Summary
Pancreas metaplastiske celler er forløbere for maligne celler, der giver anledning til bugspytkirteltumorer. Imidlertid er isolering af intakte levedygtige bugspytkirtelceller udfordrende. Her præsenterer vi en effektiv metode til dissociation af bugspytkirtelvæv. Cellerne kan derefter bruges til enkeltcelle RNA-sekventering (scRNA-seq) eller til to- eller tredimensionel co-kultur.
Abstract
Bugspytkirtlen omfatter to hovedsystemer: det endokrine system, der producerer og udskiller hormoner, og det eksokrine system, der tegner sig for ca. 90% af bugspytkirtlen og omfatter celler, der producerer og udskiller fordøjelsesenzymer. Fordøjelsesenzymerne produceres i acinarcellerne i bugspytkirtlen, opbevares i vesikler kaldet zymogener og frigives derefter i tolvfingertarmen via bugspytkirtelkanalen for at indlede metaboliske processer. De enzymer, der produceres af acinarcellerne, kan dræbe celler eller nedbryde cellefrit RNA. Derudover er acinarceller skrøbelige, og almindelige dissociationsprotokoller resulterer i et stort antal døde celler og cellefrie proteaser og RNaser. Derfor er en af de største udfordringer i fordøjelsen af bugspytkirtelvæv at genvinde intakte og levedygtige celler, især acinarceller. Protokollen, der præsenteres i denne artikel, viser en totrinsmetode, som vi udviklede for at imødekomme dette behov. Protokollen kan bruges til at fordøje normal pancreata, pancreata, der omfatter præmaligne læsioner eller bugspytkirteltumorer, der omfatter et stort antal stromale og immunceller.
Introduction
Pancreas ductal adenocarcinom (PDAC) er en af de mest aggressive kræfttyper1. Kliniske beviser understøtter forestillingen om, at PDAC udvikler sig fra eksokrine systemceller, herunder acinarceller, over mange år, drevet af mutationer i KRAS-proto-onkogen2.
Bugspytkirteltumorer omfatter mange forskellige celletyper, og det er blevet påvist, at maligne celler kun tæller for 20% -50% af tumormassen3. Forskellige celletyper interagerer med epitelcellerne, understøtter deres transformation og forbedrer tumordannelse og vækst. Tidlige hændelser forårsager acinar metaplasi, hvilket giver anledning til mikroskopiske læsioner kaldet pancreas intraepitelial neoplasi (PanINs), som i nogle tilfælde kan udvikle sig til PDAC4.
Der er et kritisk behov for at undersøge disse interaktioner og målrette centrale signaler. Enkeltcelle RNA-sekventering (scRNA-seq) er en kraftfuld metode, der afslører genekspression ved en enkeltcelleopløsning og derved sporer de ændringer, som epitelceller gennemgår, hvilket muliggør udforskning af udvikling af kræft i bugspytkirtlen.
Vævsdissektion og fordøjelse til enkeltceller er det første trin i et scRNA-seq-eksperiment. Flere faktorer gør fordøjelsen af bugspytkirtelvæv særligt udfordrende: i) acinarceller tegner sig for mere end 90% af bugspytkirtlen, og acinarceller indeholder store mængder fordøjelsesenzymer, herunder proteaser og RNaser, der reducerer kvaliteten af RNA-baserede biblioteker; ii) acinarceller er meget følsomme og kan lyses, hvis der anvendes standardprotokoller (iii) acinarceller udtrykker et lille antal gener i meget høje niveauer. Derfor, hvis disse celler lyseres under eksperimentet, kan dette forurene den observerede genekspressionsprofil for andre celler; (iv) bugspytkirtelvæv genvundet fra tumorer er desmoplastisk, hvilket gør det svært at dissekere uden at beskadige cellerne. Selvom det er nødvendigt at opretholde høj levedygtighed af alle celletyper, tilføjer det store antal og følsomheden af acinarceller yderligere kompleksitet. Disse faktorer pålægger vanskeligheder med at opnå en enkeltcellesuspension, der er mere end 80% levedygtig og ikke har klumper, som det kræves for scRNA-seq-eksperimenter.
