Summary
胰腺化生细胞是引起胰腺肿瘤的恶性细胞的前体。然而，分离完整的活胰腺细胞具有挑战性。在这里，我们提出了一种有效的胰腺组织解离方法。然后，这些细胞可用于单细胞RNA测序（scRNA-seq）或二维或三维共培养。
Abstract
胰腺包括两个主要系统：产生和分泌激素的内分泌系统，以及约占胰腺90%的外分泌系统，包括产生和分泌消化酶的细胞。消化酶在胰腺腺泡细胞中产生，储存在称为酶原的囊泡中，然后 通过 胰管释放到十二指肠中以启动代谢过程。腺泡细胞产生的酶可以杀死细胞或降解游离RNA。此外，腺泡细胞很脆弱，常见的解离方案会导致大量死细胞和游离蛋白酶和RNase。因此，胰腺组织消化的最大挑战之一是恢复完整和活的细胞，尤其是腺泡细胞。本文中介绍的协议显示了我们为满足这一需求而开发的两步方法。该方案可用于消化正常胰腺、包含癌前病变的胰腺或包含大量基质和免疫细胞的胰腺肿瘤。
Introduction
胰腺导管腺癌 （PDAC） 是最具侵袭性的癌症类型之一1.临床证据支持这样一种观点，即PDAC是由KRAS原癌基因2突变驱动的外分泌系统细胞（包括腺泡细胞）发展而来的。
胰腺肿瘤包括许多不同的细胞类型，并且已经证明恶性细胞仅占肿瘤质量的 20%-50%3。不同的细胞类型与上皮细胞相互作用，支持其转化，并促进肿瘤的形成和生长。早期事件导致腺泡化生，从而引起称为胰腺上皮内瘤变 （PanINs） 的微观病变，在某些情况下可发展为 PDAC4。
迫切需要研究这些相互作用并瞄准关键信号。单细胞RNA测序（scRNA-seq）是一种强大的方法，它以单细胞分辨率揭示基因表达，从而跟踪上皮细胞所经历的变化，从而能够探索胰腺癌的发展。
组织解剖和消化为单细胞是scRNA-seq实验的第一阶段。有几个因素使胰腺组织消化特别具有挑战性：i）腺泡细胞占胰腺的90%以上，腺泡细胞含有大量的消化酶，包括蛋白酶和RNase，这些酶会降低基于RNA的文库的质量;（ii） 腺泡细胞非常敏感，如果使用标准方案，可能会裂解;（iii） 腺泡细胞以非常高的水平表达少量基因。因此，如果这些细胞在实验过程中裂解，可能会污染观察到的其他细胞的基因表达谱;（iv） 从肿瘤中恢复的胰腺组织是结缔组织增生的，因此很难在不损伤细胞的情况下进行解剖。因此，尽管需要保持所有细胞类型的高活力，但腺泡细胞的大量和敏感性增加了额外的复杂性。这些因素给实现单细胞悬液带来了困难，该悬浮液的存活率超过80%，并且没有团块，这是scRNA-seq实验所需的。
在这里，我们开发了一种使用胰蛋白酶C和胶原酶P的方案，以及频繁的组织监测。这支持解离为单细胞，同时保持高活力以支持 scRNA-seq 实验的成功 5,6。
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Protocol
希伯来大学（以色列耶路撒冷）和哈达萨医学中心（以色列耶路撒冷）的联合伦理委员会（机构动物护理和使用委员会）批准了动物福利研究方案（MD-18-15417-5“小鼠胰腺癌的组织动力学”），此处介绍的方案符合动物试验和研究的所有相关伦理法规。希伯来大学是国际实验动物护理评估和认证协会认可的机构。
注：小鼠品系原液 #007908、原液 #019378 和原液 #008179 是从杰克逊实验室获得的。PRT（Kras+/LSL-G12D;Ptf1a-Cre内质网;Rosa26LSL-tdTomato）小鼠是通过杂交上述菌株产生的。该研究使用了6周至15个月大的男女小鼠。通过将粉末溶解在玉米油中来制备他莫昔芬。成年小鼠（6-8周龄，雌性和雄性）在第0天和第2天皮下注射他莫昔芬，剂量为400mg / kg，注射后每周检查两次。由于肿瘤位于内部，因此无法测量肿瘤;因此，如果根据伦理协议观察到异常临床症状，则进行安乐死。在他莫昔芬诱导后的不同时间点，使用异氟醚和宫颈脱位对小鼠实施安乐死。
1.胰腺清扫术
注：为了在提取过程中获得最佳产量并确保良好的细胞活力，快速解剖至关重要。为了缩短胰腺分离所需的时间，在对小鼠实施安乐死之前，所有仪器和设备都必须准备好在冰上。
- 通过CO2窒息对小鼠实施安乐死，并使用颈椎脱位进行验证。从这一步开始，所有程序都必须使用无菌解剖器械进行。
- 固定鼠标并用70%乙醇喷洒腹部。用剪刀和镊子在生殖器区域做一个2.5厘米的V形切口，然后向上切开腹腔。
- 找到鼠标左侧的胃。找到靠近脾脏的胰腺。使用两个镊子将胰腺与胃和十二指肠分开（不撕裂）。继续将胰腺与小肠、空肠和回肠分开。
- 将胰腺移动到鼠标的右侧。用镊子分离胰腺和胸腔之间的剩余连接，以完全分离胰腺和附着的脾脏。
