Summary
Metaplastiska celler i bukspottkörteln är förstadier till maligna celler som ger upphov till tumörer i bukspottkörteln. Att isolera intakta livskraftiga celler i bukspottkörteln är dock utmanande. Här presenterar vi en effektiv metod för dissociation av bukspottkörtelvävnad. Cellerna kan sedan användas för encells-RNA-sekvensering (scRNA-seq) eller för två- eller tredimensionell samodling.
Abstract
Bukspottkörteln består av två huvudsystem: det endokrina systemet, som producerar och utsöndrar hormoner, och det exokrina systemet, som står för cirka 90 % av bukspottkörteln och innehåller celler som producerar och utsöndrar matsmältningsenzymer. Matsmältningsenzymerna produceras i bukspottkörtelns acinärceller, lagras i vesiklar som kallas zymogener, och släpps sedan ut i tolvfingertarmen via bukspottkörtelgången för att initiera metaboliska processer. De enzymer som produceras av acinarcellerna kan döda celler eller bryta ner cellfritt RNA. Dessutom är acinärceller ömtåliga, och vanliga dissociationsprotokoll resulterar i ett stort antal döda celler och cellfria proteaser och RNaser. Därför är en av de största utmaningarna vid matsmältningen av bukspottkörtelvävnad att återställa intakta och livskraftiga celler, särskilt acinärceller. Protokollet som presenteras i den här artikeln visar en tvåstegsmetod som vi utvecklat för att möta detta behov. Protokollet kan användas för att smälta normal bukspottkörtel, bukspottkörtel som innehåller premaligna lesioner eller bukspottkörteltumörer som innehåller ett stort antal stroma- och immunceller.
Introduction
Bukspottkörtelcancer (PDAC) är en av de mest aggressiva cancertyperna1. Kliniska bevis stöder uppfattningen att PDAC utvecklas från exokrina systemceller, inklusive acinärceller, under många år, drivet av mutationer i KRAS proto-onkogenen2.
Tumörer i bukspottkörteln omfattar många olika celltyper, och det har visat sig att maligna celler endast utgör 20-50 % av tumörmassan3. Olika celltyper interagerar med epitelcellerna, stöder deras omvandling och förbättrar tumörbildning och tillväxt. Tidiga händelser orsakar acinärmetaplasi, vilket ger upphov till mikroskopiska lesioner som kallas pankreas intraepitelial neoplasi (PanINs), som i vissa fall kan utvecklas till PDAC4.
Det finns ett kritiskt behov av att undersöka dessa interaktioner och rikta in sig på pivotala signaler. Single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) är en kraftfull metod som avslöjar genuttryck med en encellsupplösning och därigenom spårar de förändringar som epitelceller genomgår, vilket möjliggör utforskning av bukspottkörtelcancerns utveckling.
Vävnadsdissektion och nedbrytning till enskilda celler är det första steget i ett scRNA-seq-experiment. Flera faktorer gör matsmältningen av bukspottkörtelvävnad särskilt utmanande: i) acinarceller står för mer än 90 % av bukspottkörteln och acinarceller innehåller stora mängder matsmältningsenzymer, inklusive proteaser och RNaser som minskar kvaliteten på RNA-baserade bibliotek; ii) acinarceller är mycket känsliga och kan lyseras om standardprotokoll används, iii) acinarceller uttrycker ett litet antal gener på mycket höga nivåer. Därför, om dessa celler lyseras under experimentet, kan detta kontaminera den observerade genuttrycksprofilen för andra celler; iv) Vävnad i bukspottkörteln som återvunnits från tumörer är desmoplastisk, vilket gör den svår att dissekera utan att skada cellerna. Således, även om det krävs att upprätthålla hög livskraft hos alla celltyper, tillför det stora antalet och känsligheten hos acinärceller ytterligare komplexitet. Dessa faktorer gör det svårt att uppnå en encellssuspension som är mer än 80 % livskraftig och inte har några klumpar, vilket krävs för scRNA-seq-experiment.
