Summary
췌장 메타 플라스틱 세포는 췌장 종양을 일으키는 악성 세포의 전구체입니다. 그러나 온전한 생존 가능한 췌장 세포를 분리하는 것은 어렵습니다. 여기에서는 췌장 조직 해리를 위한 효율적인 방법을 제시합니다. 그런 다음 세포를 단일 세포 RNA 염기서열분석(scRNA-seq) 또는 2차원 또는 3차원 공동 배양에 사용할 수 있습니다.
Abstract
췌장에는 호르몬을 생산하고 분비하는 내분비계와 췌장의 약 90%를 차지하고 소화 효소를 생산하고 분비하는 세포를 포함하는 외분비계의 두 가지 주요 시스템이 있습니다. 소화 효소는 췌장 아시나 세포에서 생성되어 자이모겐(zymogen)이라고 하는 소포에 저장되었다가 췌관을 통해 십이지장으로 방출되어 대사 과정을 시작합니다. 아시나 세포에서 생성된 효소는 세포를 죽이거나 cell-free RNA를 분해할 수 있습니다. 또한 아시나 세포는 깨지기 쉬우며, 일반적인 해리 프로토콜은 많은 수의 죽은 세포와 cell-free 프로테아제 및 RNase를 초래합니다. 따라서 췌장 조직 소화의 가장 큰 과제 중 하나는 온전하고 생존 가능한 세포, 특히 아시나 세포를 회복하는 것입니다. 이 문서에 제시된 프로토콜은 이러한 요구 사항을 충족하기 위해 개발한 2단계 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 정상 췌장, 전악성 병변을 포함하는 췌장 또는 많은 수의 기질 및 면역 세포를 포함하는 췌장 종양을 소화하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
췌관 선암(PDAC)은 가장 공격적인 암 유형중 하나입니다 1. 임상적 증거는 PDAC가 KRAS 원발암유전자2의 돌연변이에 의해 수년에 걸쳐 아시나 세포를 포함한 외분비 시스템 세포에서 발생한다는 개념을 뒷받침합니다.
췌장 종양에는 다양한 세포 유형이 포함되며, 악성 세포는 종양 질량의 20%-50%에 불과하다는 것이 입증되었습니다3. 다양한 세포 유형이 상피 세포와 상호 작용하여 형질전환을 지원하며 종양 형성 및 성장을 촉진합니다. 초기 사건은 췌장 상피내 종양(PanIN)이라고 하는 미세한 병변을 유발하는 침상 상피화생을 유발하며, 경우에 따라 PDAC4로 발전할 수 있습니다.
이러한 상호 작용을 조사하고 중추적인 신호를 목표로 삼아야 합니다. 단일 세포 RNA 염기서열 분석(scRNA-seq)은 단일 세포 분해능으로 유전자 발현을 밝혀 상피 세포가 겪는 변화를 추적하여 췌장암 발병을 탐색할 수 있는 강력한 방법입니다.
단일 세포에 대한 조직 절개 및 분해는 scRNA-seq 실험의 첫 번째 단계입니다. 몇 가지 요인이 췌장 조직 소화를 특히 어렵게 만듭니다: i) 아시나 세포는 췌장의 90% 이상을 차지하고 아시나 세포는 RNA 기반 라이브러리의 품질을 떨어뜨리는 프로테아제 및 RNase를 포함한 많은 양의 소화 효소를 함유하고 있습니다. (ii) 아시나 세포는 매우 민감하며 표준 프로토콜을 사용하는 경우 용해될 수 있습니다. (iii) 아시나 세포는 매우 높은 수준에서 소수의 유전자를 발현합니다. 따라서 이러한 세포가 실험 중에 용해되면 다른 세포의 관찰된 유전자 발현 프로파일을 오염시킬 수 있습니다. (iv) 종양에서 회수된 췌장 조직은 탈형성(desmoplastic)이기 때문에 세포를 손상시키지 않고는 절개하기 어렵다. 따라서 모든 세포 유형의 높은 생존율을 유지하는 것이 필요하지만 아시나 세포의 많은 수와 감도는 복잡성을 더합니다. 이러한 요인은 scRNA-seq 실험에 필요한 것처럼 80% 이상 생존 가능하고 응집이 없는 단일 세포 현탁액을 달성하는 데 어려움을 초래합니다.
