Summary
Metaplastische Zellen der Bauchspeicheldrüse sind Vorläufer bösartiger Zellen, aus denen Pankreastumoren entstehen. Die Isolierung intakter, lebensfähiger Pankreaszellen ist jedoch eine Herausforderung. Hier stellen wir eine effiziente Methode zur Dissoziation von Pankreasgewebe vor. Die Zellen können dann für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) oder für die zwei- oder dreidimensionale Co-Kultivierung verwendet werden.
Abstract
Die Bauchspeicheldrüse umfasst zwei Hauptsysteme: das endokrine System, das Hormone produziert und absondert, und das exokrine System, das etwa 90 % der Bauchspeicheldrüse ausmacht und Zellen umfasst, die Verdauungsenzyme produzieren und absondern. Die Verdauungsenzyme werden in den Azinuszellen der Bauchspeicheldrüse produziert, in Bläschen, den sogenannten Zymogenen, gespeichert und dann über den Pankreasgang in den Zwölffingerdarm freigesetzt, um Stoffwechselprozesse in Gang zu setzen. Die von den Azinuszellen produzierten Enzyme können Zellen abtöten oder zellfreie RNA abbauen. Darüber hinaus sind Azinuszellen zerbrechlich, und gängige Dissoziationsprotokolle führen zu einer großen Anzahl toter Zellen und zellfreier Proteasen und RNasen. Daher ist eine der größten Herausforderungen bei der Verdauung von Bauchspeicheldrüsengewebe die Wiederherstellung intakter und lebensfähiger Zellen, insbesondere von Azinuszellen. Das in diesem Artikel vorgestellte Protokoll zeigt eine zweistufige Methode, die wir entwickelt haben, um diesen Bedarf zu decken. Das Protokoll kann zur Verdauung von normaler Bauchspeicheldrüse, Bauchspeicheldrüse mit prämalignen Läsionen oder Bauchspeicheldrüsentumoren mit einer großen Anzahl von Stroma- und Immunzellen verwendet werden.
Introduction
Das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) ist eine der aggressivsten Krebsarten1. Klinische Beweise stützen die Vorstellung, dass sich PDAC über viele Jahre hinweg aus Zellen des exokrinen Systems, einschließlich Azinuszellen, entwickelt, angetrieben durch Mutationen im KRAS-Proto-Onkogen2.
Pankreastumoren umfassen viele verschiedene Zelltypen, und es wurde gezeigt, dass bösartige Zellen nur 20%-50% der Tumormasse ausmachen3. Verschiedene Zelltypen interagieren mit den Epithelzellen, unterstützen deren Transformation und fördern die Tumorbildung und das Tumorwachstum. Frühe Ereignisse verursachen eine azinäre Metaplasie, die zu mikroskopisch kleinen Läsionen führt, die als intraepitheliale Pankreasneoplasie (PanINs) bezeichnet werden und sich in einigen Fällen zu PDAC4 entwickeln können.
Es besteht ein dringender Bedarf, diese Wechselwirkungen zu untersuchen und auf entscheidende Signale abzuzielen. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) ist eine leistungsfähige Methode, die die Genexpression mit einer Einzelzellauflösung aufdeckt und so die Veränderungen verfolgt, die Epithelzellen durchlaufen, und so die Erforschung der Entwicklung von Bauchspeicheldrüsenkrebs ermöglicht.
