Pankreas metaplastik hücreleri, pankreas tümörlerine yol açan kötü huylu hücrelerin öncüleridir. Bununla birlikte, sağlam canlı pankreas hücrelerini izole etmek zordur. Burada pankreas dokusu ayrışması için etkili bir yöntem sunuyoruz. Hücreler daha sonra tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-dizilimi) veya iki veya üç boyutlu birlikte kültürleme için kullanılabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Canlı Tek Hücreleri İzole Etmek için Pankreas Doku Diseksiyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Pankreas iki ana sistem içerir: hormonları üreten ve salgılayan endokrin sistem ve pankreasın yaklaşık% 90'ını oluşturan ve sindirim enzimleri üreten ve salgılayan hücreleri içeren ekzokrin sistem. Sindirim enzimleri pankreas asiner hücrelerinde üretilir, zimojen adı verilen veziküllerde depolanır ve daha sonra metabolik süreçleri başlatmak için pankreas kanalı yoluyla duodenuma salınır. Asiner hücreler tarafından üretilen enzimler hücreleri öldürebilir veya hücresiz RNA'yı parçalayabilir. Ek olarak, asiner hücreler kırılgandır ve ortak ayrışma protokolleri çok sayıda ölü hücre ve hücresiz proteaz ve RNaz ile sonuçlanır. Bu nedenle, pankreas dokusu sindirimindeki en büyük zorluklardan biri, sağlam ve canlı hücrelerin, özellikle asiner hücrelerin geri kazanılmasıdır. Bu makalede sunulan protokol, bu ihtiyacı karşılamak için geliştirdiğimiz iki adımlı bir yöntemi göstermektedir. Protokol, normal pankrea, pre-malign lezyonları içeren pankreaları veya çok sayıda stromal ve immün hücre içeren pankreas tümörlerini sindirmek için kullanılabilir.
Giriş
Pankreas duktal adenokarsinomu (PDAC) en agresif kanser tiplerinden biridir1. Klinik kanıtlar, PDAC'nin uzun yıllar boyunca asiner hücreler de dahil olmak üzere ekzokrin sistem hücrelerinden geliştiği ve KRAS proto-onkogen2'deki mutasyonlar tarafından yönlendirildiği fikrini desteklemektedir.
Pankreas tümörleri birçok farklı hücre tipini içerir ve kötü huylu hücrelerin tümör kütlesinin sadece %20-50'sini oluşturduğu gösterilmiştir3. Farklı hücre tipleri epitel hücreleriyle etkileşime girer, dönüşümlerini destekler ve tümör oluşumunu ve büyümesini arttırır. Erken olaylar....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
İbrani Üniversitesi (Kudüs, İsrail) ve Hadassah Tıp Merkezi'nin (Kudüs, İsrail) ortak etik komitesi (Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi), hayvan refahı için çalışma protokolünü onayladı (MD-18-15417-5 "Farelerde pankreas kanserinde doku dinamikleri") ve burada sunulan protokol, hayvan testleri ve araştırmaları için ilgili tüm etik düzenlemelere uygundur. İbrani Üniversitesi, Laboratuvar Hayvanları Bakımı Uluslararası akredite enstitüsünün Değerlendirilmesi ve Akreditasyonu için bir Dernektir.
NOT: Fare suşu stoğu #007908, stok #019378 ve stok #008179 Jackson'ın laboratuvarından elde edilmiştir. PRT (Kras+/LSL-G12D; Pt....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Yakın zamanda yayınlanan bir çalışmada5, bir fare modeli kullanarak PDAC geliştirmenin erken aşamalarını keşfetmek için yukarıda açıklanan protokolü uyguladık. Fare, tamoksifen enjeksiyonundan sonra asiner hücrelerde yapısal olarak aktif KRAS ekspresyonuna izin veren Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato7 kasetlerini içerecek şekilde genetik olarak tasarlanmıştır.
Servikal çıkıktan sonra (fare etik.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu yazıda pankreas dokusu dissosiyasyonu için bir protokol sunuyoruz. Protokol basittir, kullanımı kolaydır ve katı tümörler de dahil olmak üzere malignite süreci sırasında farklı aşamalarda canlı tek hücreleri pankreas dokusundan izole etmek için bir araç sağlar. Önceki çalışmalarda, pankreası sindirmek için farklı tipte kollajenazlar kullanılmıştır 8,9. Kollajenaz D gibi çok güçlü bir kollajenaz kullanmak, büyük bir bağışıklık hücresi popülasyonu ve daha düşük .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan etmezler.
Teşekkürler
Veri analizindeki yardımları için Dr. Avital Sarusi-Portuguez'e ve daha önceki bir çalışmada protokolün oluşturulmasındaki yardımları için Dr. Dror Kolodkin-Gal'e teşekkür ederiz. Parnas laboratuvarının tüm geçmiş ve şimdiki üyelerine teşekkür ederiz. Dr. Gillian Kay ve Dr. Michael Kanovsky'ye editörlükteki yardımları için teşekkür ederiz. Bu proje, İsrail Bilim Vakfı hibesinden (No. 526/18 OP), Alex U. Soyka Programından ve İsrail Kanser Araştırma Fonu'ndan (Araştırma Kariyeri Geliştirme Ödülü) bir hibe almıştır.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif veya Kaynak | |||
| 70 & m naylon örgü ve nbsp; | Corning | kedisi##431751 | |
| BSA | Sigma Aldrich | kedisi# A7906 | |
| Kollajenaz P | Roche | kedisi# 11213857001 | |
| Kritik Ticari Test | |||
| DAPI | Sigma Aldrich | kedisi#MBD0015 | |
| Dnase I | Roche | kedisi# 10104159001 | |
| Deneysel Modeller: Organizmalar/ Suşlar | |||
| Fetal Sığır Serumu Güney Amerika | ThermoFisher | Kedi # 10270106 | |
| Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi | Biyolojik endüstriler | kedi # 02-018-1A & nbsp; | |
| KRASLSL-G12D fareler | Jackson Laboratuvarı | JAX008179 | |
| MACS ölü hücre temizleme kiti | Milteny Biotec | kedi # 130-090-101 | |
| PBS | Biyolojik endüstriler | kedi # 02-023-1A & nbsp; | |
| Ptf1a-CreER mice | Jackson Laboratuvarı | JAX019378 | |
| Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdDomates fareler | Jackson Laboratuvarı | JAX007908 | |
| Tripsin C-EDTA %0.05 | Biyolojik endüstriler | cat# 03-053-1A | |
| Tripsin inhibitör | Roche | kedisi#T6522 |
Kaynaklar
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
