Summary
अग्नाशयी मेटाप्लास्टिक कोशिकाएं घातक कोशिकाओं के अग्रदूत हैं जो अग्नाशय के ट्यूमर को जन्म देती हैं। हालांकि, बरकरार व्यवहार्य अग्नाशय ी कोशिकाओं को अलग करना चुनौतीपूर्ण है। यहां, हम अग्नाशय के ऊतक पृथक्करण के लिए एक कुशल विधि प्रस्तुत करते हैं। कोशिकाओं का उपयोग एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण (एससीआरएनए-सेक) या दो या तीन-आयामी सह-संवर्धन के लिए किया जा सकता है।
Abstract
अग्न्याशय में दो प्रमुख प्रणालियां शामिल हैं: अंतःस्रावी तंत्र, जो हार्मोन का उत्पादन और स्राव करता है, और एक्सोक्राइन सिस्टम, जो अग्न्याशय के लगभग 90% के लिए जिम्मेदार है और इसमें कोशिकाएं शामिल हैं जो पाचन एंजाइमों का उत्पादन और स्राव करती हैं। पाचन एंजाइमअग्नाशयी एसिनार कोशिकाओं में निर्मित होते हैं, जो जाइमोजेन्स नामक पुटिकाओं में संग्रहीत होते हैं, और फिर चयापचय प्रक्रियाओं को शुरू करने के लिए अग्नाशय वाहिनी के माध्यम से ग्रहणी में जारी किए जाते हैं। Acinar कोशिकाओं द्वारा उत्पादित एंजाइम कोशिकाओं को मार सकते हैं या सेल-मुक्त आरएनए को नीचा दिखा सकते हैं। इसके अलावा, एसिनार कोशिकाएं नाजुक होती हैं, और सामान्य पृथक्करण प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप बड़ी संख्या में मृत कोशिकाएं और सेल-मुक्त प्रोटीज और आरएनएस होते हैं। इसलिए, अग्नाशय के ऊतकों के पाचन में सबसे बड़ी चुनौतियों में से एक बरकरार और व्यवहार्य कोशिकाओं, विशेष रूप से एसिनार कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करना है। इस आलेख में प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक दो-चरणीय विधि दिखाता है जिसे हमने इस आवश्यकता को पूरा करने के लिए विकसित किया है। प्रोटोकॉल का उपयोग सामान्य अग्नाशय, अग्नाशय को पचाने के लिए किया जा सकता है जिसमें पूर्व-घातक घाव, या अग्नाशय के ट्यूमर शामिल हैं जिनमें बड़ी संख्या में स्ट्रोमल और प्रतिरक्षा कोशिकाएं शामिल हैं।
Introduction
अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी) सबसे आक्रामककैंसर प्रकारों में से एक है। नैदानिक साक्ष्य इस धारणा का समर्थन करते हैं कि पीडीएसी एक्सोक्राइन-सिस्टम कोशिकाओं से विकसित होता है, जिसमें एसिनार कोशिकाएं शामिल हैं, जो कई वर्षों से केआरएएस प्रोटो-ऑन्कोजीन2 में उत्परिवर्तन से प्रेरित हैं।
अग्नाशय के ट्यूमर में कई अलग-अलग सेल प्रकार शामिल हैं, और यह प्रदर्शित किया गया है कि घातक कोशिकाएं ट्यूमर द्रव्यमान3 के केवल 20% -50% के लिए गिनती करती हैं। विभिन्न सेल प्रकार उपकला कोशिकाओं के साथ बातचीत करते हैं, उनके परिवर्तन का समर्थन करते हैं, और ट्यूमर के गठन और विकास को बढ़ाते हैं। प्रारंभिक घटनाएं एसिनार मेटाप्लासिया का कारण बनती हैं, जो अग्नाशयी इंट्राएपिथेलियल नियोप्लासिया (पैनआईएन) नामक सूक्ष्म घावों को जन्म देती हैं, जो कुछ मामलों में पीडीएसी4 में विकसित हो सकती हैं।
इन इंटरैक्शन की जांच करने और निर्णायक संकेतों को लक्षित करने की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है। एकल-कोशिका आरएनए-अनुक्रमण (एससीआरएनए-सेक) एक शक्तिशाली विधि है जो एकल-कोशिका संकल्प पर जीन अभिव्यक्ति को प्रकट करती है, जिससे उपकला कोशिकाओं से गुजरने वाले परिवर्तनों को ट्रैक किया जाता है, इस प्रकार अग्नाशय के कैंसर के विकास की खोज को सक्षम किया जाता है।