- 取出胰腺并将其摊开在冰上的培养皿中进行检查。
注意：在此步骤中必须注意仅切除胰腺，而不是切除肠系膜脂肪组织或其他邻近组织以及胰腺，以避免细胞污染。
2.胰腺的酶解和机械解离
- 提前准备以下缓冲液。
- 解离缓冲液 1：每个样品 4 mL 胰蛋白酶 C + 6 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）（见 表 1）。
- 解离缓冲液 2：9 mL Hanks′ 平衡盐溶液 （HBSS） 1x;4%牛血清白蛋白（BSA）;1 mL 胶原酶 P （10 mg/mL）;200 μL 胰蛋白酶抑制剂 （10 mg/mL）;和 200 μL DNase I （10 mg/mL）（见 表 1）。
- 洗涤缓冲液：50 mL HBSS 1x;2克BSA;1 mL 胰蛋白酶抑制剂 （10 mg/mL）;和 1 mL DNase 1 （10 mg/mL）。
- 酶活性终止液：含有 5% 胎牛血清 （FBS） 和 150 g DNase I （0.2 mg/mL） 的 HBSS 1x。
- 将胰腺放入冰上的 50 mL 管中。在HBSS 1x的10%FBS中冲洗胰腺。脂肪组织会漂浮，胰腺会下沉。这是一种可视化和快速去除仍附着在胰腺上的污染性白色脂肪组织的简单方法。
- 将小鼠胰腺组织转移到含有 5 mL HBSS 1x 的无菌培养皿中。使用Noyes剪刀和手术刀将胰腺切成1至3mm3 的小块（图2A）。如果有多个样品，样品应在10%FBS / HBSS 1x中保持在冰上。
- 将组织转移到离心管中。在4°C下以350× g 离心5分钟。吸出并弃去上清液以除去细胞碎片和血细胞。
- 将碎片重悬于含有0.02%胰蛋白酶C-0.05%EDTA的解离缓冲液1中，在37°C下搅拌（180rpm）10分钟。立即用 10% FBS/Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 （DMEM） 洗涤。在4°C下以350g离心5分钟。
- 通过将沉淀重悬于10mL洗涤缓冲液中并在下一个解离步骤之前在4°C下以350× g 离心5分钟再次洗涤。
- 将胰腺在解离缓冲液2中在37°C下搅拌孵育15分钟（180rpm）。
- 15分钟后，通过在大小递减的无菌移液管（25,10和5mL血清移液管）中上下剧烈移液胰酶碎片10次并带回37°C进行机械解离。
- 再过5分钟后，重复机械解离，并根据单细胞悬浮液的量使用光学显微镜监测解离。通常，如果在此阶段，少于90%的悬浮液由分离的单细胞组成，则需要更长的孵育时间。使用台盼蓝监测细胞活力。
- 继续孵育，每5分钟取样检测一次解离。
注意：总孵育时间取决于组织，并且可能因样品而异。当90%的细胞分离成单个细胞或检测到活力降低时，孵育和组织解离应结束。
- 胰腺组织充分解离后（对应于胰腺碎片的消失和溶液浑浊度的增加）（图2），通过在4°C下用酶活性终止溶液洗涤两次5分钟来停止酶促反应。 从这一步开始，将细胞悬浮液保持在冰上。
- 将细胞悬液通过70μm尼龙网，并在显微镜下检查细胞活力。较小尺寸的尼龙网可能会降低细胞活力。
- 重悬并用 5-10 mL 冰冷的缓冲洗涤液洗涤沉淀。对细胞进行计数。
- 如果观察到几个红细胞，则在室温下用红细胞裂解缓冲液处理细胞2分钟。在观察到团块的情况下，应再次用胰蛋白酶处理样品，如步骤2.5所述。在显微镜下用台盼蓝检测活力，如果活力低于80%，则应使用带有MACS MS柱的磁激活细胞分选（MACS）死细胞去除试剂盒分离活细胞（见 表1）。
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Representative Results
在最近发表的工作5中，我们应用上述协议来探索使用小鼠模型的PDAC开发的早期阶段。小鼠经过基因工程改造，包括 Ptf1a-CreER、LSL-Kras-G12D、LSL-tdTomato 7 盒，其允许在他莫昔芬注射后腺泡细胞中表达组成型活性 KRAS。
颈椎脱位后（根据小鼠伦理方案），切除胰腺，并应用上述方案（见 图1和方案）。
为了优化解离方案，在有或没有组织与胰蛋白酶C预孵育的情况下进行解离。结果发现，与胰蛋白酶C预孵育加速了解离，而不影响活力。此外，还尝试了不同的胶原酶，包括胶原酶D、胶原酶1a和胶原酶P（见 表 1）。结果发现，使用胶原酶D会导致大量细胞死亡，事实上，在其他使用这种胶原酶的研究中，腺泡细胞的比例非常小8。使用胶原酶 1a 也没有提供预期的结果，因为即使在与胶原酶 1a 孵育 90 分钟后，组织也不会解离。只有胶原酶P使我们能够解离组织并保持所有细胞类型的高活力。