Här utvecklade vi ett protokoll med trypsin C och kollagenas P, tillsammans med frekvent vävnadsövervakning. Detta stöder dissociation till enskilda celler samtidigt som den bibehåller hög viabilitet för att stödja framgången för scRNA-seq-experiment 5,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den gemensamma etiska kommittén (Institutional Animal Care and Use Committee) vid Hebrew University (Jerusalem, Israel) och Hadassah Medical Center (Jerusalem, Israel) godkände studieprotokollet för djurskydd (MD-18-15417-5 "Tissue dynamics in pancreatic cancer in mice"), och protokollet som presenteras här uppfyllde alla relevanta etiska regler för djurförsök och forskning. Hebrew University är ett Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International-ackrediterat institut.
OBS: Musstammen #007908, stam #019378 och stam #008179 erhölls från Jacksons laboratorium. PRT (Kras+/LSL-G12D; Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato)-möss skapades genom att korsa ovanstående stammar. Möss av båda könen, mellan 6 veckor och 15 månaders ålder, användes för studien. Tamoxifen framställdes genom att pulvret löstes upp i majsolja. Vuxna möss (6-8 veckors ålder, honor och hanar) injicerades subkutant med tamoxifen dag 0 och 2 i en dos på 400 mg/kg och undersöktes två gånger i veckan efter injektionen. Det var inte möjligt att mäta tumörer eftersom de var internt belägna; Därför utfördes eutanasi om onormala kliniska tecken observerades enligt det etiska protokollet. Möss avlivades vid olika tidpunkter efter tamoxifeninduktion, med hjälp av isofluran och cervikal luxation.
1. Dissektion av bukspottkörteln
OBS: För optimalt utbyte under extraktion och för att säkerställa god cellviabilitet är snabb dissektion avgörande. För att förkorta den tid som krävs för isolering av bukspottkörteln måste alla instrument och all utrustning vara redo på is innan musen avlivas.
- Avliva musen genom CO2 -kvävning och kontrollera med cervikal luxation. Från och med detta steg måste alla procedurer utföras med sterila dissektionsinstrument.
- Fixera musen och spraya buken med 70% etanol. Gör ett V-format snitt på 2,5 cm i underlivet med sax och pincett och fortsätt uppåt för att öppna bukhålan helt.
- Leta reda på magen på vänster sida av musen. Leta reda på bukspottkörteln, som ligger nära mjälten. Separera bukspottkörteln från magsäcken och tolvfingertarmen med två pincetter (utan att riva). Fortsätt och separera bukspottkörteln från tunntarmen, jejunum och ileum.
- Flytta bukspottkörteln till höger sida av musen. Separera de återstående anslutningarna mellan bukspottkörteln och brösthålan med en pincett för att helt lossa bukspottkörteln och den bifogade mjälten.
- Ta bort bukspottkörteln och bred ut den för undersökning i en petriskål på is.
OBS: Försiktighet måste iakttas under detta steg för att endast ta bort bukspottkörteln och inte ta bort mesenterisk fettvävnad eller annan intilliggande vävnad tillsammans med bukspottkörteln, för att undvika cellulär kontaminering.
2. Enzymatisk och mekanisk dissociation av bukspottkörteln
- Förbered följande buffertar i förväg.
- Dissociationsbuffert 1: 4 ml trypsin C + 6 ml fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) (se tabell 1) för varje prov.
- Dissociationsbuffert 2: 9 ml Hanks ′ balanserad saltlösning (HBSS) 1x; 4 % bovint serumalbumin (BSA); 1 ml kollagenas P (10 mg/ml); 200 μl trypsinhämmare (10 mg/ml); och 200 μl DNas I (10 mg/ml) (se tabell 1).
- Tvättbuffert: 50 ml HBSS 1x; 2 g BSA; 1 ml trypsinhämmare (10 mg/ml); och 1 ml DNas 1 (10 mg/ml).
- Lösning för stopp av enzymaktivitet: HBSS 1x innehållande 5 % fetalt bovint serum (FBS) och 150 g DNas I (0,2 mg/ml).