एकल कोशिकाओं के लिए ऊतक विच्छेदन और पाचन एक एससीआरएनए-सेक प्रयोग में पहला चरण है। कई कारक अग्नाशय के ऊतकों के पाचन को विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण बनाते हैं: i) Acinar कोशिकाएं अग्न्याशय के 90% से अधिक के लिए होती हैं और Acinar कोशिकाओं में बड़ी मात्रा में पाचन एंजाइम होते हैं, जिनमें प्रोटीज और RNase शामिल हैं जो आरएनए-आधारित पुस्तकालयों की गुणवत्ता को कम करते हैं; (ii) एसिनार कोशिकाएं बहुत संवेदनशील होती हैं और यदि मानक प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाता है तो वे निष्क्रिय हो सकती हैं; (iii) Acinar कोशिकाएं बहुत उच्च स्तर पर जीन ों की एक छोटी संख्या व्यक्त करती हैं। इसलिए, यदि प्रयोग के दौरान इन कोशिकाओं को निष्क्रिय किया जाता है, तो यह अन्य कोशिकाओं के देखे गए जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल को दूषित कर सकता है; (iv) ट्यूमर से बरामद अग्नाशय ी ऊतक डेस्मोप्लास्टिक है, जिससे कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाए बिना विच्छेदन करना मुश्किल हो जाता है। इस प्रकार, भले ही सभी सेल प्रकारों की उच्च व्यवहार्यता बनाए रखने की आवश्यकता होती है, लेकिन एसिनार कोशिकाओं की बड़ी संख्या और संवेदनशीलता अतिरिक्त जटिलता जोड़ती है। ये कारक एकल-सेल निलंबन को प्राप्त करने में कठिनाइयों को लागू करते हैं जो 80% से अधिक व्यवहार्य है और इसमें कोई क्लंप नहीं है, जैसा कि एससीआरएनए-सेक प्रयोगों के लिए आवश्यक है।
यहां, हमने लगातार ऊतक निगरानी के साथ-साथ ट्रिप्सिन सी और कोलेजनेस पी का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल विकसित किया। यह एससीआरएनए-सेक प्रयोगों 5,6 की सफलता का समर्थन करने के लिए उच्च व्यवहार्यता बनाए रखते हुए एकल कोशिकाओं के पृथक्करण का समर्थन करता है।
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Protocol
हिब्रू विश्वविद्यालय (यरूशलेम, इज़राइल) और हदासाह मेडिकल सेंटर (यरूशलेम, इज़राइल) की संयुक्त नैतिकता समिति (संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति) ने पशु कल्याण के लिए अध्ययन प्रोटोकॉल (एमडी-18-15417-5 "चूहों में अग्नाशय के कैंसर में ऊतक गतिशीलता") को मंजूरी दे दी, और यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल पशु परीक्षण और अनुसंधान के लिए सभी प्रासंगिक नैतिक नियमों का अनुपालन करता है। हिब्रू विश्वविद्यालय प्रयोगशाला पशु देखभाल अंतर्राष्ट्रीय-मान्यता प्राप्त संस्थान के मूल्यांकन और मान्यता के लिए एक संघ है।
नोट: माउस स्ट्रेन स्टॉक # 007908, स्टॉक # 019378, और स्टॉक # 008179 जैक्सन की प्रयोगशाला से प्राप्त किए गए थे। पीआरटी (क्रास +/एलएसएल-जी 12 डी; पीटीएफ 1 ए-सीआरईईआर; रोजा 26एलएसएल-टीडी टमाटर) चूहों को उपरोक्त उपभेदों को पार करके बनाया गया था। अध्ययन के लिए 6 सप्ताह से 15 महीने की उम्र के बीच दोनों लिंगों के चूहों का उपयोग किया गया था। मकई के तेल में पाउडर घोलकर टैमोक्सीफेन तैयार किया गया था। वयस्क चूहों (6-8 सप्ताह की आयु, महिलाओं और पुरुषों) को 400 मिलीग्राम / किग्रा की खुराक पर 0 और 2 दिनों में टैमोक्सीफेन के साथ इंजेक्शन दिया गया था और इंजेक्शन के बाद सप्ताह में दो बार जांच की गई थी। ट्यूमर को मापना संभव नहीं था क्योंकि वे आंतरिक रूप से स्थित थे; इसलिए, नैतिक प्रोटोकॉल के अनुसार असामान्य नैदानिक संकेत देखे जाने पर इच्छामृत्यु की गई थी। चूहों को आइसोफ्लुरेन और ग्रीवा अव्यवस्था का उपयोग करके टैमोक्सीफेन प्रेरण के बाद अलग-अलग समय बिंदुओं पर इच्छामृत्यु दी गई थी।
