Summary
As células metaplásicas pancreáticas são precursoras de células malignas que dão origem a tumores pancreáticos. No entanto, isolar células pancreáticas viáveis intactas é um desafio. Apresentamos aqui um método eficiente para dissociação do tecido pancreático. As células podem então ser usadas para sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) ou para co-cultivo bidimensional ou tridimensional.
Abstract
O pâncreas inclui dois sistemas principais: o sistema endócrino, que produz e secreta hormônios, e o sistema exócrino, que responde por aproximadamente 90% do pâncreas e inclui células que produzem e secretam enzimas digestivas. As enzimas digestivas são produzidas nas células acinares pancreáticas, armazenadas em vesículas chamadas zimogênicos, e são então liberadas no duodeno através do ducto pancreático para iniciar processos metabólicos. As enzimas produzidas pelas células acinares podem matar células ou degradar o RNA livre de células. Além disso, as células acinares são frágeis, e protocolos comuns de dissociação resultam em um grande número de células mortas e proteases e RNases livres de células. Portanto, um dos maiores desafios na digestão do tecido pancreático é a recuperação de células intactas e viáveis, especialmente as células acinares. O protocolo apresentado neste artigo mostra um método em duas etapas que desenvolvemos para atender a essa necessidade. O protocolo pode ser usado para digerir pancreata normal, pancreata que inclui lesões pré-malignas ou tumores pancreáticos que incluem um grande número de células estromais e imunes.
Introduction
O adenocarcinoma ductal de pâncreas (ADP) é um dos tipos de câncer maisagressivos1. Evidências clínicas apoiam a noção de que o PDAC se desenvolve a partir de células do sistema exócrino, incluindo células acinares, ao longo de muitos anos, impulsionado por mutações no proto-oncogene KRAS2.
Os tumores pancreáticos incluem muitos tipos celulares diferentes, e tem sido demonstrado que as células malignas representam apenas 20%-50% da massatumoral3. Diferentes tipos celulares interagem com as células epiteliais, suportam sua transformação e aumentam a formação e o crescimento do tumor. Eventos precoces causam metaplasia acinar, que dá origem a lesões microscópicas denominadas neoplasias intraepiteliais pancreáticas (PanINs), que podem, em alguns casos, evoluir para ADPD4.
Há uma necessidade crítica de investigar essas interações e direcionar sinais centrais. O sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) é um método poderoso que revela a expressão gênica em uma resolução de célula única, rastreando assim as mudanças que as células epiteliais sofrem, permitindo assim a exploração do desenvolvimento do câncer de pâncreas.
A dissecção e digestão do tecido para células isoladas é a primeira etapa de um experimento de scRNA-seq. Vários fatores tornam a digestão do tecido pancreático especialmente desafiadora: i) as células acinares são responsáveis por mais de 90% do pâncreas e as células acinares contêm grandes quantidades de enzimas digestivas, incluindo proteases e RNases que reduzem a qualidade das bibliotecas baseadas em RNA; (ii) as células acinares são muito sensíveis e podem lisar se forem usados protocolos padrão; (iii) as células acinares expressam um pequeno número de genes em níveis muito elevados. Portanto, se essas células forem lisadas durante o experimento, isso pode contaminar o perfil de expressão gênica observado de outras células; (iv) o tecido pancreático recuperado dos tumores é desmoplásico, dificultando a dissecação sem danificar as células. Assim, embora seja necessária a manutenção de alta viabilidade de todos os tipos celulares, o grande número e a sensibilidade das células acinares adicionam complexidade adicional. Esses fatores impõem dificuldades na obtenção de uma suspensão unicelular que seja mais de 80% viável e não tenha aglomerados, como é exigido para experimentos de scRNA-seq.
Neste trabalho, desenvolvemos um protocolo utilizando tripsina C e colagenase P, além de monitoramento tecidual frequente. Isso suporta a dissociação para células únicas, mantendo alta viabilidade para apoiar o sucesso dos experimentos de scRNA-seq 5,6.
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Protocol
O comitê de ética conjunto (Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais) da Universidade Hebraica (Jerusalém, Israel) e do Centro Médico Hadassah (Jerusalém, Israel) aprovou o protocolo de estudo para bem-estar animal (MD-18-15417-5 "Tissue dynamics in pancreatic cancer in mouse"), e o protocolo aqui apresentado cumpriu todas as normas éticas relevantes para testes e pesquisas em animais. A Universidade Hebraica é uma associação para avaliação e acreditação de cuidados com animais de laboratório instituto internacional credenciado.