Her udviklede vi en protokol ved hjælp af trypsin C og collagenase P sammen med hyppig vævsovervågning. Dette understøtter dissociation til enkeltceller, samtidig med at der opretholdes høj levedygtighed for at understøtte succesen med scRNA-seq-eksperimenter 5,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den fælles etiske komité (Institutional Animal Care and Use Committee) ved Det Hebraiske Universitet (Jerusalem, Israel) og Hadassah Medical Center (Jerusalem, Israel) godkendte undersøgelsesprotokollen for dyrevelfærd (MD-18-15417-5 "Vævsdynamik i kræft i bugspytkirtlen hos mus"), og protokollen, der præsenteres her, overholdt alle relevante etiske regler for dyreforsøg og forskning. Det hebraiske universitet er en sammenslutning for vurdering og akkreditering af laboratoriedyrpleje internationalt akkrediteret institut.
BEMÆRK: Musens stammebestand #007908, lager #019378 og lager #008179 blev hentet fra Jacksons laboratorium. PRT (Kras+/LSL-G12D; Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato) mus blev skabt ved at krydse ovenstående stammer. Mus fra begge køn, mellem 6 uger og 15 måneder, blev brugt til undersøgelsen. Tamoxifen blev fremstillet ved at opløse pulveret i majsolie. Voksne mus (6-8 uger, hunner og hanner) blev injiceret subkutant med tamoxifen på dag 0 og 2 i en dosis på 400 mg/kg og undersøgt to gange om ugen efter injektionen. Det var ikke muligt at måle tumorer, da de var internt placeret; Derfor blev eutanasi udført, hvis unormale kliniske tegn blev observeret i henhold til den etiske protokol. Mus blev aflivet på forskellige tidspunkter efter tamoxifeninduktion ved hjælp af isofluran og cervikal dislokation.
1. Dissektion af bugspytkirtlen
BEMÆRK: For optimalt udbytte under ekstraktion og for at sikre god cellelevedygtighed er hurtig dissektion kritisk. For at forkorte den tid, der kræves til isolering af bugspytkirtlen, skal alle instrumenter og udstyr være klar på is, før musen aflives.
- Aflive musen ved CO2 kvælning og kontroller ved hjælp af cervikal dislokation. Fra dette trin skal alle procedurer udføres med sterile dissekeringsinstrumenter.
- Fastgør musen og sprøjt maven med 70% ethanol. Lav et V-formet snit på 2,5 cm i kønsområdet med saks og tang og fortsæt opad for at åbne bukhulen helt.
- Find maven på venstre side af musen. Find bugspytkirtlen, som er nær milten. Adskil bugspytkirtlen fra maven og tolvfingertarmen ved hjælp af to tang (uden at rive). Fortsæt og adskil bugspytkirtlen fra tyndtarmen, jejunum og ileum.
- Flyt bugspytkirtlen til højre side af musen. Adskil de resterende forbindelser mellem bugspytkirtlen og brysthulen med tang for helt at løsne bugspytkirtlen og fastgjort milt.
- Fjern bugspytkirtlen og spred den ud til undersøgelse i en petriskål på is.
BEMÆRK: Der skal udvises forsigtighed under dette trin for kun at fjerne bugspytkirtlen og ikke fjerne mesenterisk fedtvæv eller andet tilstødende væv sammen med bugspytkirtlen for at undgå cellulær kontaminering.
2. Enzymatisk og mekanisk dissociation af bugspytkirtlen
- Forbered følgende buffere på forhånd.
- Dissociationsbuffer 1: 4 ml trypsin C + 6 ml fosfatbufret saltvand (PBS) (se tabel 1) for hver prøve.
- Dissociationsbuffer 2: 9 ml Hanks′ afbalanceret saltopløsning (HBSS) 1x; 4% bovin serumalbumin (BSA); 1 ml kollagenase P (10 mg/ml); 200 μL trypsinhæmmer (10 mg/ml); og 200 μL DNase I (10 mg/ml) (se tabel 1).
