Summary
Le cellule metaplastiche pancreatiche sono precursori di cellule maligne che danno origine ai tumori pancreatici. Tuttavia, isolare le cellule pancreatiche vitali intatte è difficile. Qui presentiamo un metodo efficiente per la dissociazione del tessuto pancreatico. Le cellule possono quindi essere utilizzate per il sequenziamento di RNA a singola cellula (scRNA-seq) o per la co-coltura bi- o tridimensionale.
Abstract
Il pancreas comprende due sistemi principali: il sistema endocrino, che produce e secerne ormoni, e il sistema esocrino, che rappresenta circa il 90% del pancreas e comprende cellule che producono e secernono enzimi digestivi. Gli enzimi digestivi sono prodotti nelle cellule acinose pancreatiche, immagazzinate in vescicole chiamate zimogeni, e vengono quindi rilasciati nel duodeno attraverso il dotto pancreatico per avviare i processi metabolici. Gli enzimi prodotti dalle cellule acinari possono uccidere le cellule o degradare l'RNA privo di cellule. Inoltre, le cellule acinari sono fragili e i comuni protocolli di dissociazione si traducono in un gran numero di cellule morte e proteasi e RNasi prive di cellule. Pertanto, una delle maggiori sfide nella digestione del tessuto pancreatico è il recupero di cellule intatte e vitali, in particolare cellule acinose. Il protocollo presentato in questo articolo mostra un metodo in due fasi che abbiamo sviluppato per soddisfare questa esigenza. Il protocollo può essere utilizzato per digerire la pancreata normale, la pancreata che include lesioni pre-maligne o i tumori pancreatici che includono un gran numero di cellule stromali e immunitarie.
Introduction
L'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è uno dei tipi di cancro più aggressivi1. L'evidenza clinica supporta l'idea che il PDAC si sviluppi da cellule del sistema esocrino, comprese le cellule acinari, nel corso di molti anni, guidate da mutazioni nel proto-oncogeneKRAS 2.
I tumori del pancreas comprendono molti tipi di cellule diverse ed è stato dimostrato che le cellule maligne contano solo per il 20%-50% della massa tumorale3. Diversi tipi di cellule interagiscono con le cellule epiteliali, supportano la loro trasformazione e migliorano la formazione e la crescita del tumore. Gli eventi precoci causano metaplasia acinare, che dà origine a lesioni microscopiche chiamate neoplasia intraepiteliale pancreatica (PanINs), che in alcuni casi possono evolvere in PDAC4.
C'è una necessità critica di studiare queste interazioni e di individuare i segnali cardine. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) è un potente metodo che rivela l'espressione genica con una risoluzione a singola cellula, monitorando così i cambiamenti che le cellule epiteliali subiscono, consentendo così l'esplorazione dello sviluppo del cancro al pancreas.
La dissezione e la digestione dei tessuti in singole cellule è la prima fase di un esperimento scRNA-seq. Diversi fattori rendono la digestione del tessuto pancreatico particolarmente impegnativa: i) le cellule acinari rappresentano oltre il 90% del pancreas e le cellule acinari contengono grandi quantità di enzimi digestivi, tra cui proteasi e RNasi che riducono la qualità delle librerie basate sull'RNA; (ii) le cellule acinari sono molto sensibili e possono lisare se vengono utilizzati protocolli standard; (iii) le cellule acinari esprimono un piccolo numero di geni a livelli molto elevati. Pertanto, se queste cellule vengono lisate durante l'esperimento, questo può contaminare il profilo di espressione genica osservato di altre cellule; (iv) il tessuto pancreatico recuperato dai tumori è desmoplastico, il che lo rende difficile da sezionare senza danneggiare le cellule. Pertanto, anche se è necessario mantenere un'elevata vitalità di tutti i tipi di cellule, il gran numero e la sensibilità delle cellule acinari aggiungono ulteriore complessità. Questi fattori impongono difficoltà nel raggiungere una sospensione a singola cellula che sia vitale per oltre l'80% e non abbia grumi, come richiesto per gli esperimenti scRNA-seq.