여기서는 빈번한 조직 모니터링과 함께 트립신 C와 콜라겐분해효소 P를 사용하는 프로토콜을 개발했습니다. 이는 scRNA-seq 실험 5,6의 성공을 지원하기 위해 높은 생존력을 유지하면서 단일 세포로의 해리를 지원합니다.
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Protocol
히브리 대학교(이스라엘 예루살렘)와 하다사 메디컬 센터(이스라엘 예루살렘)의 공동 윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)는 동물 복지를 위한 연구 프로토콜(MD-18-15417-5 "생쥐의 췌장암 조직 역학")을 승인했으며, 여기에 제시된 프로토콜은 동물 실험 및 연구에 대한 모든 관련 윤리 규정을 준수했습니다. 히브리 대학교는 국제 공인 기관인 실험실 동물 관리 평가 및 인증 협회입니다.
참고: 마우스 균주 스톡 #007908, 스톡 #019378 및 스톡 #008179는 Jackson의 실험실에서 수득하였다. PRT(크라스+/LSL-G12D; PTF1a-CREER입니다. Rosa26LSL-tdTomato) 마우스는 상기 균주를 교배하여 생성하였다. 생후 6주에서 15개월 사이의 남녀 생쥐가 연구에 사용되었다. 타목시펜은 분말을 옥수수 기름에 용해시켜 제조하였다. 성인 마우스 (6-8 주 나이, 여성 및 남성)는 400 mg/kg의 복용량으로 0 일과 2 일에 타목시펜을 피하 주사하고 주사 후 일주일에 두 번 검사했습니다. 종양이 내부에 위치했기 때문에 종양을 측정하는 것은 불가능했습니다. 따라서 윤리 프로토콜에 따라 비정상적인 임상 징후가 관찰되면 안락사를 수행했습니다. 마우스는 타목시펜 유도 후 다른 시점에서 이소플루란과 자궁경부 탈구를 사용하여 안락사시켰다.
1. 췌장 박리
참고: 추출 중 최적의 수율을 유지하고 우수한 세포 생존율을 보장하려면 신속한 해개가 중요합니다. 췌장 격리에 필요한 시간을 단축하려면 쥐를 안락사시키기 전에 모든 기구와 장비를 얼음 위에 준비해야 합니다.
- CO2 질식으로 마우스를 안락사시키고 자궁 경부 탈구를 사용하여 확인합니다. 이 단계부터 모든 절차는 멸균 해부 기구를 사용하여 수행해야 합니다.
- 마우스를 고정하고 복부에 70% 에탄올을 뿌립니다. 가위와 집게로 생식기 부위를 2.5cm의 V자 모양으로 절개하고 위쪽으로 진행하여 복강을 완전히 엽니다.
- 마우스의 왼쪽에서 위를 찾습니다. 비장 근처에 있는 췌장을 찾습니다. 두 개의 집게를 사용하여 위와 십이지장에서 췌장을 분리합니다(찢지 않음). 계속해서 췌장을 소장, 장, 회장에서 분리합니다.
- 췌장을 마우스의 오른쪽으로 이동합니다. 췌장과 흉강 사이의 나머지 연결부를 겸자로 분리하여 췌장과 부착된 비장을 완전히 분리합니다.
- 췌장을 제거하고 얼음 위의 페트리 접시에 펼쳐 검사를 받으십시오.
알림: 이 단계에서는 세포 오염을 방지하기 위해 췌장만 제거하고 장간막 지방 조직 또는 췌장과 함께 기타 인접 조직을 제거하지 않도록 주의해야 합니다.
2. 췌장의 효소 및 기계적 해리
- 다음 버퍼를 미리 준비합니다.
- 해리 완충액 1: 각 샘플에 대해 트립신 C 4mL + 인산염 완충 식염수(PBS) 6mL( 표 1 참조).