Die Gewebedissektion und der Verdau zu einzelnen Zellen ist der erste Schritt in einem scRNA-seq-Experiment. Mehrere Faktoren machen die Verdauung von Bauchspeicheldrüsengewebe zu einer besonderen Herausforderung: i) Azinuszellen machen mehr als 90 % der Bauchspeicheldrüse aus und Azinuszellen enthalten große Mengen an Verdauungsenzymen, einschließlich Proteasen und RNasen, die die Qualität von RNA-basierten Bibliotheken verringern; (ii) Azinuszellen sind sehr empfindlich und können lysieren, wenn Standardprotokolle verwendet werden; (iii) Azinuszellen exprimieren eine kleine Anzahl von Genen in sehr hohen Konzentrationen. Wenn diese Zellen während des Experiments lysiert werden, kann dies das beobachtete Genexpressionsprofil anderer Zellen kontaminieren. (iv) Pankreasgewebe, das aus Tumoren gewonnen wird, ist desmoplastisch, so dass es schwierig ist, es zu präparieren, ohne die Zellen zu schädigen. Obwohl die Aufrechterhaltung einer hohen Lebensfähigkeit aller Zelltypen erforderlich ist, erhöhen die große Anzahl und Empfindlichkeit der Azinuszellen die Komplexität zusätzlich. Diese Faktoren erschweren es, eine Einzelzellsuspension zu erreichen, die zu mehr als 80 % lebensfähig ist und keine Klumpen aufweist, wie es für scRNA-seq-Experimente erforderlich ist.
Hier haben wir ein Protokoll mit Trypsin C und Kollagenase P entwickelt, zusammen mit einer häufigen Gewebeüberwachung. Dies unterstützt die Dissoziation zu einzelnen Zellen bei gleichzeitiger Beibehaltung einer hohen Lebensfähigkeit, um den Erfolg von scRNA-seq-Experimenten zu unterstützen 5,6.
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Protocol
Die gemeinsame Ethikkommission (Institutional Animal Care and Use Committee) der Hebräischen Universität (Jerusalem, Israel) und des Hadassah Medical Center (Jerusalem, Israel) genehmigte das Studienprotokoll für Tierschutz (MD-18-15417-5 "Tissue dynamics in pancreatic cancer in mice"), und das hier vorgestellte Protokoll entsprach allen relevanten ethischen Vorschriften für Tierversuche und -forschung. Die Hebräische Universität ist ein von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International akkreditiertes Institut.
ANMERKUNG: Der Mausstamm #007908, der Stamm #019378 und der Stamm #008179 stammen aus Jacksons Labor. PRT (Kras+/LSL-G12D; PTF1A-CREER; Rosa26LSL-tdTomato)-Mäuse wurden durch Kreuzung der oben genannten Stämme erzeugt. Für die Studie wurden Mäuse beiderlei Geschlechts im Alter zwischen 6 Wochen und 15 Monaten verwendet. Tamoxifen wurde hergestellt, indem das Pulver in Maisöl aufgelöst wurde. Adulten Mäusen (im Alter von 6-8 Wochen, weiblich und männlich) wurde Tamoxifen an den Tagen 0 und 2 in einer Dosis von 400 mg/kg subkutan injiziert und zweimal wöchentlich nach der Injektion untersucht. Es war nicht möglich, Tumore zu messen, da sie intern lokalisiert waren; Daher wurde Euthanasie durchgeführt, wenn abnorme klinische Symptome gemäß dem ethischen Protokoll beobachtet wurden. Die Mäuse wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Tamoxifen-Induktion unter Verwendung von Isofluran und Zervixluxation euthanasiert.
1. Pankreasdissektion
HINWEIS: Für eine optimale Ausbeute während der Extraktion und um eine gute Zelllebensfähigkeit zu gewährleisten, ist eine schnelle Dissektion entscheidend. Um die Zeit für die Isolierung der Bauchspeicheldrüse zu verkürzen, müssen alle Instrumente und Geräte vor dem Einschläfern der Maus auf Eis bereitstehen.
- Euthanasie der Maus durch CO2 -Erstickung und Überprüfung mittels zervikaler Luxation. Ab diesem Schritt müssen alle Eingriffe mit sterilen Präparierinstrumenten durchgeführt werden.
- Fixieren Sie die Maus und besprühen Sie den Bauch mit 70%igem Ethanol. Machen Sie mit Schere und Pinzette einen V-förmigen Schnitt von 2,5 cm im Genitalbereich und gehen Sie nach oben, um die Bauchhöhle vollständig zu öffnen.