Qui, abbiamo sviluppato un protocollo che utilizza tripsina C e collagenasi P, insieme a un frequente monitoraggio dei tessuti. Ciò supporta la dissociazione in singole cellule pur mantenendo un'elevata vitalità per supportare il successo degli esperimenti scRNA-seq 5,6.
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Protocol
Il comitato etico congiunto (Institutional Animal Care and Use Committee) dell'Università Ebraica (Gerusalemme, Israele) e dell'Hadassah Medical Center (Gerusalemme, Israele) ha approvato il protocollo di studio per il benessere degli animali (MD-18-15417-5 "Dinamica tissutale nel cancro del pancreas nei topi") e il protocollo qui presentato è conforme a tutte le normative etiche pertinenti per la sperimentazione e la ricerca sugli animali. L'Università Ebraica è un istituto accreditato a livello internazionale per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali da laboratorio.
NOTA: Il ceppo di topo #007908, il ceppo #019378 e il ceppo #008179 sono stati ottenuti dal laboratorio di Jackson. PRT (Kras+/LSL-G12D; PTF1a-CreER; I topi Rosa26LSL-tdTomato) sono stati creati incrociando i ceppi di cui sopra. Per lo studio sono stati utilizzati topi di entrambi i sessi, di età compresa tra 6 settimane e 15 mesi. Il tamoxifene veniva preparato sciogliendo la polvere in olio di mais. Topi adulti (6-8 settimane di età, femmine e maschi) sono stati iniettati con tamoxifene per via sottocutanea nei giorni 0 e 2 alla dose di 400 mg/kg ed esaminati due volte alla settimana dopo l'iniezione. Non è stato possibile misurare i tumori in quanto erano localizzati internamente; Pertanto, l'eutanasia è stata eseguita se sono stati osservati segni clinici anomali secondo il protocollo etico. I topi sono stati soppressi in diversi momenti dopo l'induzione del tamoxifene, utilizzando isoflurano e lussazione cervicale.
1. Dissezione pancreatica
NOTA: Per una resa ottimale durante l'estrazione e per garantire una buona vitalità cellulare, è fondamentale una rapida dissezione. Per ridurre il tempo necessario per l'isolamento del pancreas, tutti gli strumenti e le attrezzature devono essere pronti sul ghiaccio prima dell'eutanasia del topo.
- Sopprimere il topo mediante asfissia da CO2 e verificare utilizzando la lussazione cervicale. Da questa fase in poi, tutte le procedure devono essere eseguite con strumenti di dissezione sterili.
- Fissa il topo e spruzza l'addome con etanolo al 70%. Praticare un'incisione a forma di V di 2,5 cm nella zona genitale con forbici e pinze e procedere verso l'alto per aprire completamente la cavità addominale.
- Individua lo stomaco sul lato sinistro del mouse. Individua il pancreas, che si trova vicino alla milza. Separare il pancreas dallo stomaco e dal duodeno utilizzando due pinze (senza strappi). Continuare e separare il pancreas dall'intestino tenue, dal digiuno e dall'ileo.
- Sposta il pancreas sul lato destro del mouse. Separare le connessioni rimanenti tra il pancreas e la cavità toracica con una pinza per staccare completamente il pancreas e la milza attaccata.
- Rimuovere il pancreas e stenderlo per l'esame in una capsula di Petri con ghiaccio.
NOTA: È necessario prestare attenzione durante questa fase per rimuovere solo il pancreas e non rimuovere il tessuto adiposo mesenterico o altro tessuto adiacente insieme al pancreas, per evitare la contaminazione cellulare.
2. Dissociazione enzimatica e meccanica del pancreas
- Preparare in anticipo i seguenti buffer.
- Tampone di dissociazione 1: 4 mL di tripsina C + 6 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (cfr. tabella 1) per ciascun campione.
- Tampone di dissociazione 2: 9 mL di soluzione salina bilanciata Hanks (HBSS) 1x; 4% albumina sierica bovina (BSA); 1 mL di collagenasi P (10 mg/mL); 200 μL di inibitore della tripsina (10 mg/mL); e 200 μL di DNasi I (10 mg/mL) (vedere Tabella 1).