1. अग्नाशय विच्छेदन
नोट: निष्कर्षण के दौरान इष्टतम उपज के लिए और अच्छी सेल व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए, तेजी से विच्छेदन महत्वपूर्ण है। अग्न्याशय अलगाव के लिए आवश्यक समय को कम करने के लिए, माउस को यूथेनाइज़ करने से पहले सभी उपकरणों और उपकरणों को बर्फ पर तैयार होना चाहिए।
- सीओ2 श्वासावरोध द्वारा माउस को इच्छामृत्यु करें और ग्रीवा अव्यवस्था का उपयोग करके सत्यापित करें। इस कदम से, सभी प्रक्रियाओं को बाँझ विच्छेदन उपकरणों के साथ किया जाना चाहिए।
- माउस को ठीक करें और पेट को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें। कैंची और बल के साथ जननांग क्षेत्र में 2.5 सेमी का वी-आकार का चीरा लगाएं और पेट की गुहा को पूरी तरह से खोलने के लिए ऊपर की ओर बढ़ें।
- माउस के बाईं ओर पेट का पता लगाएं। अग्न्याशय का पता लगाएं, जो प्लीहा के पास है। अग्न्याशय को पेट और ग्रहणी से दो बल (बिना फाड़े के) का उपयोग करके अलग करें। अग्न्याशय को छोटी आंत, जेजुनम और इलियम से जारी रखें और अलग करें।
- अग्न्याशय को माउस के दाईं ओर ले जाएं। अग्न्याशय और संलग्न प्लीहा को पूरी तरह से अलग करने के लिए अग्न्याशय और वक्ष गुहा के बीच शेष कनेक्शन को अलग करें।
- अग्न्याशय को हटा दें और इसे बर्फ पर पेट्री डिश में परीक्षा के लिए फैलाएं।
नोट: सेलुलर संदूषण से बचने के लिए, केवल अग्न्याशय को हटाने के लिए इस चरण के दौरान देखभाल की जानी चाहिए, और अग्न्याशय के साथ मेसेंटेरिक वसा ऊतक या अन्य आसन्न ऊतक को नहीं हटाया जाना चाहिए।
2. अग्न्याशय का एंजाइमेटिक और यांत्रिक पृथक्करण
- पहले से निम्नलिखित बफर तैयार करें।
- पृथक्करण बफर 1: प्रत्येक नमूने के लिए ट्रिप्सिन सी के 4 एमएल + फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के 6 एमएल ( तालिका 1 देखें)।
- पृथक्करण बफर 2: 9 एमएल हैंक्स संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) 1 एक्स; 4% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए); 1 एमएल कोलेजनेस पी (10 मिलीग्राम / एमएल); ट्रिप्सिन अवरोधक के 200 μL (10 मिलीग्राम / और DNase I (10 mg/mL) के 200 μL ( तालिका 1 देखें)।
- वॉश बफर: HBSS 1x का 50 मिलीलीटर; बीएसए के 2 ग्राम; ट्रिप्सिन अवरोधक का 1 एमएल (10 मिलीग्राम / एमएल); और DNase 1 (10 मिलीग्राम / एमएल) के 1 मिलीलीटर।
- एंजाइम गतिविधि स्टॉप समाधान: एचबीएसएस 1 एक्स जिसमें 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 150 ग्राम डीनेस आई (0.2 मिलीग्राम / एमएल) होता है।
- अग्न्याशय को बर्फ पर 50 एमएल ट्यूब में रखें। एचबीएसएस 1 एक्स में 10% एफबीएस में अग्न्याशय को कुल्ला करें। वसायुक्त ऊतक तैरजाएगा और अग्न्याशय डूब जाएगा। यह अग्न्याशय से जुड़े दूषित सफेद वसा ऊतक को देखने और जल्दी से हटाने का एक आसान तरीका है।
- माउस अग्नाशय के ऊतकों को एक बाँझ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें बर्फ पर 5 मिलीलीटर एचबीएसएस 1 एक्स होता है। नोयस कैंची और स्केलपेल (चित्रा 2 ए) का उपयोग करके अग्न्याशय को 1 से 3 मिमी3 के छोटे टुकड़ों में काटें। एक से अधिक नमूने के मामले में, नमूने को 10% एफबीएस / एचबीएसएस 1 एक्स में बर्फ पर रखा जाना चाहिए।