- Finde den Magen auf der linken Seite der Maus. Lokalisieren Sie die Bauchspeicheldrüse, die sich in der Nähe der Milz befindet. Trennen Sie die Bauchspeicheldrüse mit zwei Pinzetten von Magen und Zwölffingerdarm (ohne zu reißen). Fahre fort und trenne die Bauchspeicheldrüse vom Dünndarm, dem Jejunum und dem Ileum.
- Bewegen Sie die Bauchspeicheldrüse auf die rechte Seite der Maus. Trennen Sie die verbleibenden Verbindungen zwischen der Bauchspeicheldrüse und der Brusthöhle mit einer Pinzette, um die Bauchspeicheldrüse und die daran befestigte Milz vollständig zu lösen.
- Entfernen Sie die Bauchspeicheldrüse und breiten Sie sie zur Untersuchung in einer Petrischale auf Eis aus.
HINWEIS: Bei diesem Schritt muss darauf geachtet werden, dass nur die Bauchspeicheldrüse entfernt wird und nicht das Mesenterialfettgewebe oder anderes angrenzendes Gewebe zusammen mit der Bauchspeicheldrüse entfernt wird, um eine zelluläre Kontamination zu vermeiden.
2. Enzymatische und mechanische Dissoziation der Bauchspeicheldrüse
- Bereiten Sie die folgenden Puffer im Voraus vor.
- Dissoziationspuffer 1: 4 ml Trypsin C + 6 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (siehe Tabelle 1) für jede Probe.
- Dissoziationspuffer 2: 9 ml Hanks′ ausgewogene Salzlösung (HBSS) 1x; 4% Rinderserumalbumin (BSA); 1 ml Kollagenase P (10 mg/ml); 200 μl Trypsin-Inhibitor (10 mg/ml); und 200 μl DNase I (10 mg/ml) (siehe Tabelle 1).
- Waschpuffer: 50 ml HBSS 1x; 2 g BSA; 1 ml Trypsin-Hemmer (10 mg/ml); und 1 ml DNase 1 (10 mg/ml).
- Enzymaktivitätsstopp-Lösung: HBSS 1x mit 5 % fötalem Kälberserum (FBS) und 150 g DNase I (0,2 mg/ml).
- Legen Sie die Bauchspeicheldrüse in ein 50-ml-Röhrchen auf Eis. Spülen Sie die Bauchspeicheldrüse in 10% FBS in HBSS 1x. Das Fettgewebe schwimmt und die Bauchspeicheldrüse sinkt ab. Dies ist eine einfache Möglichkeit, das kontaminierende weiße Fettgewebe, das noch an der Bauchspeicheldrüse haftet, sichtbar zu machen und schnell zu entfernen.
- Übertragen Sie das Pankreasgewebe der Maus in eine sterile Petrischale, die 5 ml HBSS 1x auf Eis enthält. Schneiden Sie die Bauchspeicheldrüse mit einer Noyes-Schere und einem Skalpell in kleine Stücke von 1 bis 3 mm3 (Abbildung 2A). Bei mehr als einer Probe sollten die Proben auf Eis in 10% FBS/HBSS 1x aufbewahrt werden.
- Übertragen Sie das Gewebe in ein Zentrifugenröhrchen. Bei 350 x g bei 4 °C 5 min zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand an und entsorgen Sie ihn, um Zellfragmente und Blutzellen zu entfernen.
- Die Stücke werden in Dissoziationspuffer 1 mit 0,02 % Trypsin, C-0,05 % EDTA für 10 Minuten bei 37 °C unter Rühren (180 U/min) resuspendiert. Sofort mit 10% FBS/Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM) waschen. 5 min bei 350 g bei 4 °C zentrifugieren.
- Erneut waschen, indem das Pellet in 10 ml Waschpuffer resuspendiert und vor dem nächsten Dissoziationsschritt bei 350 x g 5 min bei 4 °C zentrifugiert wird.
- Die Bauchspeicheldrüse wird im Dissoziationspuffer 2 für 15 min bei 37 °C unter Rühren (180 U/min) inkubiert.
