Summary
膵臓の転生細胞は、膵臓腫瘍を引き起こす悪性細胞の前駆体です。しかし、無傷の生膵細胞を単離することは困難です。ここでは、膵臓組織を解離するための効率的な方法を紹介します。その後、細胞はシングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)または2次元または3次元の共培養に使用できます。
Abstract
膵臓には、ホルモンを産生・分泌する内分泌系と、膵臓の約90%を占め、消化酵素を産生・分泌する細胞を含む外分泌系の2つの主要なシステムがあります。消化酵素は膵腺房細胞で産生され、接合菌と呼ばれる小胞に蓄えられ、膵管 を介して 十二指腸に放出され、代謝プロセスを開始します。腺房細胞によって産生される酵素は、細胞を殺したり、無細胞RNAを分解したりする可能性があります。さらに、腺房細胞は壊れやすく、一般的な解離プロトコルでは、多数の死細胞と無細胞プロテアーゼおよびRNaseが生じます。したがって、膵臓組織の消化における最大の課題の1つは、無傷で生存可能な細胞、特に腺房細胞を回復させることです。この記事で紹介するプロトコルは、このニーズを満たすために開発した2段階の方法を示しています。プロトコルが正常な膵臓、前悪性病変を含んでいる膵臓、または多数の間質および免疫細胞を含んでいる膵臓の腫瘍を消化するのに使用することができる。
Introduction
膵管腺がん(PDAC)は、最も侵攻性のがんの1つです1。臨床的証拠は、PDACがKRASがん原遺伝子2の変異によって引き起こされる腺房細胞を含む外分泌系細胞から長年にわたって発生するという考えを支持しています。
膵臓腫瘍には多くの異なる種類の細胞が含まれ、悪性細胞は腫瘍量の20%〜50%にしかカウントされないことが実証されています3。さまざまな種類の細胞が上皮細胞と相互作用し、その形質転換をサポートし、腫瘍の形成と増殖を促進します。初期のイベントは腺房化生を引き起こし、膵臓上皮内腫瘍(PanIN)と呼ばれる顕微鏡的病変を引き起こし、場合によってはPDAC4に発展する可能性があります。
これらの相互作用を調査し、重要なシグナルを標的にすることが非常に重要になっています。シングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)は、シングルセルの分解能で遺伝子発現を明らかにする強力な手法であり、それによって上皮細胞が受ける変化を追跡し、膵臓がんの発生の調査を可能にします。
単一細胞への組織の解剖と消化は、scRNA-seq実験の最初の段階です。いくつかの要因により、膵臓組織の消化が特に困難になります:i)腺房細胞は膵臓の90%以上を占め、腺房細胞には、RNAベースのライブラリの質を低下させるプロテアーゼやRNaseなどの消化酵素が大量に含まれています。(ii)腺房細胞は非常に敏感であり、標準的なプロトコルを使用すると溶解する可能性があります。(iii)腺房細胞は、少数の遺伝子を非常に高いレベルで発現します。したがって、実験中にこれらの細胞を溶解すると、他の細胞の観察された遺伝子発現プロファイルが汚染される可能性があります。(iv)腫瘍から回収された膵臓組織は線維形成性であり、細胞を傷つけずに解剖することは困難です。したがって、すべての細胞タイプで高い生存率を維持する必要がありますが、腺房細胞の数と感度が大きいため、複雑さが増します。これらの要因により、scRNA-seq実験に必要な80%以上の生存率と凝集塊のない単一細胞懸濁液の実現が困難になります。
ここでは、トリプシンCとコラゲナーゼPを使用し、頻繁な組織モニタリングとともにプロトコルを開発しました。これにより、単一細胞への解離がサポートされ、高い生存率が維持され、scRNA-seq実験の成功を裏付けます5,6。
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Protocol
ヘブライ大学(イスラエル、エルサレム)とハダサ医療センター(イスラエル、エルサレム)の合同倫理委員会(動物実験委員会)は、動物福祉のための研究計画書(MD-18-15417-5「マウスの膵臓癌における組織動態」)を承認し、ここで提示されたプロトコルは、動物実験と研究に関連するすべての倫理規則に準拠しています。ヘブライ大学は、実験動物ケアの評価と認定のための協会国際認定機関です。
注:マウス株ストック#007908、ストック#019378、およびストック#008179は、ジャクソンの研究室から入手しました。PRT(Kras+/LSL-G12D;Ptf1a-CreERです。Rosa26LSL-tdTomato)マウスは、上記の系統を交配して作製した。この研究には、生後6週間から15ヶ月までの男女のマウスが用いられた。タモキシフェンは、粉末をコーン油に溶解することによって調製した。成体マウス(6〜8週齢、雌雄)に、0日目と2日目に400 mg / kgの用量でタモキシフェンを皮下注射し、注射後に週2回検査しました。.腫瘍は内部に位置していたため、測定することはできなかった。したがって、安楽死は、倫理的プロトコルに従って異常な臨床徴候が観察された場合に行われました。マウスは、タモキシフェン導入後のさまざまな時点で、イソフルランと子宮頸部脱臼を使用して安楽死させました。