- Tampone di lavaggio: 50 mL di HBSS 1x; 2 g di BSA; 1 mL di inibitore della tripsina (10 mg/mL); e 1 mL di DNasi 1 (10 mg/mL).
- Soluzione per l'arresto dell'attività enzimatica: HBSS 1x contenente il 5% di siero fetale bovino (FBS) e 150 g di DNasi I (0,2 mg/mL).
- Mettere il pancreas in una provetta da 50 ml su ghiaccio. Risciacquare il pancreas in FBS al 10% in HBSS 1x. Il tessuto adiposo galleggerà e il pancreas affonderà. Questo è un modo semplice per visualizzare e rimuovere rapidamente il tessuto adiposo bianco contaminante ancora attaccato al pancreas.
- Trasferire il tessuto pancreatico del topo in una capsula di Petri sterile contenente 5 ml di HBSS 1x su ghiaccio. Tagliare il pancreas in piccoli pezzi da 1 a 3 mm3 usando le forbici Noyes e un bisturi (Figura 2A). In caso di più di un campione, i campioni devono essere conservati in ghiaccio al 10% FBS/HBSS 1x.
- Trasferire i tessuti in una provetta da centrifuga. Centrifugare a 350 x g a 4 °C per 5 min. Aspirare e scartare il surnatante per rimuovere i frammenti cellulari e le cellule del sangue.
- Risospendere i pezzi nel tampone di dissociazione 1 contenente tripsina C-0,05% EDTA allo 0,02% per 10 minuti a 37 °C con agitazione (180 giri/min). Lavare immediatamente con il 10% di terreno modificato di Eagle (DMEM) di FBS/Dulbecco. Centrifugare per 5 min a 350 g a 4 °C.
- Lavare nuovamente risospendendo il pellet in 10 mL di tampone di lavaggio e centrifugando a 350 x g per 5 minuti a 4 °C prima della successiva fase di dissociazione.
- Incubare il pancreas nel tampone di dissociazione 2 per 15 minuti a 37 °C con agitazione (180 giri/min).
- Dopo 15 minuti, eseguire la dissociazione meccanica pipettando vigorosamente i frammenti pancreatici su e giù in pipette sterili di dimensioni decrescenti (pipette sierologiche da 25, 10 e 5 ml) 10 volte e riportare a 37 °C.
- Dopo altri 5 minuti, ripetere la dissociazione meccanica e utilizzare la microscopia ottica per monitorare la dissociazione in base alla quantità di sospensione unicellulare. Di solito se in questa fase meno del 90% della sospensione è costituito da singole cellule isolate, è necessario un tempo di incubazione più lungo. Usa il blu di tripano per monitorare la vitalità cellulare.
- Continuare con l'incubazione e prelevare campioni per rilevare la dissociazione ogni 5 minuti.
NOTA: Il tempo totale di incubazione dipende dal tessuto e può variare da un campione all'altro. L'incubazione e la dissociazione tissutale dovrebbero terminare quando il 90% delle cellule viene separato in singole cellule o quando viene rilevata una riduzione della vitalità.
- Dopo che il tessuto pancreatico è ben dissociato (in corrispondenza della scomparsa dei frammenti pancreatici e dell'aumento della torbidità della soluzione) (Figura 2), arrestare la reazione enzimatica lavando due volte con la soluzione di arresto dell'attività enzimatica per 5 minuti a 4 °C. A partire da questo passaggio, mantenere la sospensione cellulare su ghiaccio.
- Passare la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon da 70 μm e verificare la vitalità cellulare al microscopio. Maglie di nylon di dimensioni più piccole possono ridurre la vitalità cellulare.
- Risospendere e lavare il pellet con 5-10 mL di soluzione di lavaggio tamponata ghiacciata. Conta le celle.