- Nach 15 Minuten wird die mechanische Dissoziation durchgeführt, indem die Pankreasfragmente in sterilen Pipetten abnehmender Größe (serologische Pipetten mit 25, 10 und 5 ml) 10 Mal kräftig auf und ab pipettiert und wieder auf 37 °C gebracht werden.
- Wiederholen Sie nach weiteren 5 Minuten die mechanische Dissoziation und verwenden Sie Lichtmikroskopie, um die Dissoziation entsprechend der Menge der Einzelzellsuspension zu überwachen. Wenn in diesem Stadium weniger als 90 % der Suspension aus isolierten Einzelzellen bestehen, ist in der Regel eine längere Inkubationszeit erforderlich. Verwenden Sie Trypanblau, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu überwachen.
- Fahren Sie mit der Inkubation fort und nehmen Sie alle 5 Minuten Proben, um die Dissoziation nachzuweisen.
HINWEIS: Die Gesamtinkubationszeit hängt vom Gewebe ab und kann von Probe zu Probe variieren. Die Inkubation und Gewebedissoziation sollte beendet sein, wenn 90% der Zellen in einzelne Zellen getrennt sind oder wenn eine Verringerung der Lebensfähigkeit festgestellt wird.
- Nachdem das Pankreasgewebe gut dissoziiert ist (entsprechend dem Verschwinden von Pankreasfragmenten und der zunehmenden Trübung der Lösung) (Abbildung 2), stoppen Sie die enzymatische Reaktion durch zweimaliges Waschen mit Enzymaktivitätsstopplösung für 5 Minuten bei 4 °C. Halten Sie die Zellsuspension ab diesem Schritt auf Eis.
- Führen Sie die Zellsuspension durch ein 70 μm Nylonnetz und überprüfen Sie die Zelllebensfähigkeit unter dem Mikroskop. Kleinere Größen von Nylonnetzen können die Lebensfähigkeit der Zellen verringern.
- Resuspendieren und waschen Sie das Pellet mit 5-10 ml eiskalter, gepufferter Waschlösung. Zähle die Zellen.
- Wenn mehrere rote Blutkörperchen beobachtet werden, behandeln Sie die Zellen mit einem Erythrozyten-Lysepuffer für 2 Minuten bei Raumtemperatur. In Fällen, in denen Klumpen beobachtet werden, sollte die Probe erneut mit Trypsin behandelt werden, wie in Schritt 2.5 beschrieben. Die Lebensfähigkeit wird mit Trypanblau unter dem Mikroskop nachgewiesen, und wenn die Lebensfähigkeit weniger als 80 % beträgt, sollten lebende Zellen mit dem magnetisch aktivierten Zellsortierungskit (MACS) zur Entfernung toter Zellen mit MACS-MS-Säulen isoliert werden (siehe Tabelle 1).
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Representative Results
In einer kürzlich veröffentlichten Arbeit5 haben wir das oben beschriebene Protokoll angewendet, um die frühen Stadien der PDAC-Entwicklung anhand eines Mausmodells zu untersuchen. Die Maus wurde genetisch so verändert, dass sie die Kassetten Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato7 enthält, die die Expression von konstitutiv aktivem KRAS in Azinuszellen nach Tamoxifen-Injektion ermöglichen.
Nach der Zervixluxation (gemäß dem ethischen Protokoll der Maus) wurde die Bauchspeicheldrüse reseziert und das oben beschriebene Protokoll angewendet (siehe Abbildung 1 und Protokoll).
Um das Dissoziationsprotokoll zu optimieren, wurde die Dissoziation mit oder ohne Vorinkubation des Gewebes mit Trypsin C durchgeführt. Es zeigte sich, dass die Vorinkubation mit Trypsin C die Dissoziation beschleunigte, ohne die Lebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Darüber hinaus wurden verschiedene Kollagenasen, darunter Kollagenase D, Kollagenase 1a und Kollagenase P, ausprobiert (siehe Tabelle 1). Es wurde festgestellt, dass die Verwendung von Kollagenase D zu einem massiven Zelltod führte, und in der Tat war in anderen Studien, die diese Kollagenase verwendeten, der Anteil der Azinuszellen sehr gering8. Auch die Verwendung von Kollagenase 1a lieferte nicht die erwarteten Ergebnisse, da das Gewebe auch nach einer 90-minütigen Inkubation mit Kollagenase 1a nicht dissoziiert wurde. Nur Kollagenase P ermöglichte es uns, das Gewebe zu dissoziieren und eine hohe Lebensfähigkeit aller Zelltypen aufrechtzuerhalten.
