Dissectie van pancreasweefsel om levensvatbare afzonderlijke cellen te isoleren
Summary
Metaplastische cellen van de alvleesklier zijn voorlopers van kwaadaardige cellen die aanleiding geven tot pancreastumoren. Het isoleren van intacte levensvatbare alvleeskliercellen is echter een uitdaging. Hier presenteren we een efficiënte methode voor dissociatie van pancreasweefsel. De cellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) of voor twee- of driedimensionale co-culturing.
Abstract
De alvleesklier omvat twee belangrijke systemen: het endocriene systeem, dat hormonen produceert en afscheidt, en het exocriene systeem, dat ongeveer 90% van de alvleesklier uitmaakt en cellen omvat die spijsverteringsenzymen produceren en afscheiden. De spijsverteringsenzymen worden geproduceerd in de acinaire cellen van de alvleesklier, opgeslagen in blaasjes die zymogens worden genoemd, en worden vervolgens via het pancreaskanaal in de twaalfvingerige darm vrijgegeven om metabolische processen op gang te brengen. De enzymen die door de acinaire cellen worden geproduceerd, kunnen cellen doden of celvrij RNA afbreken. Bovendien zijn acinaire cellen kwetsbaar en resulteren gemeenschappelijke dissociatieprotocollen in een groot aantal dode cellen en celvrije proteasen en RNases. Daarom is een van de grootste uitdagingen bij de vertering van pancreasweefsel het herstellen van intacte en levensvatbare cellen, met name acinaire cellen. Het protocol dat in dit artikel wordt gepresenteerd, toont een tweestapsmethode die we hebben ontwikkeld om aan deze behoefte te voldoen. Het protocol kan worden gebruikt om normale alvleesklier, alvleesklier met premaligne laesies of alvleeskliertumoren met een groot aantal stromale en immuuncellen te verteren.
Introduction
Ductaal adenocarcinoom van de alvleesklier (PDAC) is een van de meest agressieve kankersoorten1. Klinisch bewijs ondersteunt het idee dat PDAC zich gedurende vele jaren ontwikkelt uit cellen van het exocriene systeem, waaronder acinaire cellen, aangedreven door mutaties in het KRAS-proto-oncogen2.
Pancreastumoren omvatten veel verschillende celtypen en het is aangetoond dat kwaadaardige cellen slechts 20%-50% van de tumormassa uitmaken3. Verschillende celtypen interageren met de epitheelcellen, ondersteunen hun transformatie en verbeteren de vorming en groei van tumoren. Vroege gebeurtenissen veroorzaken acinaire metaplasie, die aanleiding geeft tot microscopisch kleine laesies die intra-epitheliale neoplasie van de pancreas (PanIN’s) worden genoemd en die zich in sommige gevallen kunnen ontwikkelen tot PDAC4.
Het is van cruciaal belang om deze interacties te onderzoeken en zich te richten op cruciale signalen. Single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) is een krachtige methode die genexpressie onthult met een resolutie van één cel, waardoor de veranderingen die epitheelcellen ondergaan worden gevolgd, waardoor de ontwikkeling van alvleesklierkanker kan worden onderzocht.
Weefseldissectie en vertering naar afzonderlijke cellen is de eerste fase in een scRNA-seq-experiment. Verschillende factoren maken de vertering van pancreasweefsel bijzonder uitdagend: i) acinaire cellen zijn goed voor meer dan 90% van de pancreas en acinaire cellen bevatten grote hoeveelheden spijsverteringsenzymen, waaronder proteasen en RNases die de kwaliteit van op RNA gebaseerde bibliotheken verminderen; ii) acinaire cellen zijn zeer gevoelig en kunnen lyseren als standaardprotocollen worden gebruikt; (iii) acinaire cellen brengen een klein aantal genen tot expressie op zeer hoge niveaus. Daarom, als deze cellen tijdens het experiment worden gelyseerd, kan dit het waargenomen genexpressieprofiel van andere cellen besmetten; (iv) pancreasweefsel dat uit tumoren wordt teruggewonnen, is desmoplastisch, waardoor het moeilijk te ontleden is zonder de cellen te beschadigen. Dus hoewel het handhaven van een hoge levensvatbaarheid van alle celtypen vereist is, voegen het grote aantal en de gevoeligheid van acinaire cellen extra complexiteit toe. Deze factoren maken het moeilijk om een eencellige suspensie te bereiken die voor meer dan 80% levensvatbaar is en geen klonten heeft, zoals vereist is voor scRNA-seq-experimenten.