- Lägg bukspottkörteln i ett 50 ml rör på is. Skölj bukspottkörteln i 10% FBS i HBSS 1x. Fettvävnaden flyter och bukspottkörteln sjunker. Detta är ett enkelt sätt att visualisera och snabbt ta bort den förorenande vita fettvävnaden som fortfarande sitter fast i bukspottkörteln.
- Överför musens bukspottkörtelvävnad till en steril petriskål som innehåller 5 ml HBSS 1x på is. Skär bukspottkörteln i små bitar på 1 till 3 mm3 med en Noyes-sax och en skalpell (Figur 2A). Om det finns mer än ett prov ska proverna förvaras på is i 10 % FBS/HBSS 1x.
- Överför vävnaderna till ett centrifugrör. Centrifugera vid 350 x g vid 4 °C i 5 min. Aspirera och kassera supernatanten för att ta bort cellfragment och blodkroppar.
- Återsuspendera bitarna i dissociationsbuffert 1 innehållande 0,02 % trypsin C-0,05 % EDTA i 10 minuter vid 37 °C med omrörning (180 varv/min). Tvätta omedelbart med 10% FBS/Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM). Centrifugera i 5 minuter vid 350 g vid 4 °C.
- Tvätta igen genom att blanda pelleten i 10 ml tvättbuffert och centrifugera vid 350 x g i 5 minuter vid 4 °C före nästa dissociationssteg.
- Inkubera bukspottkörteln i dissociationsbuffert 2 i 15 minuter vid 37 °C med omrörning (180 rpm).
- Efter 15 minuter utförs mekanisk dissociation genom att kraftigt pipettera bukspottkörtelfragmenten upp och ner i sterila pipetter av minskande storlek (25, 10 och 5 ml serologiska pipetter) 10 gånger och värm tillbaka till 37 °C.
- Efter ytterligare 5 minuter upprepas den mekaniska dissociationen och använd ljusmikroskopi för att övervaka dissociationen i enlighet med mängden encellssuspension. Om mindre än 90 % av suspensionen i detta skede består av isolerade enkelceller behövs vanligtvis en längre inkubationstid. Använd trypanblå för att övervaka cellviabiliteten.
- Fortsätt med inkubationen och ta prover för att upptäcka dissociationen var 5:e minut.
OBS: Den totala inkubationstiden beror på vävnaden och kan variera mellan proverna. Inkubationen och dissociationen av vävnaden bör avslutas när 90 % av cellerna har separerats till enstaka celler eller när en minskning av viabiliteten upptäcks.
- När bukspottkörtelvävnaden är väl dissocierad (motsvarande försvinnandet av bukspottkörtelfragment och lösningens ökande grumlighet) (figur 2), avbryts den enzymatiska reaktionen genom att sköljas två gånger med enzymaktivitetsstopplösning i 5 minuter vid 4 °C. Från och med detta steg, håll cellsuspensionen på is.
- För cellsuspensionen genom ett 70 μm nylonnät och kontrollera cellviabiliteten under mikroskopet. Mindre storlekar av nylonnät kan minska cellens livskraft.
- Återsuspendera och tvätta pelleten med 5-10 ml iskall buffrad tvättlösning. Räkna cellerna.
- Om flera röda blodkroppar observeras, behandla cellerna med en lysbuffert för röda blodkroppar i 2 minuter vid rumstemperatur. I de fall där klumpar observeras bör provet behandlas igen med trypsin, enligt beskrivningen i steg 2.5. Viabilitet detekteras med trypanblått under mikroskopet, och om viabiliteten är mindre än 80 % bör levande celler isoleras med hjälp av MACS-satsen för borttagning av döda celler (magnetic-activated cell sorting) med MACS MS-kolonner (se tabell 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I ett nyligen publicerat arbete5 tillämpade vi protokollet som beskrivs ovan för att utforska de tidiga stadierna av PDAC-utveckling med hjälp av en musmodell. Musen var genetiskt modifierad för att inkludera kassetterna Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato7, som tillåter uttryck av konstitutivt aktiv KRAS i acinarceller efter tamoxifeninjektion.