Diese Experimente wurden zu sieben verschiedenen Zeitpunkten nach der Tamoxifen-Injektion wiederholt. Gleichzeitig mit der azinus-duktalen Metaplasie und der Bildung von PanIN-Läsionen kam es zu einer Anhäufung von Stroma- und Immunzellen, einschließlich Fibroblasten, und das Gewebe wurde desmoplastisch und steif. Die verschiedenen Zeitpunkte nach der Tamoxifen-Injektion ermöglichten es uns, das Protokoll unter verschiedenen Gewebezuständen zu untersuchen und die Erholung von Epithel-, Stroma- und Immunzellen zu messen.
Ein Foto einer Maus ist in Abbildung 2A und die isolierte Bauchspeicheldrüse, ein flauschiges Gewebe, in Abbildung 2C dargestellt. Die rote Farbe des Gewebes resultiert aus der Expression von tdTomato in den Azinuszellen. Das Protokoll wurde bei allen Gewebezuständen und bei humanen Proben erfolgreich eingesetzt. Die Inkubationszeiten mit Trypsin und Kollagenase können jedoch variieren. Daher ist es wichtig, die Probe zu überwachen und die Dissoziation des Gewebes und die Zellviabilität alle paar Minuten unter dem Mikroskop zu beobachten. In einem frühen Stadium des Dissoziationsprotokolls gab es eine geringe Anzahl isolierter Zellen und eine große Anzahl von Klumpen (Abbildung 2D, links). Unser Ziel war es, isolierte lebensfähige Zellen zu erhalten, wie in Abbildung 2D in der Mitte dargestellt, und eine Verringerung der Anzahl lebensfähiger Zellen zu vermeiden (Abbildung 2D, rechts).
Es ist wichtig zu beachten, dass längere Inkubationszeiten die Lebensfähigkeit der Zellen verringerten. Ausgehend von einem Gewebe von 0,5 x 10 cm3 haben wir insgesamt 5 x 106 Zellen gewonnen, von denen 5 x 105 tdTomato-positive Zellen waren. Gemäß der Analyse der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) in Abbildung 3 unterstützt unser Pankreasdissoziationsprotokoll die Wiederherstellung mehrerer Zelltypen, einschließlich Azinuszellen, duktalen Zellen, Endothelzellen, Fibroblasten, Immunzellen und Perizyten mit hoher Lebensfähigkeit. Das tatsächliche Verhältnis zwischen der Anzahl der Zellen jedes Typs im Gewebe vor der Dissoziation kann jedoch unterschiedlich sein, wie aus den Fluoreszenzbildern von eingefrorenen Pankreasschnitten mit tdTomato-positiven Zellen abgeleitet wird (Abbildung 2E). Die hohe Viabilität, die mit dem oben beschriebenen Protokoll erreicht wird, wird durch die FACS-Analyse (Abbildung 3) und die Zählung von lebenden Zellen/toten Zellen mit einem Hämozytometer (Abbildung 3H) gezeigt.
Für jede Probe führten wir eine scRNA-Sequenzierung durch und bestätigten in Übereinstimmung mit der FACS-Analyse den Nachweis aller oben genannten Zelltypen (Abbildung 4A,B) in jedem der resezierten Gewebe zu allen Zeitpunkten nach der Tamoxifen-Injektion. Wir untersuchten auch die Expression der Carboxypeptidase 1 (Cpa1), die für die Carboxypeptidase1 kodiert. Die Cpa1-Expression in Azinuszellen ist extrem hoch und kann Aufschluss darüber geben, in welchem Ausmaß Azinuszellen während der Dissoziation lysiert wurden und inwieweit sie das Transkriptom anderer Zelltypen kontaminiert haben. Wir haben eine minimale Kontamination festgestellt, wie in Abbildung 4C,D zu sehen ist. Die sanfte Dissoziation führt auch zu einer hohen Viabilität, die es uns ermöglicht, die Zellsortierung der gewünschten Zelltypen für weitere Experimente zu verfolgen (Abbildung 3).