- Vaskebuffer: 50 ml HBSS 1x; 2 g BSA; 1 ml trypsinhæmmer (10 mg/ml); og 1 ml DNase 1 (10 mg/ml).
- Opløsning af enzymaktivitetsstop: HBSS 1x indeholdende 5% føtalt bovint serum (FBS) og 150 g DNase I (0,2 mg/ml).
- Placer bugspytkirtlen i et 50 ml rør på is. Skyl bugspytkirtlen i 10% FBS i HBSS 1x. Fedtvævet vil flyde, og bugspytkirtlen vil synke. Dette er en nem måde at visualisere og hurtigt fjerne det forurenende hvide fedtvæv, der stadig er fastgjort til bugspytkirtlen.
- Overfør musens bugspytkirtelvæv til en steril petriskål indeholdende 5 ml HBSS 1x på is. Skær bugspytkirtlen i små stykker på 1 til 3 mm3 ved hjælp af Noyes saks og en skalpel (figur 2A). I tilfælde af mere end én prøve skal prøverne opbevares på is i 10% FBS/HBSS 1x.
- Overfør vævene til et centrifugerør. Der centrifugeres ved 350 x g ved 4 °C i 5 min. Supernatanten suges til og kasseres for at fjerne cellefragmenter og blodlegemer.
- Resuspender stykkerne i dissociationsbuffer 1 indeholdende 0,02% trypsin C-0,05% EDTA i 10 minutter ved 37 °C med omrøring (180 omdr./min.). Vask straks med 10% FBS/Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM). Der centrifugeres i 5 minutter ved 350 g ved 4 °C.
- Pelletsen opslæmmes igen i 10 ml vaskebuffer og centrifugeres ved 350 x g i 5 minutter ved 4 °C før næste dissociationstrin.
- Bugspytkirtlen inkuberes i dissociationsbuffer 2 i 15 minutter ved 37 °C med omrystning (180 omdr./min.).
- Efter 15 minutter udføres mekanisk dissociation ved kraftigt at pipettere bugspytkirtelfragmenterne op og ned i sterile pipetter af faldende størrelse (25, 10 og 5 ml serologiske pipetter) 10 gange og bringes tilbage til 37 °C.
- Efter yderligere 5 minutter gentages den mekaniske dissociation, og der anvendes lysmikroskopi til at overvåge dissociationen i henhold til mængden af enkeltcellesuspension. Normalt hvis mindre end 90% af suspensionen på dette stadium består af isolerede enkeltceller, er der behov for en længere inkubationstid. Brug trypanblå til at overvåge cellens levedygtighed.
- Fortsæt med inkubationen og tag prøver for at detektere dissociationen hvert 5. minut.
BEMÆRK: Den samlede inkubationstid afhænger af vævet og kan variere mellem prøverne. Inkubationen og vævsdissociationen bør ophøre, når 90% af cellerne er adskilt i enkeltceller, eller når der påvises en reduktion i levedygtigheden.
- Når bugspytkirtelvævet er godt dissocieret (svarende til bugspytkirtelfragmenternes forsvinden og opløsningens stigende turbiditet) (figur 2), standses den enzymatiske reaktion ved vask to gange med enzymaktivitetsstopopløsningen i 5 minutter ved 4 °C. Fra dette trin skal du holde cellesuspensionen på is.
- Før cellesuspensionen gennem et 70 μm nylonnet og kontroller cellelevedygtigheden under mikroskopet. Mindre størrelser nylonnet kan reducere cellelevedygtigheden.
- Resuspender og vask pillen med 5-10 ml iskold bufret vaskeopløsning. Tæl cellerne.
- Hvis der observeres flere røde blodlegemer, skal cellerne behandles med en lysbuffer for røde blodlegemer i 2 minutter ved stuetemperatur. I tilfælde, hvor der observeres klumper, skal prøven behandles igen med trypsin som beskrevet i trin 2.5. Levedygtighed påvises med trypanblåt under mikroskopet, og hvis levedygtigheden er mindre end 80%, skal levende celler isoleres ved hjælp af MACS-fjernelsessættet (Magnetic-aktiveret cellesortering) med MACS MS-kolonner (se tabel 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I et nyligt offentliggjort arbejde5 anvendte vi protokollen beskrevet ovenfor til at udforske de tidlige stadier af PDAC-udvikling ved hjælp af en musemodel. Musen blev genetisk manipuleret til at omfatte kassetterne Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato 7, som tillader ekspression af konstitutivt aktiv KRAS i acinarceller efter tamoxifeninjektion.