NOTA: Os estoques de linhagem de camundongos #007908, estoque #019378 e estoque #008179 foram obtidos do laboratório de Jackson. PRT (Kras+/LSL-G12D; Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato) foram criados cruzando as cepas acima. Camundongos de ambos os sexos, entre 6 semanas e 15 meses de idade, foram utilizados para o estudo. O tamoxifeno foi preparado pela dissolução do pó em óleo de milho. Camundongos adultos (6-8 semanas de idade, fêmeas e machos) foram injetados com tamoxifeno por via subcutânea nos dias 0 e 2 na dose de 400 mg/kg e examinados duas vezes por semana após a injeção. Não foi possível mensurar os tumores por estarem localizados internamente; portanto, a eutanásia foi realizada se sinais clínicos anormais fossem observados de acordo com o protocolo ético. Os camundongos foram eutanasiados em diferentes momentos após a indução com tamoxifeno, utilizando isoflurano e deslocamento cervical.
1. Dissecção pancreática
NOTA: Para um rendimento ideal durante a extracção e para garantir uma boa viabilidade celular, a dissecção rápida é crítica. Para encurtar o tempo necessário para o isolamento do pâncreas, todos os instrumentos e equipamentos devem estar prontos no gelo antes da eutanásia do rato.
- Eutanásia do camundongo por asfixia por CO2 e verificação por deslocamento cervical. A partir desta etapa, todos os procedimentos devem ser realizados com instrumentos dissecadores estéreis.
- Fixe o rato e borrife o abdómen com etanol a 70%. Faça uma incisão em forma de V de 2,5 cm na área genital com tesoura e pinça e prossiga para cima para abrir totalmente a cavidade abdominal.
- Localize o estômago no lado esquerdo do mouse. Localize o pâncreas, que está perto do baço. Separe o pâncreas do estômago e duodeno usando duas pinças (sem rasgar). Continue e separe o pâncreas do intestino delgado, jejuno e íleo.
- Mova o pâncreas para o lado direito do mouse. Separe as conexões restantes entre o pâncreas e a cavidade torácica com pinças para desprender completamente o pâncreas e o baço aderido.
- Retire o pâncreas e espalhe-o para exame em uma placa de Petri sobre gelo.
NOTA: Deve-se tomar cuidado durante esta etapa para remover apenas o pâncreas, e não remover o tecido adiposo mesentérico ou outro tecido adjacente juntamente com o pâncreas, para evitar a contaminação celular.
2. Dissociação enzimática e mecânica do pâncreas
- Prepare os seguintes buffers com antecedência.
- Tampão de dissociação 1: 4 ml de tripsina C + 6 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) (ver Tabela 1) para cada amostra.
- Tampão de dissociação 2: 9 mL de solução salina balanceada de Hanks (HBSS) 1x; 4% de albumina de soro bovino (BSA); 1 mL de colagenase P (10 mg/mL); 200 μL de inibidor de tripsina (10 mg/mL); e 200 μL de DNase I (10 mg/mL) ( Tabela 1).
- Tampão de lavagem: 50 mL de HBSS 1x; 2 g de BSA; 1 mL de inibidor de tripsina (10 mg/mL); e 1 mL de DNase 1 (10 mg/mL).
- Solução de parada de atividade enzimática: HBSS 1x contendo 5% de soro fetal bovino (SFB) e 150 g de DNase I (0,2 mg/mL).
- Coloque o pâncreas em um tubo de 50 mL sobre gelo. Enxaguar o pâncreas em FBS a 10% em HBSS 1x. O tecido gorduroso flutuará e o pâncreas afundará. Esta é uma maneira fácil de visualizar e remover rapidamente o tecido adiposo branco contaminante ainda aderido ao pâncreas.
- Transfira o tecido pancreático de camundongo para uma placa de Petri estéril contendo 5 mL de HBSS 1x em gelo. Cortar o pâncreas em pequenos pedaços de 1 a 3 mm3 com tesoura Noyes e bisturi (Figura 2A). No caso de mais de uma amostra, as amostras devem ser mantidas em gelo em FBS/HBSS 1x a 10%.
- Transfira os tecidos para um tubo de centrífuga. Centrifugar a 350 x g a 4 °C durante 5 min. Aspirar e descartar o sobrenadante para remover fragmentos celulares e células sanguíneas.