- ऊतकों को सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 350 x g पर सेंट्रीफ्यूज। कोशिका के टुकड़े और रक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट और त्याग दें।
- 0.02% ट्रिप्सिन सी -0.05% ईडीटीए युक्त पृथक्करण बफर 1 में टुकड़ों को आंदोलन (180 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए फिर से निलंबित करें। डलबेकको के संशोधित ईगल ्स मीडियम (डीएमईएम) से तुरंत धो लें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 350 ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
- अगले पृथक्करण चरण से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 350 x g पर 350 x g पर 350 x g पर गोली को निलंबित करके फिर से धो लें।
- अग्न्याशय को 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए आंदोलन (180 आरपीएम) के साथ पृथक्करण बफर 2 में इनक्यूबेट करें।
- 15 मिनट के बाद, घटते आकार (25, 10, और 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट) के बाँझ पिपेट में अग्नाशय के टुकड़ों को 10 बार ऊपर और नीचे करके यांत्रिक पृथक्करण करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर वापस लाएं।
- अतिरिक्त 5 मिनट के बाद, यांत्रिक पृथक्करण को दोहराएं और एकल-सेल निलंबन की मात्रा के अनुसार पृथक्करण की निगरानी के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें। आमतौर पर यदि इस स्तर पर, निलंबन के 90% से कम में पृथक एकल कोशिकाएं होती हैं, तो लंबे समय इनक्यूबेशन समय की आवश्यकता होती है। सेल व्यवहार्यता की निगरानी के लिए ट्राइपैन ब्लू का उपयोग करें।
- इनक्यूबेशन के साथ जारी रखें और हर 5 मिनट में पृथक्करण का पता लगाने के लिए नमूने लें।
नोट: कुल इनक्यूबेशन समय ऊतक पर निर्भर करता है और नमूनों के बीच भिन्न हो सकता है। इनक्यूबेशन और ऊतक पृथक्करण तब समाप्त होना चाहिए जब 90% कोशिकाओं को एकल कोशिकाओं में अलग किया जाता है या जब व्यवहार्यता में कमी का पता चलता है।
- अग्नाशय के ऊतकों को अच्छी तरह से अलग करने के बाद (अग्नाशय के टुकड़ों के गायब होने और समाधान की बढ़ती टर्बिडिटी के अनुरूप) (चित्रा 2), एंजाइम गतिविधि स्टॉप घोल के साथ दो बार धोकर एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए रोक दें। इस चरण से, सेल निलंबन को बर्फ पर रखें।
- सेल निलंबन को 70μm नायलॉन जाल के माध्यम से पारित करें और माइक्रोस्कोप के तहत सेल व्यवहार्यता की जांच करें। नायलॉन जाल के छोटे आकार सेल व्यवहार्यता को कम कर सकते हैं।
- 5-10 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा बफर वॉश घोल के साथ गोली को फिर से निलंबित करें और धो लें। कोशिकाओं की गिनती करें।
- यदि कई लाल रक्त कोशिकाएं देखी जाती हैं, तो कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर के साथ कोशिकाओं का इलाज करें। ऐसे मामलों में जहां झुरमुट देखे जाते हैं, नमूने को ट्रिप्सिन के साथ फिर से इलाज किया जाना चाहिए, जैसा कि चरण 2.5 में वर्णित है। माइक्रोस्कोप के तहत ट्राइपैन ब्लू के साथ व्यवहार्यता का पता लगाया जाता है, और यदि व्यवहार्यता 80% से कम है, तो एमएसीएस एमएस कॉलम के साथ चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) मृत कोशिकाओं को हटाने वाली किट का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं को अलग किया जाना चाहिए ( तालिका 1 देखें)।