- Se si osservano diversi globuli rossi, trattare le cellule con un tampone di lisi dei globuli rossi per 2 minuti a temperatura ambiente. Nei casi in cui si osservano grumi, il campione deve essere trattato nuovamente con tripsina, come descritto al punto 2.5. La vitalità viene rilevata con il blu di tripano al microscopio e, se la vitalità è inferiore all'80%, le cellule vive devono essere isolate utilizzando il kit di rimozione delle cellule morte MACS (Magnetic-Activated Cell Sorting) con colonne MACS MS (vedere Tabella 1).
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Representative Results
In un lavoro5 pubblicato di recente, abbiamo applicato il protocollo sopra descritto per esplorare le prime fasi dello sviluppo di PDAC utilizzando un modello murino. Il topo è stato geneticamente modificato per includere le cassette Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato7, che consentono l'espressione di KRAS costitutivamente attivo nelle cellule acinari dopo l'iniezione di tamoxifene.
Dopo la lussazione cervicale (secondo il protocollo etico del topo), il pancreas è stato resecato ed è stato applicato il protocollo sopra descritto (vedi Figura 1 e Protocollo).
Per ottimizzare il protocollo di dissociazione, la dissociazione è stata eseguita con o senza pre-incubazione del tessuto con tripsina C. È stato riscontrato che la pre-incubazione con tripsina C ha accelerato la dissociazione senza influire sulla vitalità. Inoltre, sono state provate diverse collagenasi, tra cui la collagenasi D, la collagenasi 1a e la collagenasi P (vedere Tabella 1). È stato scoperto che l'uso della collagenasi D ha provocato una massiccia morte cellulare e, in effetti, in altri studi che hanno utilizzato questa collagenasi, la frazione di cellule acinari era molto piccola8. Anche l'uso della collagenasi 1a non ha fornito i risultati attesi, poiché anche dopo un'incubazione di 90 minuti con la collagenasi 1a, il tessuto non è stato dissociato. Solo la collagenasi P ci ha permesso di dissociare il tessuto e mantenere un'elevata vitalità di tutti i tipi di cellule.
Questi esperimenti sono stati ripetuti in sette diversi momenti dopo l'iniezione di tamoxifene. Contemporaneamente alla metaplasia acino-duttale e alla formazione di lesioni PanIN, c'è stato un accumulo di cellule stromali e immunitarie, compresi i fibroblasti, e il tessuto è diventato desmoplastico e rigido. I diversi punti temporali post-iniezione di tamoxifene ci hanno permesso di esaminare il protocollo in diversi stati tissutali e misurare il recupero delle cellule epiteliali, stromali e immunitarie.
Una foto di un topo è mostrata nella Figura 2A e il pancreas isolato, un tessuto soffice, è mostrato nella Figura 2C. Il colore rosso del tessuto deriva dall'espressione di tdTomato nelle cellule acinari. Il protocollo è stato utilizzato con successo con tutti gli stati tissutali e con campioni umani. Tuttavia, i tempi di incubazione con tripsina e collagenasi possono variare. È quindi importante monitorare il campione e osservare la dissociazione del tessuto e la vitalità cellulare ogni pochi minuti al microscopio. In una fase iniziale del protocollo di dissociazione, c'era un basso numero di cellule isolate e un gran numero di grumi (Figura 2D, a sinistra). Il nostro obiettivo era quello di ottenere cellule vitali isolate, come mostrato nella Figura 2D, al centro, ed evitare una riduzione del numero di cellule vitali (Figura 2D, a destra).
È importante notare che tempi di incubazione più lunghi hanno ridotto la vitalità delle cellule. Partendo da un tessuto di 0,5 x 10 cm3 di dimensioni, abbiamo recuperato un totale di 5 x 106 cellule, 5 x 105 delle quali erano cellule tdTomato positive. Secondo l'analisi FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting) nella Figura 3, il nostro protocollo di dissociazione del pancreas supporta il recupero di più tipi di cellule, tra cui cellule acinose, cellule duttali, cellule endoteliali, fibroblasti, cellule immunitarie e periciti ad alta vitalità. Tuttavia, il rapporto effettivo tra il numero di cellule di ciascun tipo nel tessuto prima della dissociazione può essere diverso, dedotto dalle immagini a fluorescenza delle sezioni pancreatiche congelate che includono cellule tdTomato positive (Figura 2E). L'elevata vitalità ottenuta utilizzando il protocollo sopra descritto è dimostrata dall'analisi FACS (Figura 3) e dal conteggio delle cellule vive/morte effettuato utilizzando un emocitometro (Figura 3H).