Efter cervikal luxation (enligt det etiska protokollet för möss) avlägsnades bukspottkörteln och protokollet som beskrivits ovan tillämpades (se figur 1 och protokoll).
För att optimera dissociationsprotokollet utfördes dissociationen med eller utan förinkubation av vävnaden med trypsin C. Det visade sig att preinkubation med trypsin C påskyndade dissociationen utan att påverka livskraften. Dessutom prövades olika kollagenaser, inklusive kollagenas D, kollagenas 1a och kollagenas P (se tabell 1). Det visade sig att användning av kollagenas D resulterade i massiv celldöd, och i andra studier som använde detta kollagenas var fraktionen av acinarcellermycket liten. Användningen av kollagenas 1a gav inte heller de förväntade resultaten, eftersom vävnaden inte dissocierades ens efter en 90 minuters inkubation med kollagenas 1a. Endast kollagenas P gjorde det möjligt för oss att dissociera vävnaden och upprätthålla en hög livskraft hos alla celltyper.
Dessa experiment upprepades vid sju olika tidpunkter efter injektionen av tamoxifen. Samtidigt med acinar-till-duktal metaplasi och PanIN-lesionsbildning skedde en ansamling av stroma- och immunceller, inklusive fibroblaster, och vävnaden blev desmoplastisk och stel. De olika tidpunkterna efter tamoxifeninjektionen gjorde det möjligt för oss att undersöka protokollet under flera olika vävnadstillstånd och mäta återhämtningen av epitel-, stroma- och immunceller.
Ett foto av en mus visas i figur 2A och den isolerade bukspottkörteln, en fluffig vävnad, visas i figur 2C. Den röda färgen på vävnaden är resultatet av uttrycket av tdTomat i acinarcellerna. Protokollet användes framgångsrikt med alla vävnadstillstånd och med humana prover. Inkubationstiderna med trypsin och kollagenas kan dock variera. Det är därför viktigt att övervaka provet och observera dissociationen av vävnads- och cellviabiliteten med några minuters mellanrum under mikroskopet. I ett tidigt skede av dissociationsprotokollet fanns det ett lågt antal isolerade celler och ett stort antal klumpar (Figur 2D, till vänster). Vårt mål var att uppnå isolerade livsdugliga celler, som visas i figur 2D, mitten, och undvika en minskning av antalet livsdugliga celler (figur 2D, till höger).
Det är viktigt att notera att längre inkubationstider minskade cellernas livskraft. Med utgångspunkt från en vävnad 0,5 x 10 cm3 i storlek återfann vi totalt 5 x 106 celler, varav 5 x 105 var tdTomatpositiva celler. Enligt analysen av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) i figur 3 stöder vårt pankreasdissociationsprotokoll återhämtningen av flera celltyper, inklusive acinärceller, duktala celler, endotelceller, fibroblaster, immunceller och pericyter med hög viabilitet. Det faktiska förhållandet mellan antalet celler från varje typ i vävnaden före dissociation kan dock vara annorlunda, vilket kan härledas från fluorescensbilderna av bukspottkörtelns frysta snitt som innehåller tdTomato-positiva celler (Figur 2E). Den höga viabilitet som uppnås med hjälp av det protokoll som beskrivs ovan framgår av FACS-analysen (figur 3) och räkningen av levande celler/döda celler som görs med hjälp av en hemocytometer (figur 3H).
För varje prov utförde vi scRNA-seq och, i överensstämmelse med FACS-analysen, bekräftade vi detektionen av alla ovan nämnda celltyper (Figur 4A,B), i var och en av de resekerade vävnaderna från alla tidpunkter efter tamoxifeninjektionen. Vi undersökte också uttrycket av karboxipeptidas 1 (Cpa1), som kodar för karboxipeptidas1. Cpa1-uttrycket i acinärceller är extremt högt och kan indikera i vilken utsträckning acinärceller lyserades under dissociationen, samt i vilken utsträckning de har kontaminerat transkriptomet hos andra celltyper. Vi upptäckte minimal kontaminering, vilket kan ses i figur 4C,D. Den mjuka dissociationen resulterar också i hög viabilitet som gör att vi kan följa upp med cellsortering av önskade celltyper för ytterligare experiment (Figur 3).