- 해리 완충액 2: Hanks의 균형 염 용액(HBSS) 9mL 1x; 4% 소 혈청 알부민(BSA); 콜라겐분해효소 P 1mL(10mg/mL); 트립신 억제제 200μL(10mg/mL); 및 200μL의 DNase I(10mg/mL)을 사용합니다( 표 1 참조).
- 세척 완충액: HBSS 1x 50mL; BSA 2g; 트립신 억제제 1mL(10mg/mL); 및 DNase 1 1 (10 mg/mL) 1 mL.
- 효소 활성 정지 용액: 5% 소 태아 혈청(FBS) 및 150g의 DNase I(0.2mg/mL)을 함유한 HBSS 1x.
- 얼음 위의 50mL 튜브에 췌장을 넣습니다. HBSS 1x의 10% FBS로 췌장을 헹굽니다. 지방 조직이 떠오르고 췌장이 가라앉습니다. 이것은 췌장에 여전히 붙어 있는 오염된 백색 지방 조직을 시각화하고 신속하게 제거하는 쉬운 방법입니다.
- 생쥐의 췌장 조직을 얼음 위에 5mL의 HBSS 1x가 들어 있는 멸균 페트리 접시에 옮깁니다. Noyes 가위와 메스를 사용하여 췌장을 1-3mm3의 작은 조각으로 자릅니다(그림 2A). 두 개 이상의 샘플이 있는 경우 샘플은 10% FBS/HBSS 1x의 얼음 위에 보관해야 합니다.
- 조직을 원심분리 튜브로 옮깁니다. 4°C에서 350 x g 으로 5분 동안 원심분리기 상층액을 흡인하고 폐기하여 세포 조각과 혈액 세포를 제거합니다.
- 교반(180rpm)으로 37°C에서 10분 동안 0.02% 트립신 C-0.05% EDTA를 포함하는 해리 완충액 1에 조각을 재현탁시킵니다. 즉시 10% FBS/Dulbecco의 변형 Eagle's medium(DMEM)으로 씻으십시오. 4°C에서 350g에서 5분 동안 원심 분리합니다.
- 펠릿을 10mL의 세척 완충액에 다시 현탁시키고 다음 해리 단계 전에 4°C에서 5분 동안 350 x g 에서 원심분리하여 다시 세척합니다.
- 췌장을 해리 완충액 2에서 37°C에서 15분 동안 교반(180rpm)하여 배양합니다.
- 15분 후 크기가 줄어드는 멸균 피펫(25, 10 및 5mL 혈청학적 피펫)에서 췌장 절편을 위아래로 세게 피펫팅하여 기계적 해리를 10회 수행하고 37°C로 되돌립니다.
- 추가 5분 후 기계적 해리를 반복하고 광학 현미경을 사용하여 단일 셀 현탁액의 양에 따라 해리를 모니터링합니다. 일반적으로 이 단계에서 현탁액의 90% 미만이 분리된 단일 세포로 구성된 경우 더 긴 배양 시간이 필요합니다. 트리판 블루를 사용하여 세포 생존율을 모니터링하십시오.
- 배양을 계속하고 샘플을 채취하여 5분마다 해리를 감지합니다.
참고: 총 배양 시간은 조직에 따라 다르며 샘플마다 다를 수 있습니다. 배양 및 조직 해리는 세포의 90%가 단일 세포로 분리되거나 생존율의 감소가 감지될 때 종료되어야 합니다.
- 췌장 조직이 잘 해리된 후(췌장 조각의 소실 및 용액의 탁도 증가에 해당)(그림 2), 4°C에서 5분 동안 효소 활성 정지 용액으로 두 번 세척하여 효소 반응을 중지합니다. 이 단계에서 셀 서스펜션을 얼음 위에 유지하십시오.
- 세포 현탁액을 70μm 나일론 메쉬에 통과시키고 현미경으로 세포 생존율을 확인합니다. 나일론 메쉬의 크기가 작을수록 세포 생존율이 감소할 수 있습니다.
- 펠릿을 재현탁하고 5-10mL의 얼음처럼 차가운 완충 세척액으로 세척합니다. 셀을 셉니다.
