تشريح أنسجة البنكرياس لعزل الخلايا المفردة القابلة للحياة
Summary
الخلايا النتوءية البنكرياسية هي سلائف للخلايا الخبيثة التي تؤدي إلى أورام البنكرياس. ومع ذلك ، فإن عزل خلايا البنكرياس السليمة القابلة للحياة يمثل تحديا. هنا ، نقدم طريقة فعالة لتفكك أنسجة البنكرياس. يمكن بعد ذلك استخدام الخلايا لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) أو للزراعة المشتركة ثنائية أو ثلاثية الأبعاد.
Abstract
يشتمل البنكرياس على جهازين رئيسيين: جهاز الغدد الصماء، الذي ينتج الهرمونات ويفرزها، والجهاز الخارجي الإفراز، الذي يمثل حوالي 90٪ من البنكرياس، ويشمل الخلايا التي تنتج إنزيمات الهضم وتفرزها. تنتج إنزيمات الهضم في الخلايا العنيبية البنكرياسية، وتخزن في حويصلات تسمى الزيموجينات، ثم تطلق في الاثني عشر عبر قناة البنكرياس لبدء عمليات التمثيل الغذائي. يمكن للإنزيمات التي تنتجها الخلايا العنيبية أن تقتل الخلايا أو تحلل الحمض النووي الريبي الخالي من الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الخلايا العنيبية هشة ، وتؤدي بروتوكولات التفكك الشائعة إلى عدد كبير من الخلايا الميتة والبروتياز و RNases الخالية من الخلايا. لذلك ، فإن أحد أكبر التحديات في هضم أنسجة البنكرياس هو استعادة الخلايا السليمة والقابلة للحياة ، وخاصة الخلايا العنيبة. يوضح البروتوكول المقدم في هذه المقالة طريقة من خطوتين قمنا بتطويرها لتلبية هذه الحاجة. يمكن استخدام البروتوكول لهضم البنكرياس الطبيعي أو البنكرياس الذي يتضمن آفات ما قبل خبيثة أو أورام البنكرياس التي تشمل عددا كبيرا من الخلايا اللحمية والمناعية.
Introduction
يعد سرطان البنكرياس الغدي القنوي (PDAC) أحد أكثر أنواع السرطان عدوانية1. تدعم الأدلة السريرية فكرة أن PDAC يتطور من خلايا نظام الإفراز الخارجي ، بما في ذلك الخلايا العنيبية ، على مدى سنوات عديدة ، مدفوعة بطفرات في الجين الورمي الأولي KRAS2.
تشمل أورام البنكرياس العديد من أنواع الخلايا المختلفة ، وقد ثبت أن الخلايا الخبيثة تمثل 20٪ -50٪ فقط من كتلة الورم3. تتفاعل أنواع الخلايا المختلفة مع الخلايا الظهارية ، وتدعم تحولها ، وتعزز تكوين الورم ونموه. تسبب الأحداث المبكرة حؤول الآسيين ، مما يؤدي إلى آفات مجهرية تسمى ورم البنكرياس داخل الظهارة (PanINs) ، والتي يمكن أن تتطور في بعض الحالات إلى PDAC4.
هناك حاجة ماسة للتحقيق في هذه التفاعلات واستهداف الإشارات المحورية. يعد تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) طريقة قوية تكشف عن التعبير الجيني بدقة خلية واحدة ، وبالتالي تتبع التغييرات التي تمر بها الخلايا الظهارية ، وبالتالي تمكين استكشاف تطور سرطان البنكرياس.
تشريح الأنسجة وهضمها إلى خلايا مفردة هي المرحلة الأولى في تجربة scRNA-seq. هناك عدة عوامل تجعل عملية هضم أنسجة البنكرياس صعبة بشكل خاص: أ) تمثل الخلايا العنيبية أكثر من 90٪ من البنكرياس وتحتوي الخلايا العنيبية على كميات كبيرة من الإنزيمات الهضمية ، بما في ذلك البروتياز و RNases التي تقلل من جودة المكتبات القائمة على الحمض النووي الريبي ؛ (ii) الخلايا العنيبية حساسة للغاية وقد تتحلل إذا تم استخدام البروتوكولات القياسية ؛ (iii) تعبر الخلايا العنيبية عن عدد صغير من الجينات بمستويات عالية جدا. لذلك ، إذا تم تحليل هذه الخلايا أثناء التجربة ، فقد يؤدي ذلك إلى تلويث ملف تعريف التعبير الجيني المرصود للخلايا الأخرى ؛ (IV) أنسجة البنكرياس المستعادة من الأورام هي مادة لاصقة ، مما يجعل من الصعب تشريحها دون إتلاف الخلايا. وبالتالي ، على الرغم من أن الحفاظ على قابلية عالية لجميع أنواع الخلايا أمر مطلوب ، إلا أن العدد الكبير وحساسية الخلايا العنيبية يضيفان تعقيدا إضافيا. تفرض هذه العوامل صعوبات في تحقيق تعليق أحادي الخلية قابل للتطبيق بنسبة تزيد عن 80٪ ولا يحتوي على كتل ، كما هو مطلوب لتجارب scRNA-seq.
