Summary
Metaplastiske celler i bukspyttkjertelen er forløpere for ondartede celler som gir opphav til svulster i bukspyttkjertelen. Imidlertid er det utfordrende å isolere intakte levedyktige bukspyttkjertelceller. Her presenterer vi en effektiv metode for dissosiasjon av bukspyttkjertelvev. Cellene kan deretter brukes til encellet RNA-sekvensering (scRNA-seq) eller til to- eller tredimensjonal samdyrking.
Abstract
Bukspyttkjertelen inneholder to hovedsystemer: det endokrine systemet, som produserer og utskiller hormoner, og det eksokrine systemet, som står for ca 90% av bukspyttkjertelen og inkluderer celler som produserer og utskiller fordøyelsesenzymer. Fordøyelsesenzymer produseres i bukspyttkjertelen acinarceller celler, lagret i vesikler kalt zymogens, og blir deretter sluppet ut i tolvfingertarmen via bukspyttkjertelen kanalen for å initiere metabolske prosesser. Enzymene produsert av acinarceller kan drepe celler eller nedbryte cellefritt RNA. I tillegg er acinarceller skjøre, og vanlige dissosiasjonsprotokoller resulterer i et stort antall døde celler og cellefrie proteaser og RNaser. Derfor er en av de største utfordringene i fordøyelsen av bukspyttkjertelvev å gjenopprette intakte og levedyktige celler, spesielt acinarceller. Protokollen som presenteres i denne artikkelen viser en to-trinns metode som vi utviklet for å møte dette behovet. Protokollen kan brukes til å fordøye normal pankreata, pankreata som inkluderer pre-maligne lesjoner eller bukspyttkjerteltumorer som inkluderer et stort antall stromale og immunceller.
Introduction
Pankreasduktalt adenokarsinom (PDAC) er en av de mest aggressive krefttypene1. Kliniske bevis støtter forestillingen om at PDAC utvikler seg fra eksokrine systemceller, inkludert acinarceller, over mange år, drevet av mutasjoner i KRAS-proto-onkogenet2.
Bukspyttkjerteltumorer inkluderer mange forskjellige celletyper, og det har vist seg at ondartede celler teller for bare 20% -50% av tumormassen3. Ulike celletyper samhandler med epitelcellene, støtter deres transformasjon og forbedrer tumordannelse og vekst. Tidlige hendelser forårsaker acinarmetaplasi, som gir mikroskopiske lesjoner kalt pankreas intraepitelial neoplasi (PanINs), som i noen tilfeller kan utvikle seg til PDAC4.
Det er et kritisk behov for å undersøke disse interaksjonene og målrette pivotale signaler. Enkeltcelle RNA-sekvensering (scRNA-seq) er en kraftig metode som avslører genuttrykk ved en enkeltcelleoppløsning, og derved sporer endringene som epitelceller gjennomgår, og dermed muliggjør utforskning av utvikling av kreft i bukspyttkjertelen.
Vevsdisseksjon og fordøyelse til enkeltceller er det første stadiet i et scRNA-seq-eksperiment. Flere faktorer gjør fordøyelsen av bukspyttkjertelvev spesielt utfordrende: i) acinarceller står for mer enn 90% av bukspyttkjertelen og acinarceller inneholder store mengder fordøyelsesenzymer, inkludert proteaser og RNaser som reduserer kvaliteten på RNA-baserte biblioteker; (ii) acinarceller er svært følsomme og kan lyse hvis standardprotokoller brukes; (iii) Acinarceller uttrykker et lite antall gener på svært høye nivåer. Derfor, hvis disse cellene lyseres under forsøket, kan dette forurense den observerte genuttrykksprofilen til andre celler; (iv) Bukspyttkjertelvev gjenvunnet fra svulster er desmoplastisk, noe som gjør det vanskelig å dissekere uten å skade cellene. Således, selv om det er nødvendig å opprettholde høy levedyktighet av alle celletyper, legger det store antallet og følsomheten til acinarceller ytterligere kompleksitet. Disse faktorene medfører vanskeligheter med å oppnå en enkeltcellesuspensjon som er mer enn 80% levedyktig og ikke har klumper, slik det kreves for scRNA-seq-eksperimenter.
Her utviklet vi en protokoll ved hjelp av trypsin C og kollagenase P, sammen med hyppig vevsovervåking. Dette støtter dissosiasjon til enkeltceller samtidig som det beholder høy levedyktighet for å støtte suksessen til scRNA-seq-eksperimenter 5,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den felles etiske komiteen (Institutional Animal Care and Use Committee) ved Det hebraiske universitetet (Jerusalem, Israel) og Hadassah Medical Center (Jerusalem, Israel) godkjente studieprotokollen for dyrevelferd (MD-18-15417-5 "Tissue dynamics in pancreatic cancer in mice"), og protokollen presentert her overholdt alle relevante etiske forskrifter for dyreforsøk og forskning. Det hebraiske universitetet er en forening for vurdering og akkreditering av Laboratory Animal Care International-akkreditert institutt.
MERK: Musestammen lager # 007908, lager # 019378 og lager # 008179 ble hentet fra Jacksons laboratorium. PRT (Kras + / LSL-G12D; Ptf1A-CreER; Rosa26LSL-tdTomato) mus ble opprettet ved å krysse ovennevnte stammer. Mus fra begge kjønn, mellom 6 uker og 15 måneder, ble brukt til studien. Tamoxifen ble fremstilt ved å oppløse pulveret i maisolje. Voksne mus (6-8 ukers alder, hunner og hanner) ble injisert med tamoksifen subkutant på dag 0 og 2 med en dose på 400 mg/kg og undersøkt to ganger i uken etter injeksjonen. Det var ikke mulig å måle svulster da de var internt lokalisert; Derfor ble eutanasi utført hvis unormale kliniske tegn ble observert i henhold til den etiske protokollen. Mus ble avlivet ved forskjellige tidspunkter etter tamoksifeninduksjon, ved bruk av isofluran og cervikal dislokasjon.