Efter cervikal dislokation (ifølge musens etiske protokol) blev bugspytkirtlen resekteret, og protokollen beskrevet ovenfor blev anvendt (se figur 1 og protokol).
For at optimere dissociationsprotokollen blev dissociationen udført med eller uden præinkubation af vævet med trypsin C. Det blev konstateret, at præinkubation med trypsin C fremskyndede dissociationen uden at påvirke levedygtigheden. Derudover blev forskellige collagenaser, herunder collagenase D, collagenase 1a og collagenase P, forsøgt (se tabel 1). Det blev konstateret, at brug af collagenase D resulterede i massiv celledød, og faktisk i andre undersøgelser, der brugte denne collagenase, var fraktionen af acinarceller meget lille8. Brugen af collagenase 1a gav heller ikke de forventede resultater, da vævet selv efter en 90 minutters inkubation med collagenase 1a ikke blev dissocieret. Kun collagenase P tillod os at adskille vævet og opretholde høj levedygtighed af alle celletyperne.
Disse eksperimenter blev gentaget på syv forskellige tidspunkter post-tamoxifen injektion. Samtidig med acinar-til-duktal metaplasi og PanIN-læsionsdannelse var der en ophobning af stromale og immunceller, herunder fibroblaster, og vævet blev desmoplastisk og stift. De forskellige tidspunkter efter tamoxifeninjektion gjorde det muligt for os at undersøge protokollen under flere forskellige vævstilstande og måle genopretningen af epitel-, stromale og immunceller.
Et foto af en mus er vist i figur 2A, og den isolerede bugspytkirtel, et fluffy væv, er vist i figur 2C. Den røde farve af vævet skyldes ekspressionen af tdTomat i acinarcellerne. Protokollen blev anvendt med succes med alle vævstilstande og med humane prøver. Imidlertid kan inkubationstider med trypsin og kollagenase variere. Det er derfor vigtigt at overvåge prøven og observere dissociationen af vævet og cellelevedygtigheden hvert par minutter under mikroskopet. På et tidligt stadium af dissociationsprotokollen var der et lavt antal isolerede celler og et stort antal klumper (figur 2D, venstre). Vores mål var at opnå isolerede levedygtige celler, som vist i figur 2D, midten, og undgå en reduktion i antallet af levedygtige celler (figur 2D, højre).
Det er vigtigt at bemærke, at længere inkubationstider reducerede cellernes levedygtighed. Fra et væv 0,5 x 10 cm3 i størrelse genvandt vi i alt 5 x 106 celler, hvoraf 5 x 105 var tdTomat-positive celler. Ifølge analysen af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) i figur 3 understøtter vores protokol til dissociation af bugspytkirtlen genopretning af flere celletyper, herunder acinarceller, duktale celler, endotelceller, fibroblaster, immunceller og pericytter med høj levedygtighed. Imidlertid kan det faktiske forhold mellem antallet af celler fra hver type i vævet før dissociation være anderledes, udledt af fluorescensbillederne af frosne sektioner i bugspytkirtlen, der inkluderer tdTomat-positive celler (figur 2E). Den høje levedygtighed, der opnås ved hjælp af protokollen beskrevet ovenfor, vises ved FACS-analysen (figur 3) og tællingen af levende celler / døde celler udført ved hjælp af et hæmocytometer (figur 3H).
For hver prøve udførte vi scRNA-seq, og i overensstemmelse med FACS-analysen bekræftede vi påvisningen af alle ovennævnte celletyper (figur 4A, B) i hvert af de resekterede væv fra alle tidspunkter efter tamoxifeninjektion. Vi undersøgte også ekspressionen af carboxypeptidase 1 (Cpa1), som koder for carboxypeptidase1. Cpa1-ekspression i acinarceller er ekstremt høj og kan indikere, i hvilket omfang acinarceller blev lyseret under dissociationen, samt i hvilket omfang de har forurenet transkriptomet af andre celletyper. Vi påviste minimal forurening, som det fremgår af figur 4C,D. Den blide dissociation resulterer også i høj levedygtighed, der giver os mulighed for at følge op med cellesortering af ønskede celletyper til yderligere eksperimenter (figur 3).
