הכדאיות נמוכה מ-80%, יש לבודד תאים חיים באמצעות ערכת מיון תאים מתים (MACS) המופעלת מגנטית עם עמודות MACS MS (ראה טבלה 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעבודה5 שפורסמה לאחרונה, יישמנו את הפרוטוקול המתואר לעיל כדי לחקור את השלבים המוקדמים של פיתוח PDAC באמצעות מודל עכבר. העכבר הונדס גנטית כך שיכלול את הקלטות Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato 7, המאפשרות ביטוי של KRAS פעיל באופן קונסטיטוטיבי בתאי אצינר לאחר הזרקת טמוקסיפן.
לאחר פריקת צוואר הרחם (בהתאם לפרוטוקול האתי של העכבר), הלבלב נכרת, והפרוטוקול שתואר לעיל יושם (ראו איור 1 ופרוטוקול).
כדי לייעל את פרוטוקול הדיסוציאציה, הדיסוציאציה בוצעה עם או בלי דגירה מוקדמת של הרקמה עם טריפסין C. נמצא כי טרום הדגירה עם טריפסין C האיץ את הדיסוציאציה מבלי להשפיע על הכדאיות. נוסף על כך, נוסו קולגנים שונים, כולל collagenase D, collagenase 1a ו-collagenase P (ראו טבלה 1). נמצא כי שימוש ב-collagenase D גרם למוות מסיבי של תאים, ואכן במחקרים אחרים שהשתמשו ב-collagenase זה, החלק של תאי acinar היה קטן מאוד8. גם השימוש ב-collagenase 1a לא סיפק את התוצאות המצופות, שכן גם לאחר דגירה של 90 דקות עם collagenase 1a, הרקמה לא נותקה. רק collagenase P איפשר לנו לנתק את הרקמה ולשמור על כדאיות גבוהה של כל סוגי התאים.
ניסויים אלה חזרו על עצמם בשבע נקודות זמן שונות לאחר הזרקת טמוקסיפן. במקביל למטאפלזיה אצינארית לדוקטלית והיווצרות נגעי PanIN, הייתה הצטברות של תאי סטרומה ומערכת החיסון, כולל פיברובלסטים, והרקמה הפכה דסמופלסטית ונוקשה. נקודות הזמן השונות לאחר הזרקת הטמוקסיפן אפשרו לנו לבחון את הפרוטוקול במספר מצבי רקמה שונים ולמדוד את ההתאוששות של תאי אפיתל, סטרומה ומערכת החיסון.
תמונה של עכבר מוצגת באיור 2A, והלבלב המבודד, רקמה רכה, מוצג באיור 2C. הצבע האדום של הרקמה נובע מביטוי של tdTomato בתאי acinar. נעשה שימוש מוצלח בפרוטוקול עם כל מצבי הרקמה ועם דגימות אנושיות. עם זאת, זמני הדגירה עם טריפסין וקולגנאז עשויים להשתנות. לכן חשוב לעקוב אחר הדגימה ולצפות בדיסוציאציה של הרקמה ויכולת קיום התא כל כמה דקות מתחת למיקרוסקופ. בשלב מוקדם של פרוטוקול הדיסוציאציה היו מספר נמוך של תאים מבודדים ומספר גדול של גושים (איור 2D, משמאל). מטרתנו הייתה להשיג תאים בני קיימא מבודדים, כפי שמוצג באיור 2D, באמצע, ולהימנע מירידה במספר התאים בני קיימא (איור 2D, מימין).
חשוב לציין כי זמני דגירה ארוכים יותר הפחיתו את יכולת הקיום של התאים. החל מרקמה בגודל 0.5 x 10 ס"מ3 , התאוששנו בסך הכל 5 x 106 תאים, 5 x 105 מהם היו tdTomato תאים חיוביים. על-פי ניתוח מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות (FACS) באיור 3, פרוטוקול הדיסוציאציה של הלבלב שלנו תומך בהתאוששות של סוגי תאים מרובים, כולל תאי אצינר, תאים דוקטליים, תאי אנדותל, פיברובלסטים, תאי מערכת החיסון ופריציטים בעלי כדאיות גבוהה. אולם היחס בפועל בין מספר התאים מכל סוג ברקמה לפני הדיסוציאציה עשוי להיות שונה, כפי שניתן להסיק מתמונות פלואורסצנטיות של מקטעים קפואים בלבלב הכוללים תאים חיוביים של tdTomato (איור 2E). הכדאיות הגבוהה שהושגה באמצעות הפרוטוקול המפורט לעיל מוצגת על-ידי ניתוח FACS (איור 3) וספירת תאים חיים/תאים מתים שנעשתה באמצעות המוציטומטר (איור 3H).