هنا ، قمنا بتطوير بروتوكول باستخدام التربسين C وكولاجيناز P ، جنبا إلى جنب مع المراقبة المتكررة للأنسجة. هذا يدعم التفكك إلى خلايا مفردة مع الحفاظ على قابلية عالية لدعم نجاح تجارب scRNA-seq 5,6.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المقالة ، نقدم بروتوكولا لتفكك أنسجة البنكرياس. البروتوكول بسيط وسهل الاستخدام ويوفر أداة لعزل الخلايا المفردة القابلة للحياة من أنسجة البنكرياس في مراحل مختلفة أثناء عملية الورم الخبيث ، بما في ذلك الأورام الصلبة. في الدراسات السابقة ، تم استخدام أنواع مختلفة من الكولاجين لهضم ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر الدكتور أفيتال ساروسي بورتوغيز للمساعدة في تحليل البيانات والدكتور درور كولودكين غال للمساعدة في إنشاء البروتوكول في دراسة سابقة. نشكر جميع الأعضاء السابقين والحاليين في مختبر بارناس. نشكر الدكتورة جيليان كاي والدكتور مايكل كانوفسكي على مساعدتهما في التحرير. حصل هذا المشروع على تمويل من منحة مؤسسة العلوم الإسرائيلية (رقم 526/18 O.P.) ، وبرنامج Alex U. Soyka ، ومنحة من صندوق أبحاث السرطان الإسرائيلي (جائزة التطوير الوظيفي البحثي).
Materials
| Reagent or Resource | |||
| 70 µm nylon mesh | Corning | cat##431751 | |
| BSA | Sigma Aldrich | cat# A7906 | |
| Collagenase P | Roche | cat# 11213857001 | |
| Critical Commercial Assay | |||
| DAPI | Sigma Aldrich | cat#MBD0015 | |
| Dnase I | Roche | cat# 10104159001 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Fetal Bovine Serum South American | ThermoFisher | Cat#10270106 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Biological industries | cat#02-018-1A | |
| KRASLSL-G12D mice | Jackson Laboratory | JAX008179 | |
| MACS dead cells removal kit | Milteny Biotec | cat#130-090-101 | |
| PBS | Biological industries | cat#02-023-1A | |
| Ptf1a-CreER mice | Jackson Laboratory | JAX019378 | |
| Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX007908 | |
| Trypsin C-EDTA 0.05% | Biological industries | cat# 03-053-1A | |
| Trypsin inhibitor | Roche | cat#T6522 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Peng, J., et al. Author correction: single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Research. 29 (9), 777 (2019).
- Hruban, R. H., Wilentz, R. E., Kern, S. E. Genetic progression in the pancreatic ducts. The American Journal of Pathology. 156 (6), 1821-1825 (2000).
- Schlesinger, Y., et al. Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells’ heterogeneity. Nature Communications. 11 (1), 4516 (2020).
- Kolodkin-Gal, D., et al. Senolytic elimination of Cox2-expressing senescent cells inhibits the growth of premalignant pancreatic lesions. Gut. 71 (2), 345-355 (2021).
- Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
- Elyada, E., et al. Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts. Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).
- Bernard, V., et al. Single-cell transcriptomics of pancreatic cancer precursors demonstrates epithelial and microenvironmental heterogeneity as an early event in neoplastic progression. Clinical Cancer Research. 25 (7), 2194-2205 (2019).
- Moncada, R., et al. Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas. Nature Biotechnology. 38 (3), 333-342 (2020).
- Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptome profiling of pancreatic cancer identifies multicellular dynamics associated with neoadjuvant treatment. Nature Genetics. 54 (8), 1178-1191 (2022).
- Cui Zhou, D., et al. Spatially restricted drivers and transitional cell populations cooperate with the microenvironment in untreated and chemo-resistant pancreatic cancer. Nature Genetics. 54 (9), 1390-1405 (2022).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