1.膵臓解剖
注:抽出中の収量を最適化し、良好な細胞生存率を確保するためには、迅速な解剖が重要です。膵臓の分離に必要な時間を短縮するには、マウスを安楽死させる前に、すべての器具と機器を氷上で準備する必要があります。
- CO2窒息によりマウスを安楽死させ、子宮頸部脱臼を用いて検証する。このステップから、すべての手順は滅菌された解剖器具で実行する必要があります。
- マウスを固定し、腹部に70%エタノールをスプレーします。ハサミと鉗子で陰部を2.5cmのV字状に切開し、上に向かって腹腔を全開にします。
- マウスの左側にある胃を見つけます。脾臓の近くにある膵臓を見つけます。2つの鉗子を使用して、膵臓を胃と十二指腸から分離します(裂け目なし)。続けて、膵臓を小腸、空腸、回腸から分離します。
- 膵臓をマウスの右側に移動します。膵臓と胸腔の間の残りの接続を鉗子で分離して、膵臓と付着した脾臓を完全に剥離します。
- 膵臓を取り出し、氷の上のペトリ皿に広げて検査します。
注意: このステップでは、細胞の汚染を避けるために、膵臓のみを除去し、腸間膜脂肪組織または膵臓と他の隣接する組織を除去しないように注意する必要があります。
2.膵臓の酵素的および機械的解離
- 以下のバッファーをあらかじめ用意しておきます。
- 解離緩衝液 1:各サンプルに 4 mL のトリプシン C + 6 mL のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)( 表 1 を参照)。
- 解離緩衝液 2:9 mL のハンクス平衡塩溶液(HBSS)1x;4%ウシ血清アルブミン(BSA);1 mL のコラゲナーゼ P (10 mg/mL);200 μL のトリプシン阻害剤 (10 mg/mL);および 200 μL の DNase I(10 mg/mL)( 表 1 を参照)。
- 洗浄バッファー:50 mLのHBSS 1x;2gのBSA。1 mLのトリプシン阻害剤(10 mg / mL);DNase 1 1 1 mL(10 mg/mL)を添加します。
- 酵素活性停止液:5%ウシ胎児血清(FBS)とDNase I(0.2mg/mL)150gを含有するHBSS 1x。
- 膵臓を氷上の50mLチューブに入れます。HBSS 1xの10%FBSで膵臓をすすぎます。脂肪組織が浮遊し、膵臓が沈みます。これは、膵臓にまだ付着している汚染された白色脂肪組織を視覚化し、迅速に除去する簡単な方法です。
- マウスの膵臓組織を、氷上で5 mLのHBSS 1xを含む滅菌シャーレに移します。膵臓を1〜3mm3 の小片に、Noyesハサミとメスを使用して切断します(図2A)。複数のサンプルの場合、サンプルは10%FBS / HBSS 1xで氷上に保管する必要があります。
- 組織を遠心分離管に移します。350 x g 、4°C、5分間遠心分離します。上清を吸引して廃棄し、細胞片と血球を除去します。
- 0.02%トリプシンC-0.05%EDTAを含む解離バッファー1に、37°Cで10分間、撹拌(180rpm)しながら再懸濁します。直ちに10%FBS/ダルベッコ変性イーグル培地(DMEM)で洗浄します。4°C、350gで5分間遠心分離します。
- ペレットを10 mLの洗浄バッファーに再懸濁し、350 x g で4°Cで5分間遠心分離してから、次の解離ステップを行って再度洗浄します。
- 膵臓を解離バッファー2で37°Cで15分間、撹拌(180rpm)しながらインキュベートします。
- 15分後、サイズを小さくした滅菌ピペット(25、10、5 mLの血清ピペット)で膵臓断片を上下に激しくピペッティングして機械的解離を行い、37°Cに戻します。
- さらに5分後、機械的解離を繰り返し、光学顕微鏡を使用して、単一細胞懸濁液の量に応じて解離をモニターします。通常、この段階で懸濁液の90%未満が単離された単一細胞で構成されている場合、より長いインキュベーション時間が必要です。トリパンブルーを使用して、細胞の生存率をモニターします。
- インキュベーションを続行し、5分ごとに解離を検出するためのサンプルを採取します。
注:合計インキュベーション時間は組織によって異なり、サンプルによって異なる場合があります。インキュベーションと組織の解離は、細胞の90%が単一細胞に分離されたとき、または生存率の低下が検出されたときに終了する必要があります。
- 膵臓組織が十分に解離した後(膵臓断片の消失と溶液の濁度の増加に対応)(図2)、酵素活性停止液で4°Cで5分間2回洗浄して酵素反応を停止します。 このステップから、細胞懸濁液を氷上に保管します。
- 細胞懸濁液を70μmのナイロンメッシュに通し、顕微鏡で細胞の生存率を確認します。ナイロンメッシュのサイズが小さいと、細胞の生存率が低下する可能性があります。
- ペレットを再懸濁し、5〜10 mLの氷冷緩衝洗浄液で洗浄します。セルを数えます。
- 複数の赤血球が観察された場合は、赤血球溶解緩衝液で室温で2分間処理します。凝集塊が観察された場合は、ステップ2.5で説明したように、サンプルをトリプシンで再度処理する必要があります。生存率は顕微鏡下のトリパンブルーで検出し、生存率が80%未満の場合は、MACS MSカラムを備えた磁気活性化細胞ソーティング(MACS)死細胞除去キットを使用して生細胞を単離する必要があります( 表1を参照)。