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Representative Results
हाल ही में प्रकाशित कार्य5 में, हमने माउस मॉडल का उपयोग करके पीडीएसी विकास के शुरुआती चरणों का पता लगाने के लिए ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल लागू किया। माउस को आनुवंशिक रूप से कैसेट पीटीएफ 1 ए-सीआरईआर, एलएसएल-क्रास-जी 12 डी, एलएसएल-टीडीटोमेटो 7 को शामिल करने के लिए इंजीनियर किया गया था, जो टैमोक्सीफेन इंजेक्शन के बाद एसिनार कोशिकाओं में संवैधानिक रूप से सक्रिय केआरएएस की अभिव्यक्ति की अनुमति देता है।
गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था (माउस नैतिक प्रोटोकॉल के अनुसार) के बाद, अग्न्याशय को हटा दिया गया था, और ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल लागू किया गया था ( चित्रा 1 और प्रोटोकॉल देखें)।
पृथक्करण प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए, ट्रिप्सिन सी के साथ ऊतक के पूर्व-इनक्यूबेशन के साथ या बिना पृथक्करण किया गया था। यह पाया गया कि ट्रिप्सिन सी के साथ पूर्व-इनक्यूबेशन व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना पृथक्करण को तेज कर दिया। इसके अलावा, कोलेजनेज डी, कोलेजनेस 1 ए और कोलेजनेज पी सहित विभिन्न कोलेजनेज की कोशिश की गई ( तालिका 1 देखें)। यह पाया गया कि कोलेजनेस डी का उपयोग करने से बड़े पैमाने पर कोशिका मृत्यु हुई, और वास्तव में इस कोलेजनेस का उपयोग करने वाले अन्य अध्ययनों में, एसिनार कोशिकाओं का अंशबहुत छोटा था। कोलेजनेस 1 ए के उपयोग ने भी अपेक्षित परिणाम प्रदान नहीं किए, क्योंकि कोलेजनेस 1 ए के साथ 90 मिनट इनक्यूबेशन के बाद भी, ऊतक को अलग नहीं किया गया था। केवल कोलेजनेस पी ने हमें ऊतक को अलग करने और सभी सेल प्रकारों की उच्च व्यवहार्यता बनाए रखने की अनुमति दी।
इन प्रयोगों को टैमोक्सीफेन इंजेक्शन के बाद सात अलग-अलग समय बिंदुओं पर दोहराया गया था। इसके साथ ही एसिनार-टू-डक्टल मेटाप्लासिया और पैनआईएन घाव के गठन के साथ, फाइब्रोब्लास्ट सहित स्ट्रोमल और प्रतिरक्षा कोशिकाओं का संचय हुआ, और ऊतक डेस्मोप्लास्टिक और कठोर हो गया। टैमोक्सीफेन इंजेक्शन के बाद के विभिन्न समय बिंदुओं ने हमें कई अलग-अलग ऊतक राज्यों के तहत प्रोटोकॉल की जांच करने और उपकला, स्ट्रोमल और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की वसूली को मापने की अनुमति दी।
एक माउस की एक तस्वीर चित्रा 2 ए में दिखाया गया है और पृथक अग्न्याशय, एक फूला हुआ ऊतक, चित्रा 2 सी में दिखाया गया है। ऊतक का लाल रंग एसिनार कोशिकाओं में टीडीटमाटर की अभिव्यक्ति से उत्पन्न होता है। प्रोटोकॉल का उपयोग सभी ऊतक राज्यों और मानव नमूनों के साथ सफलतापूर्वक किया गया था। हालांकि, ट्रिप्सिन और कोलेजनेस के साथ इनक्यूबेशन समय भिन्न हो सकता है। इसलिए नमूने की निगरानी करना और माइक्रोस्कोप के तहत हर कुछ मिनट में ऊतक और सेल व्यवहार्यता के पृथक्करण का निरीक्षण करना महत्वपूर्ण है। पृथक्करण प्रोटोकॉल के प्रारंभिक चरण में, पृथक कोशिकाओं की कम संख्या और बड़ी संख्या में झुरमुट (चित्रा 2 डी, बाएं) थे। हमारा उद्देश्य पृथक व्यवहार्य कोशिकाओं को प्राप्त करना था, जैसा कि चित्रा 2 डी, मध्य में दिखाया गया है, और व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या में कमी से बचना था (चित्रा 2 डी, दाएं)।
यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि लंबे इनक्यूबेशन बार कोशिकाओं की व्यवहार्यता कम हो जाती है। आकार में 0.5 x 10 सेमी3 ऊतक से शुरू होकर, हमने कुल 5 x 106 कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त किया, जिनमें से 5 x 105 टीडीटोमेटो पॉजिटिव कोशिकाएं थीं। चित्रा 3 में प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) विश्लेषण के अनुसार, हमारा अग्न्याशय पृथक्करण प्रोटोकॉल कई सेल प्रकारों की वसूली का समर्थन करता है, जिसमें एसिनार कोशिकाएं, डक्टल कोशिकाएं, एंडोथेलियल कोशिकाएं, फाइब्रोब्लास्ट, प्रतिरक्षा कोशिकाएं और उच्च व्यवहार्यता वाले पेरिसाइट्स शामिल हैं। हालांकि, पृथक्करण से पहले ऊतक में प्रत्येक प्रकार की कोशिकाओं की संख्या के बीच वास्तविक अनुपात अलग हो सकता है, अग्नाशयी जमे हुए वर्गों की प्रतिदीप्ति छवियों से अनुमान लगाया गया है जिसमें टीडीटोमैटो पॉजिटिव कोशिकाएं शामिल हैं (चित्रा 2 ई)। ऊपर दिए गए प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त उच्च व्यवहार्यता को एफएसीएस विश्लेषण (चित्रा 3) और हेमोसाइटोमीटर (चित्रा 3 एच) का उपयोग करके किए गए लाइव सेल / मृत कोशिका गिनती द्वारा दिखाया गया है।
प्रत्येक नमूने के लिए, हमने एससीआरएनए-सेक का प्रदर्शन किया और, एफएसीएस विश्लेषण के अनुरूप, हमने टैमोक्सीफेन इंजेक्शन के बाद सभी समय बिंदुओं से प्रत्येक कटे हुए ऊतक में उपरोक्त सभी सेल प्रकारों (चित्रा 4 ए, बी) का पता लगाने की पुष्टि की। हमने कार्बोक्सीपेप्टिडेस 1 (सीपीए 1) की अभिव्यक्ति की भी जांच की, जो कार्बोक्सीपेप्टिडेस 1 को एन्कोड करता है। Acinar कोशिकाओं में Cpa1 अभिव्यक्ति बेहद अधिक है और यह इंगित कर सकती है कि पृथक्करण के दौरान Acinar कोशिकाओं को किस हद तक लाइसिस किया गया था, साथ ही साथ उन्होंने अन्य सेल प्रकारों के प्रतिलेख को किस हद तक दूषित किया है। हमने न्यूनतम संदूषण का पता लगाया, जैसा कि चित्रा 4 सी, डी में देखा जा सकता है। कोमल पृथक्करण के परिणामस्वरूप उच्च व्यवहार्यता भी होती है जो हमें अतिरिक्त प्रयोगों के लिए वांछित सेल प्रकारों की सेल सॉर्टिंग के साथ फॉलो-अप करने की अनुमति देती है (चित्रा 3)।
साथ में, पृथक्करण प्रोटोकॉल की गुणवत्ता एससीआरएनए-सेक सहित विभिन्न अनुवर्ती प्रयोगों का समर्थन करती है।
चित्र 1: प्रोटोकॉल की योजना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: अग्नाशय कोशिका अलगाव। (ए) पेट की गुहा को पूरी तरह से खोलने के बाद माउस के अग्न्याशय (लाल रंग में), यकृत और प्लीहा को दिखाने वाली एक तस्वीर। (बी) अग्न्याशय को हटाने के बाद (ए) के समान माउस। (सी) अग्न्याशय का विच्छेदन। जानवर से हटाने के बाद अग्न्याशय (बाएं)। दरार के बाद अग्न्याशय छोटे टुकड़ों (मध्य) में बदल जाता है। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद चरण पृथक्करण (दाएं)। (डी) एकल-कोशिका व्यवहार्यता की जांच करने के लिए माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की निगरानी। कुल प्राथमिक अग्नाशय कोशिका अलगाव (20x)। 