- Ressuspender as peças em tampão de dissociação 1 contendo 0,02% de tripsina C-0,05% EDTA por 10 min a 37 °C com agitação (180 rpm). Lavar imediatamente com 10% de FBS/meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM). Centrifugar durante 5 min a 350 g a 4 °C.
- Lavar novamente ressuspendendo o pellet em 10 mL de tampão de lavagem e centrifugando a 350 x g por 5 min a 4 °C antes da próxima etapa de dissociação.
- Incubar o pâncreas em tampão de dissociação 2 durante 15 min a 37 °C com agitação (180 rpm).
- Após 15 min, realizar dissociação mecânica pipetando vigorosamente os fragmentos pancreáticos para cima e para baixo em pipetas estéreis de tamanho decrescente (pipetas sorológicas de 25, 10 e 5 mL) 10 vezes e trazer de volta a 37 °C.
- Após mais 5 min, repetir a dissociação mecânica e utilizar microscopia óptica para monitorar a dissociação de acordo com a quantidade de suspensão unicelular. Normalmente, se nesta fase, menos de 90% da suspensão consiste em células isoladas únicas, um tempo de incubação mais longo é necessário. Use o azul de tripano para monitorar a viabilidade celular.
- Continue com a incubação e colete amostras para detectar a dissociação a cada 5 min.
NOTA: O tempo total de incubação depende do tecido e pode variar entre as amostras. A incubação e dissociação tecidual deve terminar quando 90% das células são separadas em células únicas ou quando uma redução na viabilidade é detectada.
- Após a dissociação do tecido pancreático (correspondendo ao desaparecimento dos fragmentos pancreáticos e ao aumento da turbidez da solução) (Figura 2), interromper a reação enzimática lavando duas vezes com a solução de parada de atividade enzimática por 5 min a 4 °C. A partir desta etapa, mantenha a suspensão da célula no gelo.
- Passar a suspensão celular através de uma tela de nylon de 70μm e verificar a viabilidade celular ao microscópio. Tamanhos menores de tela de nylon podem reduzir a viabilidade celular.
- Ressuspenda e lave o pellet com 5-10 mL de solução tamponada gelada. Conte as células.
- Se forem observados vários glóbulos vermelhos, trate as células com um tampão de lise de glóbulos vermelhos durante 2 minutos à temperatura ambiente. Nos casos em que se observam aglomerações, a amostra deve ser novamente tratada com tripsina, conforme descrito na etapa 2.5. A viabilidade é detectada com azul de tripano ao microscópio e, se a viabilidade for inferior a 80%, as células vivas devem ser isoladas usando o kit de remoção de células mortas de classificação de células ativadas por magnetismo (MACS) com colunas MACS MS (ver Tabela 1).
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Representative Results
Em um trabalho publicadorecentemente5, aplicamos o protocolo descrito acima para explorar os estágios iniciais do desenvolvimento do PDAC usando um modelo de camundongo. O camundongo foi geneticamente modificado para incluir as Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato7, que permitem a expressão de KRAS constitutivamente ativo em células acinares após injeção de tamoxifeno.
Após a luxação cervical (de acordo com o protocolo ético do camundongo), o pâncreas foi ressecado, e o protocolo descrito acima foi aplicado (ver Figura 1 e Protocolo).
Para otimizar o protocolo de dissociação, a dissociação foi realizada com ou sem pré-incubação do tecido com tripsina C. Verificou-se que a pré-incubação com tripsina C acelerou a dissociação sem afetar a viabilidade. Além disso, diferentes colagenases, incluindo colagenase D, colagenase 1a e colagenase P, foram testadas (ver Tabela 1). Verificou-se que o uso da colagenase D resultou em morte celular maciça e, de fato, em outros estudos que utilizaram essa colagenase, a fração de células acinares era muito pequena8. O uso da colagenase 1a também não proporcionou os resultados esperados, pois mesmo após 90 min de incubação com colagenase 1a, o tecido não foi dissociado. Somente a colagenase P nos permitiu dissociar o tecido e manter alta viabilidade de todos os tipos celulares.
Esses experimentos foram repetidos em sete momentos diferentes após a injeção de tamoxifeno. Simultaneamente à metaplasia acinar-ductal e à formação de lesão PanIN, houve acúmulo de células estromais e imunes, incluindo fibroblastos, e o tecido tornou-se desmoplásico e rígido. Os diferentes momentos pós-injeção de tamoxifeno permitiram examinar o protocolo sob vários estados teciduais diferentes e medir a recuperação de células epiteliais, estromais e imunes.