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Representative Results
最近発表された研究5では、上記のプロトコルを適用して、マウスモデルを使用してPDAC開発の初期段階を調査しました。マウスは、タモキシフェン注射後に腺房細胞で恒常的に活性なKRASを発現させるカセットPtf1a-CreER、LSL-Kras-G12D、LSL-tdTomato7を含むように遺伝子操作されました。
子宮頸部脱臼後(マウスの倫理的プロトコルによる)、膵臓を切除し、上記のプロトコルを適用しました( 図1およびプロトコルを参照)。
解離プロトコルを最適化するために、解離は、トリプシンCによる組織のプレインキュベーションの有無にかかわらず行った。トリプシンCとのプレインキュベーションは、生存率に影響を与えることなく解離を促進することがわかりました。さらに、コラゲナーゼD、コラゲナーゼ1a、コラゲナーゼPなど、さまざまなコラゲナーゼを試しました( 表 1を参照)。コラゲナーゼDを使用すると、大量の細胞死が発生することがわかり、実際、このコラゲナーゼを使用した他の研究では、腺房細胞の割合は非常に小さかった8。また、コラゲナーゼ1aを用いて90分間インキュベートした後でも、組織は解離しなかったため、期待した結果が得られませんでした。コラゲナーゼPだけが組織を解離し、すべての細胞タイプの高い生存率を維持することができました。
これらの実験は、タモキシフェン注射後の7つの異なる時点で繰り返されました。腺房から乳管への化生とPanIN病変の形成と同時に、線維芽細胞を含む間質細胞と免疫細胞の蓄積があり、組織は線維形成性および硬くなりました。タモキシフェン注射後のさまざまな時点により、いくつかの異なる組織状態でプロトコルを調べ、上皮細胞、間質細胞、および免疫細胞の回復を測定することができました。
マウスの写真を図2Aに、単離した膵臓(ふわふわの組織)を図2Cに示します。組織の赤い色は、腺房細胞におけるtdTomatoの発現に起因します。このプロトコルは、すべての組織状態とヒトサンプルで正常に使用されました。ただし、トリプシンおよびコラゲナーゼとのインキュベーション時間は異なる場合があります。したがって、サンプルをモニターし、顕微鏡下で数分ごとに組織と細胞の生存率の解離を観察することが重要です。解離プロトコルの初期段階では、単離された細胞の数が少なく、凝集塊の数が多かった(図2D、左)。私たちの目的は、図2D(中央)に示すように、生細胞を単離し、生細胞数の減少を回避することでした(図2D、右)。
インキュベーション時間が長くなると、細胞の生存率が低下することに注意することが重要です。0.5 x 10 cm3 サイズの組織から始めて、合計5 x 106細胞を回収し、そのうち5 x 105 は tdTomato 陽性細胞でした。 図3の蛍光活性化細胞選別(FACS)解析によると、当社の膵臓解離プロトコルは、腺房細胞、乳管細胞、内皮細胞、線維芽細胞、免疫細胞、生存率の高い周皮細胞など、複数の細胞タイプの回収をサポートします。しかし、tdTomato 陽性細胞を含む膵臓凍結切片の蛍光画像から推測される、解離前の組織中の各タイプの細胞数の実際の比率は異なる可能性があります(図2E)。上記で詳述したプロトコルを使用して達成された高い生存率は、FACS分析(図3)および血球計算盤を使用して行われた生細胞/死細胞のカウント(図3H)によって示されています。
各サンプルについてscRNA-seqを実施し、FACS解析と同様に、タモキシフェン注射後のすべての時点から切除した各組織において、上記のすべての細胞タイプ(図4A、B)が検出されることを確認しました。また、カルボキシペプチダーゼ1をコードするカルボキシペプチダーゼ1(Cpa1)の発現についても調べました。腺房細胞におけるCpa1の発現は非常に高く、腺房細胞が解離中にどの程度溶解したか、また、他の細胞タイプのトランスクリプトームをどの程度汚染したかを示すことができます。図4C、Dに見られるように、最小限の汚染が検出されました。また、緩やかな解離により生存率が高くなり、追加の実験のために目的の細胞タイプの細胞選別をフォローアップすることができます(図3)。
解離プロトコルの品質は、scRNA-seqを含むさまざまなフォローアップ実験をサポートします。