Per ogni campione, abbiamo eseguito scRNA-seq e, coerentemente con l'analisi FACS, abbiamo confermato il rilevamento di tutti i tipi cellulari sopra menzionati (Figura 4A,B), in ciascuno dei tessuti resecati da tutti i punti temporali post-iniezione di tamoxifene. Abbiamo anche esaminato l'espressione della carbossipeptidasi 1 (Cpa1), che codifica per la carbossipeptidasi1. L'espressione di Cpa1 nelle cellule acinari è estremamente elevata e può indicare fino a che punto le cellule acinari sono state lisate durante la dissociazione, nonché la misura in cui hanno contaminato il trascrittoma di altri tipi di cellule. Abbiamo rilevato una contaminazione minima, come si può vedere nella Figura 4C,D. La dissociazione delicata si traduce anche in un'elevata vitalità che ci consente di seguire la selezione cellulare dei tipi di cellule desiderati per ulteriori esperimenti (Figura 3).
Insieme, la qualità del protocollo di dissociazione supporta diversi esperimenti di follow-up, tra cui scRNA-seq.
Figura 1: Schema del protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Isolamento delle cellule pancreatiche. (A) Una foto che mostra il pancreas (in rosso), il fegato e la milza del topo dopo aver aperto completamente la cavità addominale. (B) Lo stesso topo di cui al punto (A) dopo l'asportazione del pancreas. (C) La dissezione del pancreas. Il pancreas dopo la rimozione dall'animale (a sinistra). Il pancreas dopo le scissioni in piccoli pezzi (al centro). Separazione di fase dopo centrifugazione (a destra). (D) Monitoraggio delle cellule al microscopio per esaminare la vitalità di una singola cellula. Isolamento totale delle cellule pancreatiche primarie (20x). Grumi di cellule dopo 15 minuti di reazione enzimatica (a sinistra). Sospensione unicellulare dopo 25 minuti di reazione enzimatica (al centro). Ridotta vitalità cellulare dopo una lunga incubazione (a destra). (E) Immagini a fluorescenza di una sezione pancreatica congelata. Le cellule acinari sono tdTomato positive; Colorazione DAPI in blu (foto a 40x). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi FACS della sospensione unicellulare del carcinoma pancreatico . (A) Cellule tdTomato positive e negative. (B) Citometria a flusso di cellule acinose non ordinate (rosse) rispetto a cellule acinose ordinate (blu). (C,F) Cellule non colorate, APC e PB450. (D) Analisi FACS dopo colorazione con Anti-CD31, un marcatore delle cellule endoteliali. (E) Analisi FACS dopo colorazione con Anti-CD140b, un marcatore dei periciti. (G) Analisi FACS dopo colorazione con Anti-CD11c, un marcatore di cellule dendritiche e macrofagi. (H) Rapporto tra cellule vive e cellule morte in quattro diversi isolamenti di cellule del pancreas. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi dei dati scRNA-seq prodotti utilizzando il protocollo descritto in questo articolo. (A) UMAP che mostra scRNA-seq di un pancreas di topo in diversi momenti dopo l'iniezione di tamoxifene, come indicato nella parte destra del pannello. (B) I tipi di cellule sono stati determinati sulla base di marcatori noti. (C,D) Le cellule sono colorate in base al livello di espressione di Cpa1 (in C) o al livello di tdTomato (in D). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo articolo presentiamo un protocollo per la dissociazione del tessuto pancreatico. Il protocollo è semplice, facile da usare e fornisce uno strumento per isolare singole cellule vitali dal tessuto pancreatico in diverse fasi del processo di malignità, compresi i tumori solidi. In studi precedenti, diversi tipi di collagenasi sono stati utilizzati per digerire il pancreas 8,9. L'uso di una collagenasi molto potente, come la collagenasi D, si traduce in una grande popolazione di cellule immunitarie e una percentuale inferiore di cellule epiteliali. L'uso della collagenasi P consente una digestione pancreatica adatta al tessuto pancreatico intatto o tumorale.