- 여러 적혈구가 관찰되면 적혈구 용해 완충액으로 실온에서 2분 동안 치료합니다. 덩어리가 관찰되는 경우 2.5단계에서 설명한 대로 샘플을 트립신으로 다시 처리해야 합니다. 현미경으로 트리판 블루로 생존율을 검출하고, 생존율이 80% 미만인 경우 MACS MS 컬럼이 있는 MACS(Magnetic-Activated Cell Sorting) 죽은 세포 제거 키트를 사용하여 살아있는 세포를 분리해야 합니다( 표 1 참조).
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Representative Results
최근 발표된 연구5에서는 위에서 설명한 프로토콜을 적용하여 마우스 모델을 사용하여 PDAC 개발의 초기 단계를 탐색했습니다. 마우스는 타목시펜 주입 후 아시나 세포에서 구성적으로 활성화된 KRAS의 발현을 허용하는 카세트 Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato7을 포함하도록 유전자 조작되었습니다.
자궁경부 탈구 후(마우스 윤리 프로토콜에 따라) 췌장을 절제하고, 위에서 설명한 프로토콜을 적용하였다( 그림 1 및 프로토콜 참조).
해리 프로토콜을 최적화하기 위해, 트립신 C로 조직의 사전 배양을 하거나 하지 않고 해리를 수행했습니다. 트립신 C를 사용한 사전 배양은 생존력에 영향을 미치지 않고 해리를 가속화하는 것으로 밝혀졌습니다. 또한, 콜라겐분해효소 D, 콜라겐분해효소 1a, 콜라겐분해효소 P를 포함하는 상이한 콜라겐분해효소를 시도하였다( 표 1 참조). 콜라겐 분해 효소 D를 사용하면 세포가 대량으로 죽는 것으로 밝혀졌으며, 실제로이 콜라겐 분해 효소를 사용한 다른 연구에서는 아시나 세포의 비율이 매우 작았습니다8. 콜라겐 분해 효소 1a의 사용은 콜라겐 분해 효소 1a로 90 분 배양 후에도 조직이 해리되지 않았기 때문에 예상 한 결과를 제공하지 못했습니다. 콜라겐분해효소 P만이 조직을 해리시키고 모든 세포 유형의 높은 생존력을 유지할 수 있게 해주었습니다.
이 실험은 타목시펜 주입 후 7개의 다른 시점에 반복되었습니다. 침근-관(acinar-to-ductal) 화생 및 PanIN 병변 형성과 동시에 섬유아세포를 포함한 기질세포와 면역세포가 축적되어 조직이 탈형성되고 뻣뻣해졌습니다. 타목시펜 주입 후 다양한 시점을 통해 여러 가지 조직 상태에서 프로토콜을 검사하고 상피, 기질 및 면역 세포의 회복을 측정할 수 있었습니다.
쥐의 사진은 그림 2A에 나와 있고 분리된 췌장, 푹신한 조직인 췌장은 그림 2C에 나와 있습니다. 조직의 붉은 색은 아시나 세포에서 tdTomato의 발현으로 인해 발생합니다. 이 프로토콜은 모든 조직 상태 및 인간 샘플에 성공적으로 사용되었습니다. 그러나 트립신과 콜라겐분해효소의 배양 시간은 다를 수 있습니다. 따라서 샘플을 모니터링하고 현미경으로 몇 분마다 조직과 세포의 해리를 관찰하는 것이 중요합니다. 해리 프로토콜의 초기 단계에서는 분리된 세포의 수가 적고 덩어리가 많았습니다(그림 2D, 왼쪽). 우리의 목표는 그림 2D, 가운데와 같이 분리된 생존 가능한 세포를 달성하고 생존 가능한 세포의 수가 감소하는 것을 방지하는 것이었습니다(그림 2D, 오른쪽).