Uma foto de um camundongo é mostrada na Figura 2A e o pâncreas isolado, um tecido fofo, é mostrado na Figura 2C. A coloração vermelha do tecido resulta da expressão de tdTomato nas células acinares. O protocolo foi utilizado com sucesso em todos os estados teciduais e com amostras humanas. No entanto, os tempos de incubação com tripsina e colagenase podem variar. Portanto, é importante monitorar a amostra e observar a dissociação da viabilidade tecidual e celular a cada poucos minutos sob o microscópio. Em um estágio inicial do protocolo de dissociação, havia baixo número de células isoladas e grande número de aglomerados (Figura 2D, esquerda). Nosso objetivo foi obter células viáveis isoladas, como mostrado na Figura 2D, meio, e evitar uma redução no número de células viáveis (Figura 2D, à direita).
É importante notar que tempos de incubação mais longos reduziram a viabilidade das células. A partir de um tecido de 0,5 x 10 cm3 , recuperamos um total de 5 x 106 células, das quais 5 x 105 eram células tdTomato positivas. De acordo com a análise de classificação celular ativada por fluorescência (FACS) na Figura 3, nosso protocolo de dissociação do pâncreas suporta a recuperação de vários tipos celulares, incluindo células acinares, células ductais, células endoteliais, fibroblastos, células imunes e pericitos com alta viabilidade. No entanto, a relação real entre o número de células de cada tipo no tecido antes da dissociação pode ser diferente, inferida a partir das imagens de fluorescência de cortes pancreáticos congelados que incluem células tdTomato positivas (Figura 2E). A alta viabilidade obtida com o protocolo detalhado acima é demonstrada pela análise da FACS (Figura 3) e pela contagem de células vivas/células mortas realizada por meio de um hemocitômetro (Figura 3H).
Para cada amostra, realizamos scRNA-seq e, de acordo com a análise FACS, confirmamos a detecção de todos os tipos celulares acima mencionados (Figura 4A,B), em cada um dos tecidos ressecados de todos os momentos pós-injeção de tamoxifeno. Também examinamos a expressão da carboxipeptidase 1 (Cpa1), que codifica a carboxipeptidase1. A expressão de Cpa1 em células acinares é extremamente alta e pode indicar até que ponto as células acinares foram lisadas durante a dissociação, bem como o quanto elas contaminaram o transcriptoma de outros tipos celulares. Detectou-se contaminação mínima, como pode ser observado na Figura 4C,D. A dissociação suave também resulta em alta viabilidade que nos permite acompanhar com a triagem celular dos tipos celulares desejados para experimentos adicionais (Figura 3).
Em conjunto, a qualidade do protocolo de dissociação suporta diferentes experimentos de acompanhamento, incluindo scRNA-seq.
Figura 1: Esquema do protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Isolamento das células pancreáticas. (A) Uma foto mostrando o pâncreas (em vermelho), fígado e baço do camundongo após a abertura total da cavidade abdominal. (B) O mesmo camundongo que em (A) após a remoção do pâncreas. (C) A dissecção do pâncreas. O pâncreas após a remoção do animal (esquerda). O pâncreas após a clivagem em pequenos pedaços (meio). Separação de fases após centrifugação (direita). (D) Monitoramento das células ao microscópio para examinar a viabilidade unicelular. Isolamento de células pancreáticas primárias totais (20x). Aglomerados de células após 15 min de reação enzimática (esquerda). Suspensão unicelular após 25 min de reação enzimática (meio). Viabilidade celular reduzida após uma longa incubação (direita). (E) Imagens de fluorescência de um corte pancreático congelado. As células acinares são tdTomato positivas; Coloração DAPI em azul (foto a 40x). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise FACS da suspensão unicelular do câncer de pâncreas . (A) tdTomate células positivas e negativas. (B) Citometria de fluxo de células acinares não selecionadas (vermelhas) versus unidas (azuis). (C,F) Células não coradas, APC e PB450. (D) Análise da FACS após coloração com Anti-CD31, marcador de células endoteliais. (E) Análise da FACS após coloração com Anti-CD140b, marcador de pericitos. (G) Análise da FACS após coloração com Anti-CD11c, marcador de células dendríticas e macrófagos. (H) Proporção de células vivas e células mortas em quatro diferentes isolamentos de células do pâncreas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise dos dados de scRNA-seq que foram produzidos usando o protocolo que descrevemos no presente artigo. (A) UMAP mostrando scRNA-seq de um pâncreas de camundongo em diferentes momentos após a injeção de tamoxifeno, conforme indicado no lado direito do painel. (B) Os tipos celulares foram determinados com base em marcadores conhecidos. (C,D) As células são coloridas de acordo com o nível de expressão de Cpa1 (em C) ou o nível de tdTomato (em D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste artigo, apresentamos um protocolo para dissociação do tecido pancreático. O protocolo é simples, fácil de usar e fornece uma ferramenta para isolar células únicas viáveis do tecido pancreático em diferentes estágios durante o processo de malignidade, incluindo tumores sólidos. Em estudos anteriores, diferentes tipos de colagenases foram utilizados para digerir o pâncreas 8,9. O uso de uma colagenase muito potente, como a colagenase D, resulta em uma grande população de células imunes e uma menor porcentagem de células epiteliais. O uso de colagenase P permite a digestão pancreática que é adequada para o tecido pancreático intacto ou tumoral.