Sulla base delle nostre osservazioni, tutti i tipi di cellule possono essere isolati. In precedenza abbiamo convalidato l'infiltrazione delle cellule T immunitarie, ad esempio, utilizzando l'immunoistochimica5; Riteniamo che il numero di cellule relative che abbiamo osservato nella nostra analisi sia un'approssimazione corretta alla rappresentazione effettiva delle cellule nel tessuto, ad eccezione delle cellule acinari che sono fragili e quindi sottorappresentate. Si consiglia di utilizzare l'immunoistochimica o la trascrittomica spaziale10,11,12 se è necessario disporre di proporzioni accurate dei tipi di cellule nel tessuto. Inoltre, abbiamo osservato che la dissociazione del tessuto da topi wild-type in assenza di espressione costitutivamente attiva di KRAS è più impegnativa e richiede un monitoraggio più frequente, per fermare la reazione enzimatica in tempo aggiungendo il 10% di FBS al tampone di lavaggio ed evitare la morte cellulare massiva. Ciò è anche coerente con la contaminazione da alcuni trascritti acinari molto abbondanti, come Cpa1, sebbene il nostro protocollo minimizzi questo problema.
L'isolamento cellulare può essere utilizzato per scRNA-seq, come abbiamo mostrato5, per la coltura di cellule o come materiale di partenza per organoidi, per esempio.
La necessità di tessuto fresco è un limite del metodo. Un approccio alternativo che si concentra sull'isolamento dei nuclei, il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo (sNuc-seq)13, è stato recentemente utilizzato per studiare i tumori PDAC da pazienti con una risoluzione a singola cellula11; in futuro, sarà interessante confrontare la qualità dei dati delle cellule epiteliali pancreatiche ottenute da sNuc-seq rispetto a scRNA-seq. È importante sottolineare che l'estrazione del nucleo non consente la coltura cellulare e l'ordinamento per arricchire per specifici tipi di cellule è estremamente impegnativo. Pertanto, il protocollo di dissociazione tissutale sarà utile in futuro per esperimenti scRNA-seq e per queste applicazioni aggiuntive.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi contrastanti.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il Dr. Avital Sarusi-Portuguez per l'aiuto nell'analisi dei dati e il Dr. Dror Kolodkin-Gal per l'assistenza nello stabilire il protocollo in uno studio precedente. Ringraziamo tutti i membri passati e presenti del laboratorio Parnas. Ringraziamo la Dott.ssa Gillian Kay e il Dott. Michael Kanovsky per il loro aiuto nell'editing. Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dalla sovvenzione della Israel Science Foundation (n. 526/18 O.P.), dal programma Alex U. Soyka e da una sovvenzione dell'Israel Cancer Research Fund (Research Career Development Award).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent or Resource | |||
| 70 µm nylon mesh | Corning | cat##431751 | |
| BSA | Sigma Aldrich | cat# A7906 | |
| Collagenase P | Roche | cat# 11213857001 | |
| Critical Commercial Assay | |||
| DAPI | Sigma Aldrich | cat#MBD0015 | |
| Dnase I | Roche | cat# 10104159001 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Fetal Bovine Serum South American | ThermoFisher | Cat#10270106 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Biological industries | cat#02-018-1A | |
| KRASLSL-G12D mice | Jackson Laboratory | JAX008179 | |
| MACS dead cells removal kit | Milteny Biotec | cat#130-090-101 | |
| PBS | Biological industries | cat#02-023-1A | |
| Ptf1a-CreER mice | Jackson Laboratory | JAX019378 | |
| Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX007908 | |
| Trypsin C-EDTA 0.05% | Biological industries | cat# 03-053-1A | |
| Trypsin inhibitor | Roche | cat#T6522 |
References
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