図1:プロトコルのスキーム。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:膵臓細胞の単離。 (A)腹腔を全開した後のマウスの膵臓(赤)、肝臓、脾臓の写真。(B)膵臓摘出後の(A)と同じマウス。(C)膵臓の解剖。動物から取り出された後の膵臓(左)。切断後の膵臓は細かく砕かれます(中央)。遠心分離後の相分離(右)。(D)顕微鏡下で細胞をモニタリングし、単一細胞の生存率を調べる。初代膵臓細胞の完全分離(20倍)。15分間の酵素反応後の細胞の塊(左)。25分間の酵素反応後の単一細胞懸濁液(中央)。長時間のインキュベーション後の細胞生存率の低下(右)。(E)凍結膵臓切片の蛍光画像。腺房細胞は tdTomato 陽性です。青色に染色されたDAPI(40倍の写真)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:膵臓癌の単一細胞懸濁液のFACS分析 。 (A) tdTomato 陽性細胞と陰性細胞。(B)未選別(赤)と選別済み(青)のアドシナ細胞のフローサイトメトリー。(C、F)未染色細胞、APCおよびPB450。(D)内皮細胞のマーカーである抗CD31で染色した後のFACS分析。(E)周皮細胞のマーカーである抗CD140bで染色した後のFACS分析。(G)樹状細胞およびマクロファージのマーカーである抗CD11cで染色した後のFACS分析。(H)4つの異なる膵臓細胞単離における生細胞と死細胞の比率。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:本稿で説明したプロトコルを使用して作成されたscRNA-seqデータの解析。 (A)パネルの右側に示されているように、タモキシフェン注射後の異なる時点でのマウス膵臓のscRNA-seqを示すUMAP。(B)細胞型は、既知のマーカーに基づいて決定した。(C、D)細胞は、Cpa1の発現量( C)またはtdTomatoの発現量( D)に応じて着色されます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この記事では、膵臓組織解離のプロトコルを紹介します。このプロトコルはシンプルで使いやすく、固形腫瘍を含む悪性腫瘍プロセス中のさまざまな段階で、膵臓組織から生細胞を分離するためのツールを提供します。以前の研究では、膵臓を消化するためにさまざまな種類のコラゲナーゼが使用されました8,9。コラゲナーゼDなどの非常に強力なコラゲナーゼを使用すると、免疫細胞の集団が多くなり、上皮細胞の割合が低くなります。コラゲナーゼPの使用により、無傷または腫瘍の膵組織に適した膵臓消化が可能になります。
私たちの観察に基づいて、すべての細胞タイプを単離することができます。私たちは以前、免疫組織化学5を用いて免疫T細胞の浸潤を検証しました。分析で観察された相対的な細胞数は、壊れやすく、したがって過小評価されていた腺房細胞を除いて、組織内の細胞の実際の表現に適切な近似であると考えています。組織内の細胞タイプの正確な比率が必要な場合は、免疫組織化学または空間トランスクリプトミクス10、11、12を使用することをお勧めします。さらに、恒常的に活性なKRAS発現がない場合の野生型マウスからの組織の解離は、洗浄バッファーに10%FBSを添加して酵素反応を時間通りに停止し、大量の細胞死を回避するために、より困難であり、より頻繁なモニタリングが必要であることを観察しました。これは、Cpa1などの非常に豊富なアシナ転写産物からの汚染とも一致していますが、私たちのプロトコルではこの問題が最小限に抑えられています。
細胞単離は、5で示したようにscRNA-seq、細胞の培養、またはオルガノイドの出発物質などに使用できます。
新鮮な組織の必要性は、この方法の1つの制限です。核の単離に焦点を当てた代替アプローチである単一核RNAシーケンシング(sNuc-seq)13は、最近、患者からのPDAC腫瘍を単一細胞の分解能で調査するために使用されました11。今後、sNuc-seqから得られた膵上皮細胞のデータ品質をscRNA-seqと比較することは興味深いことです。重要なことは、核抽出では細胞培養ができず、特定の細胞タイプを濃縮するための選別は非常に困難であるということです。したがって、組織解離プロトコルは、将来、scRNA-seq実験やこれらの追加アプリケーションに役立ちます。
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Disclosures
著者らは、競合する利害関係がないことを宣言します。
Acknowledgments
データ解析に協力してくださったAvital Sarusi-Portuguez博士と、以前の研究でプロトコルを確立するための支援をしてくれたDror Kolodkin-Gal博士に感謝します。パルナス研究室の過去および現在のすべてのメンバーに感謝します。編集に協力してくださったGillian Kay博士とMichael Kanovsky博士に感謝します。このプロジェクトは、イスラエル科学財団の助成金(No.526/18 O.P.)、Alex U. Soyka Program、およびIsrael Cancer Research Fund(Research Career Development Award)の助成金を受けています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent or Resource | |||
| 70 µm nylon mesh | Corning | cat##431751 | |
| BSA | Sigma Aldrich | cat# A7906 | |
| Collagenase P | Roche | cat# 11213857001 | |
| Critical Commercial Assay | |||