עבור כל דגימה, ביצענו scRNA-seq, ובהתאם לניתוח FACS, אישרנו את הזיהוי של כל סוגי התאים שהוזכרו לעיל (איור 4A,B), בכל אחת מהרקמה שנכרתה מכל נקודות הזמן שלאחר הזרקת טמוקסיפן. בחנו גם את הביטוי של carboxypeptidase 1 (Cpa1), המקודד carboxypeptidase1. ביטוי Cpa1 בתאי אצינר הוא גבוה ביותר ויכול להצביע באיזו מידה תאי אצינר עברו ליזה במהלך הדיסוציאציה, כמו גם באיזו מידה הם זיהמו את התעתיק של סוגי תאים אחרים. זיהינו זיהום מינימלי, כפי שניתן לראות באיור 4C,D. הדיסוציאציה העדינה גם גורמת לכדאיות גבוהה שמאפשרת לנו לעקוב אחר מיון תאים של סוגי תאים רצויים לניסויים נוספים (איור 3).
יחד, האיכות של פרוטוקול הדיסוציאציה תומכת בניסויי המשך שונים, כולל scRNA-seq.
איור 1: סכימת הפרוטוקול. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: בידוד תאי הלבלב. (A) תמונה המראה את הלבלב (באדום), הכבד והטחול של העכבר לאחר פתיחה מלאה של חלל הבטן. (B) אותו עכבר כמו ב-(A) לאחר הסרת הלבלב. (C) דיסקציה של הלבלב. הלבלב לאחר ההסרה מהחיה (משמאל). הלבלב לאחר מחשופים לחתיכות קטנות (באמצע). הפרדת פאזה לאחר צנטריפוגה (מימין). (D) ניטור התאים תחת המיקרוסקופ כדי לבחון את יכולת הקיום של תא בודד. בידוד תאי לבלב ראשוני כולל (פי 20). גושי תאים לאחר 15 דקות של תגובה אנזימטית (משמאל). תרחיף חד-תאי לאחר 25 דקות של תגובה אנזימטית (באמצע). ירידה בכדאיות התא לאחר דגירה ארוכה (מימין). (E) תמונות פלואורסצנטיות של קטע לבלב קפוא. תאי Acinar הם tdעגבניות חיובי; צביעת DAPI בכחול (תמונה ברמת 40x). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוח FACS של תרחיף חד-תאי של סרטן הלבלב . (A) tdTomato תאים חיוביים ושליליים. (B) ציטומטריית זרימה של תאים אצינאריים לא ממוינים (באדום) לעומת תאים אצינאריים ממוינים (כחולים). (ג,ו) תאים לא מוכתמים, APC ו-PB450. (D) ניתוח FACS לאחר צביעה עם Anti-CD31, סמן של תאי אנדותל. (E) ניתוח FACS לאחר צביעה עם Anti-CD140b, סמן של פריציטים. (G) ניתוח FACS לאחר צביעה עם Anti-CD11c, סמן של תאים דנדריטיים ומקרופאגים. (H) היחס בין תאים חיים לתאים מתים בארבעה מבודדי תאי לבלב שונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניתוח נתוני scRNA-seq שהופקו באמצעות הפרוטוקול שאנו מתארים במאמר הנוכחי. (A) UMAP המראה scRNA-seq של לבלב עכבר בנקודות זמן שונות לאחר הזרקת טמוקסיפן, כפי שמצוין בצד ימין של הלוח. (B) סוגי התאים נקבעו בהתבסס על סמנים ידועים. (ג,ד) התאים נצבעים לפי רמת הביטוי של Cpa1 (ב-C) או לפי רמת tdTomato (ב-D). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במאמר זה נציג פרוטוקול לדיסוציאציה של רקמת הלבלב. הפרוטוקול פשוט, קל לשימוש ומספק כלי לבידוד תאים בודדים ברי קיימא מרקמת הלבלב בשלבים שונים בתהליך הממאירות, כולל גידולים מוצקים. במחקרים קודמים, סוגים שונים של collagenases שימשו לעיכול הלבלב 8,9. שימוש ב-collagenase חזק מאוד, כגון collagenase D, גורם לאוכלוסייה גדולה של תאי מערכת החיסון ולאחוז נמוך יותר של תאי אפיתל. השימוש ב- collagenase P מאפשר עיכול לבלב המתאים לרקמת לבלב שלמה או גידולית.