Sammantaget stöder kvaliteten på dissociationsprotokollet olika uppföljningsexperiment, inklusive scRNA-seq.
Figur 1: Protokollets schema. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Cellisolering i bukspottkörteln. (A) Ett foto som visar bukspottkörteln (i rött), levern och mjälten på musen efter att bukhålan har öppnats helt. B) Samma mus som i (A) efter avlägsnande av bukspottkörteln. (C) Dissektion av bukspottkörteln. Bukspottkörteln efter avlägsnande från djuret (vänster). Bukspottkörteln efter klyvning i små bitar (mitten). Fasseparation efter centrifugering (höger). D) Övervakning av cellerna under mikroskopet för att undersöka encellsviabilitet. Total isolering av primära bukspottkörtelceller (20x). Klumpar av celler efter 15 minuters enzymreaktion (vänster). Encellssuspension efter 25 minuters enzymreaktion (mitten). Minskad cellviabilitet efter en lång inkubation (höger). (E) Fluorescensbilder av ett fruset snitt av bukspottkörteln. Acinarceller är tdTomatpositiva ; DAPI-färgning i blått (foto vid 40x). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: FACS-analys av encellssuspension av bukspottkörtelcancer . (A) tdTomatpositiva och negativa celler. (B) Flödescytometri för osorterade (röda) kontra sorterade (blå) acinära celler. (C,F) Ofärgade celler, APC och PB450. (D) FACS-analys efter färgning med Anti-CD31, en markör för endotelceller. (E) FACS-analys efter färgning med Anti-CD140b, en markör för pericyter. G) FACS-analys efter färgning med Anti-CD11c, en markör för dendritiska celler och makrofager. (H) Förhållandet mellan levande celler och döda celler i fyra olika isoleringar av bukspottkörtelceller. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Analys av scRNA-seq-data som producerades med hjälp av det protokoll som vi beskriver i den aktuella artikeln. (A) UMAP som visar scRNA-seq av en musbukspottkörtel vid olika tidpunkter efter tamoxifeninjektion, enligt vad som anges på panelens högra sida. (B) Celltyper bestämdes baserat på kända markörer. (C,D) Cellerna färgas enligt uttrycksnivån för Cpa1 (i C) eller nivån för tdTomato (i D). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den här artikeln presenterar vi ett protokoll för dissociation av bukspottkörtelvävnad. Protokollet är enkelt, lätt att använda och ger ett verktyg för att isolera livskraftiga enskilda celler från bukspottkörtelvävnad i olika stadier under malignitetsprocessen, inklusive solida tumörer. I tidigare studier har olika typer av kollagenaser använts för att bryta ner bukspottkörteln 8,9. Att använda ett mycket potent kollagenas, såsom kollagenas D, resulterar i en stor population av immunceller och en lägre andel epitelceller. Användningen av kollagenas P möjliggör bukspottkörtelns nedbrytning som är lämplig för intakt eller tumörvävnad i bukspottkörteln.
Baserat på våra observationer kan alla celltyper isoleras. Vi har tidigare validerat infiltrationen av immun-T-celler, till exempel med hjälp av immunhistokemi5; Vi tror att det relativa cellantalet som vi observerade i vår analys är en korrekt approximation till den faktiska representationen av celler i vävnaden, med undantag för acinarceller som är ömtåliga och därför var underrepresenterade. Vi rekommenderar att du använder immunhistokemi eller spatial transkriptomik10,11,12 om det finns behov av exakta proportioner av celltyper i vävnaden. Dessutom observerade vi att dissociationen av vävnad från vildtypsmöss i frånvaro av konstitutivt aktivt KRAS-uttryck är mer utmanande och kräver mer frekvent övervakning, för att stoppa den enzymatiska reaktionen i tid genom att tillsätta 10 % FBS till tvättbufferten och undvika massiv celldöd. Detta överensstämmer också med kontaminering från vissa mycket rikliga acinartranskript, såsom Cpa1, även om vårt protokoll minimerar detta problem.