Die Qualität des Dissoziationsprotokolls unterstützt verschiedene Folgeexperimente, einschließlich scRNA-seq.
Abbildung 1: Schema des Protokolls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Isolierung von Pankreaszellen. (A) Ein Foto, das die Bauchspeicheldrüse (in rot), die Leber und die Milz der Maus nach vollständiger Öffnung der Bauchhöhle zeigt. (B) Dieselbe Maus wie in (A) nach Entfernung der Bauchspeicheldrüse. (C) Die Dissektion der Bauchspeicheldrüse. Die Bauchspeicheldrüse nach der Entnahme aus dem Tier (links). Die Bauchspeicheldrüse nach der Spaltung in kleine Stücke (Mitte). Phasentrennung nach der Zentrifugation (rechts). (D) Überwachung der Zellen unter dem Mikroskop, um die Lebensfähigkeit einzelner Zellen zu untersuchen. Vollständige Isolierung primärer Pankreaszellen (20x). Zellklumpen nach 15 Minuten enzymatischer Reaktion (links). Einzelzellsuspension nach 25 min enzymatischer Reaktion (Mitte). Verminderte Zellviabilität nach langer Inkubation (rechts). (E) Fluoreszenzbilder eines gefrorenen Pankreasschnitts. Azinuszellen sind tdTomato-positiv ; DAPI-Färbung in Blau (Foto bei 40x). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: FACS-Analyse der Einzelzellsuspension von Bauchspeicheldrüsenkrebs . (A) tdTomato-positive und - negative Zellen. (B) Durchflusszytometrie von unsortierten (roten) versus sortierten (blauen) Azinuszellen. (C,F) Ungefärbte Zellen, APC und PB450. (D) FACS-Analyse nach Färbung mit Anti-CD31, einem Marker für Endothelzellen. (E) FACS-Analyse nach Färbung mit Anti-CD140b, einem Marker für Perizyten. (G) FACS-Analyse nach Färbung mit Anti-CD11c, einem Marker für dendritische Zellen und Makrophagen. (H) Verhältnis von lebenden und toten Zellen in vier verschiedenen Pankreaszellisolierungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Analyse von scRNA-seq-Daten, die mit dem Protokoll erzeugt wurden, das wir im aktuellen Artikel beschreiben. (A) UMAP, das die scRNA-Sequenzierung einer Maus-Bauchspeicheldrüse zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Tamoxifen-Injektion zeigt, wie auf der rechten Seite des Panels angegeben. (B) Die Zelltypen wurden anhand bekannter Marker bestimmt. (C,D) Die Zellen werden entsprechend dem Expressionsniveau von Cpa1 (in C) oder dem Niveau von tdTomato (in D) eingefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll für die Dissoziation von Bauchspeicheldrüsengewebe vor. Das Protokoll ist einfach, leicht anzuwenden und bietet ein Werkzeug zur Isolierung lebensfähiger Einzelzellen aus Bauchspeicheldrüsengewebe in verschiedenen Stadien des Malignitätsprozesses, einschließlich solider Tumore. In früheren Studien wurden verschiedene Arten von Kollagenasen verwendet, um die Bauchspeicheldrüse zu verdauen 8,9. Die Verwendung einer sehr starken Kollagenase wie Kollagenase D führt zu einer großen Population von Immunzellen und einem geringeren Prozentsatz an Epithelzellen. Die Verwendung von Kollagenase P ermöglicht eine Pankreasverdauung, die für intaktes oder Tumor-Pankreasgewebe geeignet ist.