배양 시간이 길어지면 세포의 생존력이 감소한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 0.5 x 10 cm3 크기의 조직에서 시작하여 총 5 x 106 세포를 회수했으며 그 중 5 x 105 는 tdTomato 양성 세포였습니다. 그림 3의 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석에 따르면, 당사의 췌장 해리 프로토콜은 생존율이 높은 아시나 세포, 유관 세포, 내피 세포, 섬유아세포, 면역 세포 및 주위 세포를 포함한 여러 세포 유형의 회수를 지원합니다. 그러나 해리 전 조직의 각 유형의 세포 수 간의 실제 비율은 td토마토 양성 세포를 포함하는 췌장 동결 절편의 형광 이미지에서 추론할 수 있습니다(그림 2E). 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 달성한 높은 생존율은 FACS 분석(그림 3)과 혈구계를 사용하여 수행된 살아있는 세포/죽은 세포 계수(그림 3H)에 의해 표시됩니다.
각 샘플에 대해 scRNA-seq를 수행했으며 FACS 분석과 일관되게 타목시펜 주입 후 모든 시점에서 절제된 각 조직에서 위에서 언급한 모든 세포 유형(그림 4A,B)의 검출을 확인했습니다. 또한 카르복시펩티다아제1을 암호화하는 카르복시펩티다아제 1(Cpa1)의 발현도 조사했습니다. acinar 세포에서 Cpa1 발현은 매우 높으며 acinar 세포가 해리 중에 용해된 정도와 다른 세포 유형의 전사체를 오염시킨 정도를 나타낼 수 있습니다. 그림 4C,D에서 볼 수 있듯이 최소한의 오염을 감지했습니다. 또한 부드러운 해리는 추가 실험을 위해 원하는 세포 유형의 세포 분류를 추적할 수 있는 높은 생존력을 제공합니다(그림 3).
해리 프로토콜의 품질은 scRNA-seq를 포함한 다양한 후속 실험을 지원합니다.
그림 1: 프로토콜의 체계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 췌장 세포 분리. (A) 복강을 완전히 연 후 쥐의 췌장(빨간색), 간, 비장을 보여주는 사진. (B) 췌장을 제거한 후 (A)와 동일한 마우스. (C) 췌장 해부. 동물에서 제거한 후의 췌장(왼쪽). 췌장은 작은 조각(가운데)으로 분열된 후입니다. 원심분리 후 상 분리(오른쪽). (D) 단일 세포 생존력을 검사하기 위해 현미경으로 세포를 모니터링합니다. 총 원발성 췌장 세포 분리(20배). 효소 반응 15분 후 세포 덩어리(왼쪽). 효소 반응 25분 후 단세포 현탁액(가운데). 긴 배양 후 세포 생존율 감소(오른쪽). (E) 얼어붙은 췌장 절편의 형광 이미지. Acinar 세포는 td토마토 양성입니다. 파란색의 DAPI 염색(40x 사진). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 췌장암의 단세포 현탁액에 대한 FACS 분석 . (A) td토마토 양성 및 음성 세포. (B) 분류되지 않은(빨간색) 대 분류된(파란색) 아시나 세포의 유세포 분석. (씨,에프) 염색되지 않은 세포, APC 및 PB450. (D) 내피 세포의 마커인 Anti-CD31로 염색한 후 FACS 분석. (E) pericyte의 marker인 Anti-CD140b로 염색한 후 FACS 분석. (G) 수지상세포 및 대식세포의 마커인 Anti-CD11c로 염색한 후 FACS 분석. (H) 4개의 서로 다른 췌장 세포 분리에서 살아있는 세포와 죽은 세포의 비율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 현재 기사에서 설명하는 프로토콜을 사용하여 생성된 scRNA-seq 데이터 분석. (A) 패널의 오른쪽에 표시된 바와 같이 타목시펜 주입 후 다른 시점에서 마우스 췌장의 scRNA-seq를 보여주는 UMAP. (B) 세포 유형은 공지된 마커를 기반으로 결정하였다. (씨,디) 세포는 Cpa1의 발현 수준( C) 또는 tdTomato의 수준( D)에 따라 채색됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 글에서는 췌장 조직 해리를 위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 간단하고 사용하기 쉬우며 고형 종양을 포함한 악성 종양 과정의 여러 단계에서 췌장 조직에서 생존 가능한 단일 세포를 분리하는 도구를 제공합니다. 이전 연구에서는 췌장을 소화하기 위해 다양한 유형의 콜라겐 분해 효소가 사용되었습니다 8,9. 콜라겐분해효소 D와 같은 매우 강력한 콜라겐분해효소를 사용하면 면역 세포가 많아지고 상피 세포의 비율이 낮아집니다. 콜라겐분해효소 P를 사용하면 췌장이 온전하거나 종양이 있는 췌장 조직에 적합한 소화가 가능합니다.