Sammen understøtter kvaliteten af dissociationsprotokollen forskellige opfølgningseksperimenter, herunder scRNA-seq.
Figur 1: Skema af protokollen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Isolering af bugspytkirtelceller. (A) Et foto, der viser bugspytkirtlen (i rødt), lever og milt på musen efter helt åbning af bughulen. B) Den samme mus som i litra A) efter fjernelse af bugspytkirtlen. (C) Dissektion af bugspytkirtlen. Bugspytkirtlen efter fjernelse fra dyret (venstre). Bugspytkirtlen efter spaltninger i små stykker (midten). Faseadskillelse efter centrifugering (højre). D) Overvågning af cellerne under mikroskop for at undersøge enkeltcellens levedygtighed. Total primær isolering af bugspytkirtelceller (20x). Klumper af celler efter 15 minutters enzymatisk reaktion (venstre). Enkeltcellesuspension efter 25 minutters enzymatisk reaktion (midten). Reduceret cellelevedygtighed efter en lang inkubation (højre). E) Fluorescensbilleder af en frossen bugspytkirtelsektion. Acinarceller er tdTomat positive; DAPI-farvning i blåt (foto ved 40x). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: FACS-analyse af encellede suspension af kræft i bugspytkirtlen . (A) tdTomatpositive og negative celler. (B) Flowcytometri af usorterede (røde) versus sorterede (blå) acinarceller. (C,F) Ufarvede celler, APC og PB450. (D) FACS-analyse efter farvning med Anti-CD31, en markør for endotelceller. E) FACS-analyse efter farvning med Anti-CD140b, en markør for pericytter. (G) FACS-analyse efter farvning med Anti-CD11c, en markør for dendritiske celler og makrofager. (H) Forholdet mellem levende celler og døde celler i fire forskellige bugspytkirtelcelleisolationer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Analyse af scRNA-seq-data, der blev produceret ved hjælp af den protokol, som vi beskriver i den aktuelle artikel. (A) UMAP, der viser scRNA-seq af en musebugspytkirtel på forskellige tidspunkter efter tamoxifeninjektion, som angivet i højre side af panelet. (B) Celletyper blev bestemt ud fra kendte markører. (C,D) Celler farves i henhold til ekspressionsniveauet for Cpa1 (i C) eller niveauet af tdTomato (i D). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikel præsenterer vi en protokol for dissociation af bugspytkirtelvæv. Protokollen er enkel, nem at bruge og giver et værktøj til at isolere levedygtige enkeltceller fra bugspytkirtelvæv på forskellige stadier under malignitetsprocessen, herunder solide tumorer. I tidligere undersøgelser blev forskellige typer collagenaser brugt til at fordøje bugspytkirtlen 8,9. Brug af en meget potent collagenase, såsom collagenase D, resulterer i en stor population af immunceller og en lavere procentdel af epitelceller. Anvendelsen af collagenase P tillader fordøjelse i bugspytkirtlen, der er egnet til intakt eller tumor bugspytkirtelvæv.
Baseret på vores observationer kan alle celletyper isoleres. Vi har tidligere valideret infiltrationen af immun T-celler, for eksempel ved hjælp af immunhistokemi5; Vi mener, at det relative celleantal, som vi observerede i vores analyse, er en korrekt tilnærmelse til den faktiske repræsentation af celler i vævet, bortset fra acinarceller, der er skrøbelige og derfor var underrepræsenteret. Vi anbefaler at bruge immunhistokemi eller rumlig transkriptomik10,11,12, hvis der er behov for nøjagtige proportioner af celletyper i vævet. Derudover observerede vi, at dissociation af væv fra vildtypemus i fravær af konstitutivt aktiv KRAS-ekspression er mere udfordrende og kræver hyppigere overvågning for at stoppe den enzymatiske reaktion til tiden ved at tilføje 10% FBS til vaskebufferen og undgå massiv celledød. Dette er også i overensstemmelse med forurening fra nogle meget rigelige acinartranskripter, såsom Cpa1, selvom vores protokol minimerer dette problem.
