生存可能な単一細胞を単離するための膵臓組織解剖
Summary
膵臓の転生細胞は、膵臓腫瘍を引き起こす悪性細胞の前駆体です。しかし、無傷の生膵細胞を単離することは困難です。ここでは、膵臓組織を解離するための効率的な方法を紹介します。その後、細胞はシングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)または2次元または3次元の共培養に使用できます。
Abstract
膵臓には、ホルモンを産生・分泌する内分泌系と、膵臓の約90%を占め、消化酵素を産生・分泌する細胞を含む外分泌系の2つの主要なシステムがあります。消化酵素は膵腺房細胞で産生され、接合菌と呼ばれる小胞に蓄えられ、膵管 を介して 十二指腸に放出され、代謝プロセスを開始します。腺房細胞によって産生される酵素は、細胞を殺したり、無細胞RNAを分解したりする可能性があります。さらに、腺房細胞は壊れやすく、一般的な解離プロトコルでは、多数の死細胞と無細胞プロテアーゼおよびRNaseが生じます。したがって、膵臓組織の消化における最大の課題の1つは、無傷で生存可能な細胞、特に腺房細胞を回復させることです。この記事で紹介するプロトコルは、このニーズを満たすために開発した2段階の方法を示しています。プロトコルが正常な膵臓、前悪性病変を含んでいる膵臓、または多数の間質および免疫細胞を含んでいる膵臓の腫瘍を消化するのに使用することができる。
Introduction
膵管腺がん(PDAC)は、最も侵攻性のがんの1つです1。臨床的証拠は、PDACがKRASがん原遺伝子2の変異によって引き起こされる腺房細胞を含む外分泌系細胞から長年にわたって発生するという考えを支持しています。
膵臓腫瘍には多くの異なる種類の細胞が含まれ、悪性細胞は腫瘍量の20%〜50%にしかカウントされないことが実証されています3。さまざまな種類の細胞が上皮細胞と相互作用し、その形質転換をサポートし、腫瘍の形成と増殖を促進します。初期のイベントは腺房化生を引き起こし、膵臓上皮内腫瘍(PanIN)と呼ばれる顕微鏡的病変を引き起こし、場合によってはPDAC4に発展する可能性があります。
これらの相互作用を調査し、重要なシグナルを標的にすることが非常に重要になっています。シングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)は、シングルセルの分解能で遺伝子発現を明らかにする強力な手法であり、それによって上皮細胞が受ける変化を追跡し、膵臓がんの発生の調査を可能にします。
単一細胞への組織の解剖と消化は、scRNA-seq実験の最初の段階です。いくつかの要因により、膵臓組織の消化が特に困難になります:i)腺房細胞は膵臓の90%以上を占め、腺房細胞には、RNAベースのライブラリの質を低下させるプロテアーゼやRNaseなどの消化酵素が大量に含まれています。(ii)腺房細胞は非常に敏感であり、標準的なプロトコルを使用すると溶解する可能性があります。(iii)腺房細胞は、少数の遺伝子を非常に高いレベルで発現します。したがって、実験中にこれらの細胞を溶解すると、他の細胞の観察された遺伝子発現プロファイルが汚染される可能性があります。(iv)腫瘍から回収された膵臓組織は線維形成性であり、細胞を傷つけずに解剖することは困難です。したがって、すべての細胞タイプで高い生存率を維持する必要がありますが、腺房細胞の数と感度が大きいため、複雑さが増します。これらの要因により、scRNA-seq実験に必要な80%以上の生存率と凝集塊のない単一細胞懸濁液の実現が困難になります。
ここでは、トリプシンCとコラゲナーゼPを使用し、頻繁な組織モニタリングとともにプロトコルを開発しました。これにより、単一細胞への解離がサポートされ、高い生存率が維持され、scRNA-seq実験の成功を裏付けます5,6。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、膵臓組織解離のプロトコルを紹介します。このプロトコルはシンプルで使いやすく、固形腫瘍を含む悪性腫瘍プロセス中のさまざまな段階で、膵臓組織から生細胞を分離するためのツールを提供します。以前の研究では、膵臓を消化するためにさまざまな種類のコラゲナーゼが使用されました8,9。コラゲナーゼDなどの非常に強力な?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
データ解析に協力してくださったAvital Sarusi-Portuguez博士と、以前の研究でプロトコルを確立するための支援をしてくれたDror Kolodkin-Gal博士に感謝します。パルナス研究室の過去および現在のすべてのメンバーに感謝します。編集に協力してくださったGillian Kay博士とMichael Kanovsky博士に感謝します。このプロジェクトは、イスラエル科学財団の助成金(No.526/18 O.P.)、Alex U. Soyka Program、およびIsrael Cancer Research Fund(Research Career Development Award)の助成金を受けています。
Materials
| Reagent or Resource | |||
| 70 µm nylon mesh | Corning | cat##431751 | |
| BSA | Sigma Aldrich | cat# A7906 | |
| Collagenase P | Roche | cat# 11213857001 | |
| Critical Commercial Assay | |||
| DAPI | Sigma Aldrich | cat#MBD0015 | |
| Dnase I | Roche | cat# 10104159001 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Fetal Bovine Serum South American | ThermoFisher | Cat#10270106 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Biological industries | cat#02-018-1A | |
| KRASLSL-G12D mice | Jackson Laboratory | JAX008179 | |
| MACS dead cells removal kit | Milteny Biotec | cat#130-090-101 | |
| PBS | Biological industries | cat#02-023-1A | |
| Ptf1a-CreER mice | Jackson Laboratory | JAX019378 | |
| Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX007908 | |
| Trypsin C-EDTA 0.05% | Biological industries | cat# 03-053-1A | |
| Trypsin inhibitor | Roche | cat#T6522 |
References
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