15 मिनट की एंजाइमी प्रतिक्रिया के बाद कोशिकाओं के झुरमुट (बाएं)। एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया (मध्य) के 25 मिनट के बाद एकल-कोशिका निलंबन। लंबे इनक्यूबेशन के बाद सेल व्यवहार्यता कम हो गई (दाएं)। (ई) एक जमे हुए अग्नाशय खंड की प्रतिदीप्ति छवियां। Acinar कोशिकाएं tdTomato पॉजिटिव हैं; नीले रंग में DAPI धुंधला (40x पर फोटो)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: अग्नाशय के कैंसर के एकल-कोशिका निलंबन का एफएसीएस विश्लेषण । (ए) टमाटर सकारात्मक और नकारात्मक कोशिकाएं। (बी) मिश्रित (लाल) बनाम क्रमबद्ध (नीले) एसिनार कोशिकाओं की फ्लो साइटोमेट्री। (C, F) बिना दाग वाली कोशिकाएं, एपीसी और पीबी 450। (डी) एंडोथेलियल कोशिकाओं के मार्कर एंटी-सीडी 31 के साथ धुंधला होने के बाद एफएसीएस विश्लेषण। (ई) एंटी-सीडी 140 बी, पेरिसाइट्स के मार्कर के साथ धुंधला होने के बाद एफएसीएस विश्लेषण। (जी) एंटी-सीडी 11 सी के साथ धुंधला होने के बाद एफएसीएस विश्लेषण, डेंड्राइटिक कोशिकाओं और मैक्रोफेज का एक मार्कर। (एच) चार अलग-अलग अग्न्याशय कोशिका अलगाव में जीवित कोशिकाओं और मृत कोशिकाओं का अनुपात। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: एससीआरएनए-सेक डेटा का विश्लेषण जो प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पादित किया गया था जिसे हम वर्तमान लेख में वर्णित करते हैं। (ए) यूएमएपी एक माउस अग्न्याशय के एससीआरएनए-सेक को टैमॉक्सिफेन इंजेक्शन के बाद अलग-अलग समय बिंदुओं पर दिखाता है, जैसा कि पैनल के दाईं ओर इंगित किया गया है। (बी) सेल प्रकार ज्ञात मार्करों के आधार पर निर्धारित किए गए थे। (C, D) कोशिकाओं को सीपीए 1 ( सी में) या टीडीटमाटर ( डी में) के अभिव्यक्ति स्तर के अनुसार रंगीन किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
इस लेख में, हम अग्नाशय के ऊतक पृथक्करण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। प्रोटोकॉल सरल, उपयोग करने में आसान है, और ठोस ट्यूमर सहित घातक प्रक्रिया के दौरान विभिन्न चरणों में अग्नाशय के ऊतकों से व्यवहार्य एकल कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है। पिछले अध्ययनों में, अग्न्याशय 8,9 को पचाने के लिए विभिन्न प्रकार के कोलेजनेज का उपयोग किया गया था। एक बहुत ही शक्तिशाली कोलेजनेज़ का उपयोग करना, जैसे कि कोलेजनेस डी, प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक बड़ी आबादी और उपकला कोशिकाओं का कम प्रतिशत होता है। कोलेजनेस पी का उपयोग अग्नाशय के पाचन की अनुमति देता है जो बरकरार या ट्यूमर अग्नाशय ी ऊतक के लिए उपयुक्त है।
हमारे अवलोकनों के आधार पर, सभी सेल प्रकारों को अलग किया जा सकता है। हमने पहले प्रतिरक्षा टी कोशिकाओं की घुसपैठ को मान्य किया, उदाहरण के लिए, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री5 का उपयोग करके; हमारा मानना है कि हमारे विश्लेषण में हमने जो सापेक्ष सेल संख्या देखी है, वह ऊतक में कोशिकाओं के वास्तविक प्रतिनिधित्व का एक उचित अनुमान है, सिवाय एसिनार कोशिकाओं के जो नाजुक हैं और इसलिए कम प्रतिनिधित्व किया गया था। हम इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स10,11,12 का उपयोग करने की सलाह देते हैं यदि ऊतक में सेल प्रकारों के सटीक अनुपात की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, हमने देखा कि संवैधानिक रूप से सक्रिय केआरएएस अभिव्यक्ति की अनुपस्थिति में जंगली-प्रकार के चूहों से ऊतक का पृथक्करण अधिक चुनौतीपूर्ण है और अधिक लगातार निगरानी की आवश्यकता होती है, ताकि वॉश बफर में 10% एफबीएस जोड़कर समय पर एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया को रोका जा सके और बड़े पैमाने पर कोशिका मृत्यु से बचा जा सके। यह सीपीए 1 जैसे कुछ अत्यधिक प्रचुर मात्रा में एसीनार टेप से संदूषण के अनुरूप भी है, हालांकि हमारा प्रोटोकॉल इस समस्या को कम करता है।