Celleisolationen kan bruges til scRNA-seq, som vi viste5, til dyrkning af celler eller som udgangsmateriale til f.eks. organoider.
Behovet for frisk væv er en begrænsning af metoden. En alternativ tilgang, der fokuserer på isolering af kerner, enkeltkerne RNA-sekventering (sNuc-seq)13, blev for nylig brugt til at undersøge PDAC-tumorer fra patienter ved en enkeltcelleopløsning11; i fremtiden vil det være interessant at sammenligne datakvaliteten af bugspytkirtelepitelceller, der opnås fra sNuc-seq sammenlignet med scRNA-seq. Det er vigtigt, at kerneekstraktion ikke tillader celledyrkning, og sortering for at berige for specifikke celletyper er ekstremt udfordrende. Derfor vil vævsdissociationsprotokollen være nyttig i fremtiden til scRNA-seq-eksperimenter og til disse yderligere applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Avital Sarusi-Portuguez for hjælp til dataanalyse og Dr. Dror Kolodkin-Gal for hjælp til at etablere protokollen i en tidligere undersøgelse. Vi takker alle tidligere og nuværende medlemmer af Parnas-laboratoriet. Vi takker Dr. Gillian Kay og Dr. Michael Kanovsky for deres hjælp med redigering. Dette projekt har modtaget finansiering fra Israel Science Foundation-bevillingen (nr. 526/18 O.P.), Alex U. Soyka-programmet og et tilskud fra Israel Cancer Research Fund (Research Career Development Award).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent or Resource | |||
| 70 µm nylon mesh | Corning | cat##431751 | |
| BSA | Sigma Aldrich | cat# A7906 | |
| Collagenase P | Roche | cat# 11213857001 | |
| Critical Commercial Assay | |||
| DAPI | Sigma Aldrich | cat#MBD0015 | |
| Dnase I | Roche | cat# 10104159001 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Fetal Bovine Serum South American | ThermoFisher | Cat#10270106 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Biological industries | cat#02-018-1A | |
| KRASLSL-G12D mice | Jackson Laboratory | JAX008179 | |
| MACS dead cells removal kit | Milteny Biotec | cat#130-090-101 | |
| PBS | Biological industries | cat#02-023-1A | |
| Ptf1a-CreER mice | Jackson Laboratory | JAX019378 | |
| Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX007908 | |
| Trypsin C-EDTA 0.05% | Biological industries | cat# 03-053-1A | |
| Trypsin inhibitor | Roche | cat#T6522 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Peng, J., et al. Author correction: single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Research. 29 (9), 777 (2019).
- Hruban, R. H., Wilentz, R. E., Kern, S. E.
- Schlesinger, Y., et al. Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells' heterogeneity. Nature Communications. 11 (1), 4516 (2020).
- Kolodkin-Gal, D., et al. Senolytic elimination of Cox2-expressing senescent cells inhibits the growth of premalignant pancreatic lesions. Gut. 71 (2), 345-355 (2021).
- Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
- Elyada, E., et al. Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts. Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).
- Bernard, V., et al. Single-cell transcriptomics of pancreatic cancer precursors demonstrates epithelial and microenvironmental heterogeneity as an early event in neoplastic progression. Clinical Cancer Research. 25 (7), 2194-2205 (2019).
- Moncada, R., et al. Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas. Nature Biotechnology. 38 (3), 333-342 (2020).
- Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptome profiling of pancreatic cancer identifies multicellular dynamics associated with neoadjuvant treatment. Nature Genetics. 54 (8), 1178-1191 (2022).
- Cui Zhou, D., et al. Spatially restricted drivers and transitional cell populations cooperate with the microenvironment in untreated and chemo-resistant pancreatic cancer. Nature Genetics. 54 (9), 1390-1405 (2022).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