Hier ontwikkelden we een protocol met trypsine C en collagenase P, samen met frequente weefselmonitoring. Dit ondersteunt de dissociatie van afzonderlijke cellen met behoud van een hoge levensvatbaarheid om het succes van scRNA-seq-experimenten te ondersteunen 5,6.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel presenteren we een protocol voor dissociatie van pancreasweefsel. Het protocol is eenvoudig, gebruiksvriendelijk en biedt een hulpmiddel om levensvatbare afzonderlijke cellen uit pancreasweefsel te isoleren in verschillende stadia tijdens het maligniteitsproces, inclusief solide tumoren. In eerdere studies werden verschillende soorten collagenasen gebruikt om de alvleesklier te verteren 8,9. Het gebruik van een zeer krachtig collagenase, zoals coll…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Dr. Avital Sarusi-Portuguez bedanken voor zijn hulp bij de data-analyse en Dr. Dror Kolodkin-Gal voor zijn hulp bij het opstellen van het protocol in een eerdere studie. We danken alle voormalige en huidige leden van het Parnas-lab. We danken Dr. Gillian Kay en Dr. Michael Kanovsky voor hun hulp bij het bewerken. Dit project is gefinancierd door de Israel Science Foundation-subsidie (nr. 526/18 O.P.), het Alex U. Soyka-programma en een subsidie van het Israel Cancer Research Fund (Research Career Development Award).
Materials
| Reagent or Resource | |||
| 70 µm nylon mesh | Corning | cat##431751 | |
| BSA | Sigma Aldrich | cat# A7906 | |
| Collagenase P | Roche | cat# 11213857001 | |
| Critical Commercial Assay | |||
| DAPI | Sigma Aldrich | cat#MBD0015 | |
| Dnase I | Roche | cat# 10104159001 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Fetal Bovine Serum South American | ThermoFisher | Cat#10270106 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Biological industries | cat#02-018-1A | |
| KRASLSL-G12D mice | Jackson Laboratory | JAX008179 | |
| MACS dead cells removal kit | Milteny Biotec | cat#130-090-101 | |
| PBS | Biological industries | cat#02-023-1A | |
| Ptf1a-CreER mice | Jackson Laboratory | JAX019378 | |
| Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX007908 | |
| Trypsin C-EDTA 0.05% | Biological industries | cat# 03-053-1A | |
| Trypsin inhibitor | Roche | cat#T6522 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Peng, J., et al. Author correction: single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Research. 29 (9), 777 (2019).
- Hruban, R. H., Wilentz, R. E., Kern, S. E. Genetic progression in the pancreatic ducts. The American Journal of Pathology. 156 (6), 1821-1825 (2000).
- Schlesinger, Y., et al. Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells’ heterogeneity. Nature Communications. 11 (1), 4516 (2020).
- Kolodkin-Gal, D., et al. Senolytic elimination of Cox2-expressing senescent cells inhibits the growth of premalignant pancreatic lesions. Gut. 71 (2), 345-355 (2021).
- Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
- Elyada, E., et al. Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts. Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).
- Bernard, V., et al. Single-cell transcriptomics of pancreatic cancer precursors demonstrates epithelial and microenvironmental heterogeneity as an early event in neoplastic progression. Clinical Cancer Research. 25 (7), 2194-2205 (2019).
- Moncada, R., et al. Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas. Nature Biotechnology. 38 (3), 333-342 (2020).
- Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptome profiling of pancreatic cancer identifies multicellular dynamics associated with neoadjuvant treatment. Nature Genetics. 54 (8), 1178-1191 (2022).
- Cui Zhou, D., et al. Spatially restricted drivers and transitional cell populations cooperate with the microenvironment in untreated and chemo-resistant pancreatic cancer. Nature Genetics. 54 (9), 1390-1405 (2022).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