Com base em nossas observações, todos os tipos celulares podem ser isolados. Validamos previamente a infiltração de células T imunes, por exemplo, usando imunohistoquímica5; Acreditamos que o número relativo de células que observamos em nossa análise é uma aproximação adequada à representação real das células no tecido, exceto para as células acinares que são frágeis e, portanto, estavam sub-representadas. Recomenda-se o uso de imunohistoquímica ou transcriptômica espacial10,11,12 se houver necessidade de proporções precisas de tipos celulares no tecido. Além disso, observamos que a dissociação do tecido de camundongos selvagens na ausência de expressão de KRAS constitutivamente ativa é mais desafiadora e requer monitoramento mais frequente, para interromper a reação enzimática a tempo, adicionando 10% de FBS ao tampão de lavagem e evitar a morte celular maciça. Isso também é consistente com a contaminação de alguns transcritos acinares altamente abundantes, como Cpa1, embora nosso protocolo minimize esse problema.
O isolamento celular pode ser usado para scRNA-seq, como mostramos5, para cultivo de células, ou como material de partida para organoides, por exemplo.
A necessidade de tecido fresco é uma limitação do método. Uma abordagem alternativa que se concentra no isolamento de núcleos, o sequenciamento de RNA de núcleo único (sNuc-seq)13, foi recentemente utilizada para investigar tumores PDAC de pacientes com resoluçãounicelular11; no futuro, será interessante comparar a qualidade dos dados das células epiteliais pancreáticas obtidas do sNuc-seq em comparação com o scRNA-seq. É importante ressaltar que a extração de núcleo não permite o cultivo de células, e a classificação para enriquecer para tipos celulares específicos é extremamente desafiadora. Portanto, o protocolo de dissociação tecidual será útil no futuro para experimentos de scRNA-seq e para essas aplicações adicionais.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Avital Sarusi-Portuguez pela ajuda na análise dos dados e ao Dr. Dror Kolodkin-Gal pelo auxílio no estabelecimento do protocolo em um estudo anterior. Agradecemos a todos os membros passados e atuais do laboratório Parnas. Agradecemos à Dra. Gillian Kay e ao Dr. Michael Kanovsky pela ajuda na edição. Este projeto recebeu financiamento da bolsa da Israel Science Foundation (No. 526/18 O.P.), do Programa Alex U. Soyka e uma bolsa do Israel Cancer Research Fund (Research Career Development Award).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent or Resource | |||
| 70 µm nylon mesh | Corning | cat##431751 | |
| BSA | Sigma Aldrich | cat# A7906 | |
| Collagenase P | Roche | cat# 11213857001 | |
| Critical Commercial Assay | |||
| DAPI | Sigma Aldrich | cat#MBD0015 | |
| Dnase I | Roche | cat# 10104159001 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Fetal Bovine Serum South American | ThermoFisher | Cat#10270106 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Biological industries | cat#02-018-1A | |
| KRASLSL-G12D mice | Jackson Laboratory | JAX008179 | |
| MACS dead cells removal kit | Milteny Biotec | cat#130-090-101 | |
| PBS | Biological industries | cat#02-023-1A | |
| Ptf1a-CreER mice | Jackson Laboratory | JAX019378 | |
| Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX007908 | |
| Trypsin C-EDTA 0.05% | Biological industries | cat# 03-053-1A | |
| Trypsin inhibitor | Roche | cat#T6522 |
References
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