| DAPI | Sigma Aldrich | cat#MBD0015 | |
| Dnase I | Roche | cat# 10104159001 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Fetal Bovine Serum South American | ThermoFisher | Cat#10270106 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Biological industries | cat#02-018-1A | |
| KRASLSL-G12D mice | Jackson Laboratory | JAX008179 | |
| MACS dead cells removal kit | Milteny Biotec | cat#130-090-101 | |
| PBS | Biological industries | cat#02-023-1A | |
| Ptf1a-CreER mice | Jackson Laboratory | JAX019378 | |
| Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX007908 | |
| Trypsin C-EDTA 0.05% | Biological industries | cat# 03-053-1A | |
| Trypsin inhibitor | Roche | cat#T6522 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Peng, J., et al. Author correction: single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Research. 29 (9), 777 (2019).
- Hruban, R. H., Wilentz, R. E., Kern, S. E.
- Schlesinger, Y., et al. Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells' heterogeneity. Nature Communications. 11 (1), 4516 (2020).
- Kolodkin-Gal, D., et al. Senolytic elimination of Cox2-expressing senescent cells inhibits the growth of premalignant pancreatic lesions. Gut. 71 (2), 345-355 (2021).
- Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
- Elyada, E., et al. Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts. Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).
- Bernard, V., et al. Single-cell transcriptomics of pancreatic cancer precursors demonstrates epithelial and microenvironmental heterogeneity as an early event in neoplastic progression. Clinical Cancer Research. 25 (7), 2194-2205 (2019).
- Moncada, R., et al. Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas. Nature Biotechnology. 38 (3), 333-342 (2020).
- Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptome profiling of pancreatic cancer identifies multicellular dynamics associated with neoadjuvant treatment. Nature Genetics. 54 (8), 1178-1191 (2022).
- Cui Zhou, D., et al. Spatially restricted drivers and transitional cell populations cooperate with the microenvironment in untreated and chemo-resistant pancreatic cancer. Nature Genetics. 54 (9), 1390-1405 (2022).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