관찰 결과, 모든 세포 유형을 분리할 수 있습니다. 우리는 이전에 면역조직화학(immunohistochemistry)을 사용하여 면역 T 세포의 침윤을 검증했습니다5; 우리는 분석에서 관찰한 상대적인 세포 수가 연약하여 과소 대표된 ACINAR 세포를 제외하고는 조직 내 세포의 실제 표현에 대한 적절한 근사치라고 믿습니다. 조직 내 세포 유형의 정확한 비율이 필요한 경우 면역조직화학(immunohistochemistry) 또는 공간 전사체학(spatial transcriptomics)10,11,12을 사용하는 것이 좋습니다. 또한, 구성적으로 활성화된 KRAS 발현이 없는 야생형 마우스에서 조직을 해리하는 것은 세척 완충액에 10% FBS를 첨가하여 효소 반응을 적시에 중지하고 대량 세포 사멸을 방지하기 위해 더 어렵고 더 빈번한 모니터링이 필요하다는 것을 관찰했습니다. 이는 또한 Cpa1과 같은 일부 매우 풍부한 acinar transcripts의 오염과 일치하지만 당사 프로토콜은 이 문제를 최소화합니다.
세포 분리는5에서 보여드린 것처럼 scRNA-seq, 세포 배양 또는 오가노이드의 출발 물질로 사용할 수 있습니다.
신선한 조직의 필요성은 이 방법의 한 가지 한계입니다. 핵의 분리에 초점을 맞춘 대안적 접근법인 단핵 RNA 염기서열분석(single-nucleus RNA sequencing, sNuc-seq)13은 최근 단세포 분해능(single-cell resolution)11으로 환자로부터 PDAC 종양을 조사하는 데 사용되었다. 앞으로 sNuc-seq에서 얻은 췌장 상피 세포의 데이터 품질을 scRNA-seq와 비교하는 것이 흥미로울 것입니다. 중요한 것은 핵 추출은 세포 배양을 허용하지 않으며 특정 세포 유형에 대한 농축을 위한 분류가 매우 어렵다는 것입니다. 따라서 조직 해리 프로토콜은 향후 scRNA-seq 실험 및 이러한 추가 응용 분야에 유용할 것입니다.
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Disclosures
저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
데이터 분석에 도움을 주신 Avital Sarusi-Portuguez 박사와 이전 연구에서 프로토콜을 확립하는 데 도움을 주신 Dr. Dr. Kolodkin-Gal에게 감사드립니다. 파르나스 연구소의 모든 과거와 현재 구성원에게 감사드립니다. 편집에 도움을 주신 Gillian Kay 박사님과 Michael Kanovsky 박사님께 감사드립니다. 이 프로젝트는 이스라엘 과학 재단 보조금(No. 526/18 O.P.), Alex U. Soyka 프로그램 및 이스라엘 암 연구 기금(Research Career Development Award)의 보조금을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent or Resource | |||
| 70 µm nylon mesh | Corning | cat##431751 | |
| BSA | Sigma Aldrich | cat# A7906 | |
| Collagenase P | Roche | cat# 11213857001 | |
| Critical Commercial Assay | |||
| DAPI | Sigma Aldrich | cat#MBD0015 | |
| Dnase I | Roche | cat# 10104159001 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Fetal Bovine Serum South American | ThermoFisher | Cat#10270106 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Biological industries | cat#02-018-1A | |
| KRASLSL-G12D mice | Jackson Laboratory | JAX008179 | |
| MACS dead cells removal kit | Milteny Biotec | cat#130-090-101 | |
| PBS | Biological industries | cat#02-023-1A | |
| Ptf1a-CreER mice | Jackson Laboratory | JAX019378 | |
| Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX007908 | |
| Trypsin C-EDTA 0.05% | Biological industries | cat# 03-053-1A | |
| Trypsin inhibitor | Roche | cat#T6522 |
References
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