सेल अलगाव का उपयोग एससीआरएनए-सेक के लिए किया जा सकता है, जैसा कि हमने5 दिखाया है, कोशिकाओं के संवर्धन के लिए, या ऑर्गेनोइड्स के लिए शुरुआती सामग्री के रूप में, उदाहरण के लिए।
ताजा ऊतक की आवश्यकता विधि की एक सीमा है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण जो नाभिक के अलगाव पर केंद्रित है, एकल-नाभिक आरएनए अनुक्रमण (sNuc-seq)13, हाल ही में एकल-कोशिका संकल्प11 पर रोगियों से पीडीएसी ट्यूमर की जांच के लिए उपयोग किया गया था; भविष्य में, अग्नाशयी उपकला कोशिकाओं की डेटा गुणवत्ता की तुलना करना दिलचस्प होगा जो एससीआरएनए-सेक की तुलना में एसएनयूसी-सेक से प्राप्त होते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, नाभिक निष्कर्षण सेल संवर्धन की अनुमति नहीं देता है, और विशिष्ट सेल प्रकारों के लिए समृद्ध करने के लिए छंटाई बेहद चुनौतीपूर्ण है। इसलिए, ऊतक पृथक्करण प्रोटोकॉल भविष्य में एससीआरएनए-सेक प्रयोगों और इन अतिरिक्त अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी होगा।
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Disclosures
लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
हम डेटा विश्लेषण में मदद के लिए डॉ अवाइटल सरुसी-पोर्तुगुज़ और पिछले अध्ययन में प्रोटोकॉल स्थापित करने में सहायता के लिए डॉ डोर कोलोडकिन-गैल को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम परनास लैब के सभी पूर्व और वर्तमान सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। हम संपादन में उनकी मदद के लिए डॉ गिलियन के और डॉ माइकल कानोव्स्की को धन्यवाद देते हैं। इस परियोजना को इज़राइल साइंस फाउंडेशन अनुदान (संख्या 526/18 ओपी), एलेक्स यू सोयका कार्यक्रम और इज़राइल कैंसर रिसर्च फंड (रिसर्च करियर डेवलपमेंट अवार्ड) से अनुदान प्राप्त हुआ है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent or Resource | |||
| 70 µm nylon mesh | Corning | cat##431751 | |
| BSA | Sigma Aldrich | cat# A7906 | |
| Collagenase P | Roche | cat# 11213857001 | |
| Critical Commercial Assay | |||
| DAPI | Sigma Aldrich | cat#MBD0015 | |
| Dnase I | Roche | cat# 10104159001 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Fetal Bovine Serum South American | ThermoFisher | Cat#10270106 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Biological industries | cat#02-018-1A | |
| KRASLSL-G12D mice | Jackson Laboratory | JAX008179 | |
| MACS dead cells removal kit | Milteny Biotec | cat#130-090-101 | |
| PBS | Biological industries | cat#02-023-1A | |
| Ptf1a-CreER mice | Jackson Laboratory | JAX019378 | |
| Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX007908 | |
| Trypsin C-EDTA 0.05% | Biological industries | cat# 03-053-1A | |
| Trypsin inhibitor | Roche | cat#T6522 |
References
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