Basierend auf unseren Beobachtungen können alle Zelltypen isoliert werden. Wir haben bereits die Infiltration von Immun-T-Zellen validiert, z. B. mit Hilfe der Immunhistochemie5; Wir glauben, dass die relative Zellzahl, die wir in unserer Analyse beobachtet haben, eine richtige Annäherung an die tatsächliche Repräsentation von Zellen im Gewebe ist, mit Ausnahme von Azinuszellen, die zerbrechlich sind und daher unterrepräsentiert waren. Wir empfehlen die Verwendung von Immunhistochemie oder räumlicher Transkriptomik10,11,12, wenn genaue Proportionen von Zelltypen im Gewebe erforderlich sind. Darüber hinaus beobachteten wir, dass die Dissoziation von Gewebe von Wildtyp-Mäusen in Abwesenheit einer konstitutiv aktiven KRAS-Expression schwieriger ist und eine häufigere Überwachung erfordert, um die enzymatische Reaktion rechtzeitig durch Zugabe von 10% FBS zum Waschpuffer zu stoppen und einen massiven Zelltod zu vermeiden. Dies stimmt auch mit der Kontamination durch einige sehr häufig vorkommende azinäre Transkripte, wie z.B. Cpa1, überein, obwohl unser Protokoll dieses Problem minimiert.
Die Zellisolierung kann z.B. für die scRNA-Sequenzierung, wie wir gezeigthaben 5, für die Kultivierung von Zellen oder als Ausgangsmaterial für Organoide verwendet werden.
Der Bedarf an frischem Gewebe ist eine Einschränkung der Methode. Ein alternativer Ansatz, der sich auf die Isolierung von Zellkernen konzentriert, die Einzelkern-RNA-Sequenzierung (sNuc-seq)13, wurde kürzlich verwendet, um PDAC-Tumore von Patienten mit einer Einzelzellauflösung zu untersuchen11; In Zukunft wird es interessant sein, die Datenqualität von Pankreasepithelzellen, die aus sNuc-seq gewonnen werden, mit der von scRNA-seq zu vergleichen. Wichtig ist, dass die Zellkernextraktion keine Zellkultivierung zulässt und die Sortierung zur Anreicherung für bestimmte Zelltypen äußerst schwierig ist. Daher wird das Gewebedissoziationsprotokoll in Zukunft für scRNA-seq-Experimente und für diese zusätzlichen Anwendungen nützlich sein.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass es keine konkurrierenden Interessen gibt.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Avital Sarusi-Portuguez für die Hilfe bei der Datenanalyse und Dr. Dror Kolodkin-Gal für die Unterstützung bei der Erstellung des Protokolls in einer früheren Studie. Wir danken allen ehemaligen und gegenwärtigen Mitgliedern des Parnas-Labors. Wir danken Dr. Gillian Kay und Dr. Michael Kanovsky für ihre Hilfe bei der Bearbeitung. Dieses Projekt wurde durch das Stipendium der Israel Science Foundation (Nr. 526/18 O.P.), das Alex U. Soyka Programm und ein Stipendium des Israel Cancer Research Fund (Research Career Development Award) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent or Resource | |||
| 70 µm nylon mesh | Corning | cat##431751 | |
| BSA | Sigma Aldrich | cat# A7906 | |
| Collagenase P | Roche | cat# 11213857001 | |
| Critical Commercial Assay | |||
| DAPI | Sigma Aldrich | cat#MBD0015 | |
| Dnase I | Roche | cat# 10104159001 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Fetal Bovine Serum South American | ThermoFisher | Cat#10270106 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Biological industries | cat#02-018-1A | |
| KRASLSL-G12D mice | Jackson Laboratory | JAX008179 | |
| MACS dead cells removal kit | Milteny Biotec | cat#130-090-101 | |
| PBS | Biological industries | cat#02-023-1A | |
| Ptf1a-CreER mice | Jackson Laboratory | JAX019378 | |
| Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX007908 | |
| Trypsin C-EDTA 0.05% | Biological industries | cat# 03-053-1A | |
| Trypsin inhibitor | Roche | cat#T6522 |
References
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