בהתבסס על התצפיות שלנו, ניתן לבודד את כל סוגי התאים. בעבר תיקפנו חדירה של תאי T חיסוניים, למשל, באמצעות אימונוהיסטוכימיה5; אנו מאמינים כי מספר התאים היחסי שראינו בניתוח שלנו הוא קירוב הולם לייצוג בפועל של תאים ברקמה, למעט תאים אצינאריים שהם שבירים ולכן היו בתת-ייצוג. אנו ממליצים להשתמש באימונוהיסטוכימיה או בתעתיק מרחבי10,11,12 אם יש צורך בפרופורציות מדויקות של סוגי תאים ברקמה. בנוסף, ראינו כי הדיסוציאציה של רקמות מעכברי בר בהיעדר ביטוי KRAS פעיל באופן מכונן מאתגרת יותר ודורשת ניטור תכוף יותר, כדי לעצור את התגובה האנזימטית בזמן על ידי הוספת 10% FBS למאגר השטיפה ולמנוע מוות תאי מסיבי. זה גם עולה בקנה אחד עם זיהום מכמה תמלילי acinar נפוצים מאוד, כגון Cpa1, אם כי הפרוטוקול שלנו ממזער בעיה זו.
בידוד התאים יכול לשמש עבור scRNA-seq, כפי שהראינו5, עבור תאים בתרבית, או כחומר מוצא עבור אורגנואידים, למשל.
הצורך ברקמה טרייה הוא מגבלה אחת של השיטה. גישה חלופית המתמקדת בבידוד גרעינים, ריצוף RNA חד-גרעין (sNuc-seq)13, שימשה לאחרונה לחקר גידולי PDAC מחולים ברזולוציה של תא בודד11; בעתיד, יהיה מעניין להשוות את איכות הנתונים של תאי אפיתל הלבלב המתקבלים מ sNuc-seq לעומת scRNA-seq. חשוב לציין, מיצוי גרעין אינו מאפשר גידול תאים, ומיון להעשרה עבור סוגי תאים ספציפיים הוא מאתגר ביותר. לכן, פרוטוקול דיסוציאציה של רקמות יהיה שימושי בעתיד עבור ניסויי scRNA-seq ועבור יישומים נוספים אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לד"ר אביטל סרוסי-פורטוגז על העזרה בניתוח הנתונים ולד"ר דרור קולודקין-גל על הסיוע בביסוס הפרוטוקול במחקר קודם. אנו מודים לכל חברי מעבדת פרנס בעבר ובהווה. אנו מודים לד"ר ג'יליאן קיי ולד"ר מיכאל קנובסקי על עזרתם בעריכה. פרויקט זה זכה למימון ממענק הקרן הלאומית למדע (מס' 526/18), תוכנית אלכס א. סויקה, ומענק מהקרן לחקר הסרטן (פרס לפיתוח קריירת מחקר).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent or Resource | |||
| 70 µm nylon mesh | Corning | cat##431751 | |
| BSA | Sigma Aldrich | cat# A7906 | |
| Collagenase P | Roche | cat# 11213857001 | |
| Critical Commercial Assay | |||
| DAPI | Sigma Aldrich | cat#MBD0015 | |
| Dnase I | Roche | cat# 10104159001 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Fetal Bovine Serum South American | ThermoFisher | Cat#10270106 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Biological industries | cat#02-018-1A | |
| KRASLSL-G12D mice | Jackson Laboratory | JAX008179 | |
| MACS dead cells removal kit | Milteny Biotec | cat#130-090-101 | |
| PBS | Biological industries | cat#02-023-1A | |
| Ptf1a-CreER mice | Jackson Laboratory | JAX019378 | |
| Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX007908 | |
| Trypsin C-EDTA 0.05% | Biological industries | cat# 03-053-1A | |
| Trypsin inhibitor | Roche | cat#T6522 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Peng, J., et al. Author correction: single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Research. 29 (9), 777 (2019).
- Hruban, R. H., Wilentz, R. E., Kern, S. E.
- Schlesinger, Y., et al. Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells' heterogeneity. Nature Communications. 11 (1), 4516 (2020).
- Kolodkin-Gal, D., et al. Senolytic elimination of Cox2-expressing senescent cells inhibits the growth of premalignant pancreatic lesions. Gut. 71 (2), 345-355 (2021).
- Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
- Elyada, E., et al. Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts. Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).
- Bernard, V., et al. Single-cell transcriptomics of pancreatic cancer precursors demonstrates epithelial and microenvironmental heterogeneity as an early event in neoplastic progression. Clinical Cancer Research. 25 (7), 2194-2205 (2019).
- Moncada, R., et al. Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas. Nature Biotechnology. 38 (3), 333-342 (2020).
- Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptome profiling of pancreatic cancer identifies multicellular dynamics associated with neoadjuvant treatment. Nature Genetics. 54 (8), 1178-1191 (2022).
- Cui Zhou, D., et al. Spatially restricted drivers and transitional cell populations cooperate with the microenvironment in untreated and chemo-resistant pancreatic cancer. Nature Genetics. 54 (9), 1390-1405 (2022).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