Cellisoleringen kan användas för scRNA-seq, som vi visade5, för att odla celler, eller som utgångsmaterial för till exempel organoider.
Behovet av färsk vävnad är en begränsning med metoden. Ett alternativt tillvägagångssätt som fokuserar på isolering av kärnor, single-nucleus RNA-sekvensering (sNuc-seq)13, användes nyligen för att undersöka PDAC-tumörer från patienter med en encellsupplösning11; i framtiden kommer det att vara intressant att jämföra datakvaliteten hos pankreasepitelceller som erhålls från sNuc-seq jämfört med scRNA-seq. Det är viktigt att kärnextraktion inte tillåter cellodling, och sortering för att anrika för specifika celltyper är extremt utmanande. Därför kommer vävnadsdissociationsprotokollet att vara användbart i framtiden för scRNA-seq-experiment och för dessa ytterligare tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna redovisar inga motstridiga intressen.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr. Avital Sarusi-Portuguez för hjälp med dataanalys och Dr. Dror Kolodkin-Gal för hjälp med att etablera protokollet i en tidigare studie. Vi tackar alla tidigare och nuvarande medlemmar i Parnas-labbet. Vi tackar Dr. Gillian Kay och Dr. Michael Kanovsky för deras hjälp med redigeringen. Detta projekt har fått finansiering från Israel Science Foundation (No. 526/18 O.P.), Alex U. Soyka Program och ett bidrag från Israel Cancer Research Fund (Research Career Development Award).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent or Resource | |||
| 70 µm nylon mesh | Corning | cat##431751 | |
| BSA | Sigma Aldrich | cat# A7906 | |
| Collagenase P | Roche | cat# 11213857001 | |
| Critical Commercial Assay | |||
| DAPI | Sigma Aldrich | cat#MBD0015 | |
| Dnase I | Roche | cat# 10104159001 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Fetal Bovine Serum South American | ThermoFisher | Cat#10270106 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Biological industries | cat#02-018-1A | |
| KRASLSL-G12D mice | Jackson Laboratory | JAX008179 | |
| MACS dead cells removal kit | Milteny Biotec | cat#130-090-101 | |
| PBS | Biological industries | cat#02-023-1A | |
| Ptf1a-CreER mice | Jackson Laboratory | JAX019378 | |
| Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX007908 | |
| Trypsin C-EDTA 0.05% | Biological industries | cat# 03-053-1A | |
| Trypsin inhibitor | Roche | cat#T6522 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Peng, J., et al. Author correction: single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Research. 29 (9), 777 (2019).
- Hruban, R. H., Wilentz, R. E., Kern, S. E.
- Schlesinger, Y., et al. Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells' heterogeneity. Nature Communications. 11 (1), 4516 (2020).
- Kolodkin-Gal, D., et al. Senolytic elimination of Cox2-expressing senescent cells inhibits the growth of premalignant pancreatic lesions. Gut. 71 (2), 345-355 (2021).
- Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
- Elyada, E., et al. Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts. Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).
- Bernard, V., et al. Single-cell transcriptomics of pancreatic cancer precursors demonstrates epithelial and microenvironmental heterogeneity as an early event in neoplastic progression. Clinical Cancer Research. 25 (7), 2194-2205 (2019).
- Moncada, R., et al. Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas. Nature Biotechnology. 38 (3), 333-342 (2020).
- Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptome profiling of pancreatic cancer identifies multicellular dynamics associated with neoadjuvant treatment. Nature Genetics. 54 (8), 1178-1191 (2022).
- Cui Zhou, D., et al. Spatially restricted drivers and transitional cell populations cooperate with the microenvironment in untreated and chemo-resistant pancreatic cancer. Nature Genetics. 54 (9), 1390-1405 (2022).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