这些实验在他莫昔芬注射后的七个不同时间点重复进行。在腺泡至导管化生和泛IN病变形成的同时，基质细胞和免疫细胞（包括成纤维细胞）积聚，组织变得结缔组织增生和僵硬。他莫昔芬注射后的不同时间点使我们能够在几种不同的组织状态下检查方案，并测量上皮细胞、基质细胞和免疫细胞的恢复情况。
小鼠的照片如图2A所示，分离的胰腺（蓬松组织）如图2C所示。组织的红色是由于腺泡细胞中tdTomato的表达。该协议已成功用于所有组织状态和人类样本。然而，胰蛋白酶和胶原酶的孵育时间可能会有所不同。因此，在显微镜下每隔几分钟监测样品并观察组织和细胞活力的解离是很重要的。在解离方案的早期阶段，分离的细胞数量很少，团块数量很大（图2D，左）。我们的目标是实现分离的活细胞，如图2D中所示，并避免活细胞数量的减少（图2D，右）。
需要注意的是，较长的孵育时间会降低细胞的活力。从0.5 x 10 cm3 大小的组织开始，我们总共回收了5 x 106个细胞，其中5 x 105 个是 tdTomato 阳性细胞。根据 图 3 中的荧光激活细胞分选 （FACS） 分析，我们的胰腺解离方案支持多种细胞类型的恢复，包括腺泡细胞、导管细胞、内皮细胞、成纤维细胞、免疫细胞和高活力周细胞。然而，从包含tdTomato 阳性细胞的胰腺冷冻切片的荧光图像推断，解离前组织中每种类型的细胞数量之间的实际比例可能不同（图2E）。使用上述方案实现的高活力通过FACS分析（图3）和使用血细胞计数器完成的活细胞/死细胞计数（图3H）显示。
对于每个样本，我们进行了scRNA-seq，并与FACS分析一致，我们确认在他莫昔芬注射后所有时间点的每个切除组织中检测到上述所有细胞类型（图4A，B）。我们还检查了编码羧肽酶 1 的羧肽酶 1 （Cpa1） 的表达。腺泡细胞中Cpa1的表达非常高，可以指示腺泡细胞在解离过程中裂解的程度，以及它们污染其他细胞类型转录组的程度。我们检测到的污染极少，如图4C，D所示。温和的解离也导致了高活力，使我们能够跟进所需细胞类型的细胞分选，以进行额外的实验（图3）。
总之，解离方案的质量支持不同的后续实验，包括scRNA-seq。
图 1：协议方案。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：胰腺细胞分离。 （A） 小鼠完全打开腹腔后胰腺（红色）、肝脏和脾脏的照片。（B）与（A）中相同的小鼠在切除胰腺后。（C）胰腺的解剖。从动物身上取出后的胰腺（左）。胰腺裂解成小块（中间）。离心后的相分离（右）。（D）在显微镜下监测细胞以检查单细胞活力。总原代胰腺细胞分离 （20x）。酶促反应15分钟后的细胞团块（左）。酶促反应25分钟后的单细胞悬浮液（中）。长时间孵育后细胞活力降低（右）。（E） 冷冻胰腺切片的荧光图像。腺泡细胞为 tdTomato 阳性;蓝色DAPI染色（40x照片）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3：胰腺癌单细胞悬液的FACS分析 。 （A） tdTomato 阳性和阴性细胞。（B） 未分选（红色）与分选（蓝色）腺泡细胞的流式细胞术。（C，F）未染色的细胞，APC 和 PB450。（D） 用抗 CD31（内皮细胞标志物）染色后的 FACS 分析。（E） 用周细胞标志物抗 CD140b 染色后的 FACS 分析。（G） 用树突状细胞和巨噬细胞的标志物抗 CD11c 染色后的 FACS 分析。（H） 四种不同胰腺细胞分离中活细胞和死细胞的比例。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：使用我们在本文中描述的方案生成的 scRNA-seq 数据的分析。 （A） UMAP 显示小鼠胰腺在他莫昔芬注射后不同时间点的 scRNA-seq，如面板右侧所示。（B） 根据已知标记物确定细胞类型。（C，D）细胞根据Cpa1的表达水平（在 C中）或tdTomato的水平（ 在D中）着色。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
在本文中，我们提出了胰腺组织解离的方案。该方案简单易用，并提供了一种在恶性肿瘤过程（包括实体瘤）的不同阶段从胰腺组织中分离活单细胞的工具。在以前的研究中，不同类型的胶原酶被用来消化胰腺8,9。使用非常有效的胶原酶，如胶原酶D，可产生大量的免疫细胞和较低比例的上皮细胞。使用胶原酶P可以进行胰腺消化，适用于完整或肿瘤胰腺组织。
根据我们的观察，所有细胞类型都可以分离出来。我们之前验证了免疫 T 细胞的浸润，例如，使用免疫组化5;我们认为，我们在分析中观察到的相对细胞数量是组织中细胞实际表示的适当近似值，但脆弱且因此代表性不足的腺泡细胞除外。如果需要组织中细胞类型的准确比例，我们建议使用免疫组化或空间转录组学10、11、12。此外，我们观察到，在没有组成型活性KRAS表达的情况下，组织与野生型小鼠的解离更具挑战性，需要更频繁的监测，通过向洗涤缓冲液中加入10%FBS来及时停止酶促反应，并避免大量细胞死亡。这也与一些高丰度腺泡转录本（如Cpa1）的污染一致，尽管我们的方案最大限度地减少了这个问题。
细胞分离可用于scRNA-seq，如5所示，用于培养细胞，或作为类器官的起始材料。
对新鲜组织的需求是该方法的一个局限性。最近使用了一种专注于细胞核分离的替代方法，即单核 RNA 测序 （sNuc-seq）13，以单细胞分辨率研究患者的 PDAC 肿瘤11;将来，比较从 sNuc-seq 获得的胰腺上皮细胞的数据质量与 scRNA-seq 相比会很有趣。重要的是，细胞核提取不允许细胞培养，并且分选以富集特定细胞类型极具挑战性。因此，组织解离方案将来将可用于scRNA-seq实验和这些额外的应用。
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Disclosures
作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
我们要感谢 Avital Sarusi-Portuguez 博士在数据分析方面的帮助，以及 Dror Kolodkin-Gal 博士在之前的研究中为建立协议提供的帮助。我们感谢Parnas实验室的所有过去和现在的成员。我们感谢 Gillian Kay 博士和 Michael Kanovsky 博士在编辑方面的帮助。该项目已获得以色列科学基金会资助（第 526/18 O.P.号）、Alex U. Soyka 计划和以色列癌症研究基金（研究职业发展奖）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent or Resource | |||
| 70 µm nylon mesh | Corning | cat##431751 | |
| BSA | Sigma Aldrich | cat# A7906 | |
| Collagenase P | Roche | cat# 11213857001 | |
| Critical Commercial Assay | |||
| DAPI | Sigma Aldrich | cat#MBD0015 | |
| Dnase I | Roche | cat# 10104159001 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Fetal Bovine Serum South American | ThermoFisher | Cat#10270106 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Biological industries | cat#02-018-1A | |
| KRASLSL-G12D mice | Jackson Laboratory | JAX008179 | |
| MACS dead cells removal kit | Milteny Biotec | cat#130-090-101 | |
| PBS | Biological industries | cat#02-023-1A | |
| Ptf1a-CreER mice | Jackson Laboratory | JAX019378 | |
| Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX007908 | |
| Trypsin C-EDTA 0.05% | Biological industries | cat# 03-053-1A | |
| Trypsin inhibitor | Roche | cat#T6522 |
References
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