1. Bukspyttkjertel disseksjon
MERK: For optimalt utbytte under ekstraksjon og for å sikre god celle levedyktighet, er rask disseksjon kritisk. For å korte ned tiden som kreves for isolering av bukspyttkjertelen, må alle instrumenter og utstyr være klare på is før musen avlives.
- Euthanize musen ved CO2 kvelning og verifisere ved hjelp av cervical dislokasjon. Fra dette trinnet må alle prosedyrer utføres med sterile dissekeringsinstrumenter.
- Fest musen og spray magen med 70% etanol. Lag et V-formet snitt på 2,5 cm i kjønnsområdet med saks og tang og fortsett oppover for å åpne bukhulen helt.
- Finn magen på venstre side av musen. Finn bukspyttkjertelen, som ligger nær milten. Separat bukspyttkjertelen fra mage og tolvfingertarm ved hjelp av to tang (uten å rive). Fortsett og separer bukspyttkjertelen fra tynntarmen, jejunum og ileum.
- Flytt bukspyttkjertelen til høyre side av musen. Separat de resterende forbindelsene mellom bukspyttkjertelen og thoraxhulen med tang for å løsne bukspyttkjertelen helt og vedlagt milt.
- Fjern bukspyttkjertelen og spred den ut for undersøkelse i en petriskål på is.
MERK: Det må utvises forsiktighet i løpet av dette trinnet for å fjerne bare bukspyttkjertelen, og ikke fjerne mesenterisk fettvev eller annet tilstøtende vev sammen med bukspyttkjertelen, for å unngå cellulær forurensning.
2. Enzymatisk og mekanisk dissosiasjon av bukspyttkjertelen
- Forbered følgende buffere på forhånd.
- Dissosiasjonsbuffer 1: 4 ml trypsin C + 6 ml fosfatbufret saltvann (PBS) (se tabell 1) for hver prøve.
- Dissosiasjonsbuffer 2: 9 ml Hanks balansert saltløsning (HBSS) 1x; 4% bovint serumalbumin (BSA); 1 ml kollagenase P (10 mg/ml); 200 mikrol trypsinhemmer (10 mg/ml); og 200 mikrol DNase I (10 mg/ml) (se tabell 1).
- Vaskebuffer: 50 ml HBSS 1x; 2 g BSA; 1 ml trypsinhemmer (10 mg/ml); og 1 ml DNase 1 (10 mg/ml).
- Enzymaktivitet stopp løsning: HBSS 1x inneholdende 5% føtal bovint serum (FBS) og 150 g DNase I (0,2 mg / ml).
- Plasser bukspyttkjertelen i et 50 ml rør på is. Skyll bukspyttkjertelen i 10% FBS i HBSS 1x. Fettvevet vil flyte og bukspyttkjertelen vil synke. Dette er en enkel måte å visualisere og raskt fjerne det forurensende hvite fettvevet som fortsatt er festet til bukspyttkjertelen.
- Overfør musens bukspyttkjertelvev til en steril petriskål som inneholder 5 ml HBSS 1x på is. Klipp bukspyttkjertelen i små biter på 1 til 3 mm3 ved hjelp av Noyes saks og en skalpell (figur 2A). Ved mer enn én prøve skal prøvene oppbevares på is i 10% FBS/HBSS 1x.
- Overfør vevet til et sentrifugerør. Sentrifuge ved 350 x g ved 4 °C i 5 minutter. Aspirer og kast supernatanten for å fjerne cellefragmenter og blodceller.
- Resuspender bitene i dissosiasjonsbuffer 1 som inneholder 0,02 % trypsin C-0,05 % EDTA i 10 minutter ved 37 °C under omrøring (180 rpm). Vask umiddelbart med 10% FBS / Dulbecco's modifisert Eagle's medium (DMEM). Sentrifuge i 5 minutter ved 350 g ved 4 °C.
- Vask igjen ved å resuspendere pelleten i 10 ml vaskebuffer og sentrifugere ved 350 x g i 5 minutter ved 4 °C før neste dissosiasjonstrinn.
- Inkuber pancreas i dissosiasjonsbuffer 2 i 15 minutter ved 37 °C med omrøring (180 rpm).
- Etter 15 minutter utfører du mekanisk dissosiasjon ved å pipettere pankreasfragmentene kraftig opp og ned i sterile pipetter av redusert størrelse (25, 10 og 5 ml serologiske pipetter) 10 ganger og bringe tilbake til 37 °C.
- Etter ytterligere 5 minutter, gjenta den mekaniske dissosiasjonen og bruk lysmikroskopi for å overvåke dissosiasjonen i henhold til mengden enkeltcellesuspensjon. Vanligvis hvis mindre enn 90% av suspensjonen på dette stadiet består av isolerte enkeltceller, er det nødvendig med en lengre inkubasjonstid. Bruk trypan blå for å overvåke cellens levedyktighet.
- Fortsett med inkubasjonen og ta prøver for å oppdage dissosiasjonen hvert 5. minutt.
MERK: Den totale inkubasjonstiden avhenger av vevet og kan variere mellom prøver. Inkubasjonen og vevsdissosiasjonen skal avsluttes når 90% av cellene er separert i enkeltceller eller når en reduksjon i levedyktigheten oppdages.
- Etter at pancreasvevet er godt dissosiert (svarer til bortfall av pankreasfragmenter og økende turbiditet i oppløsningen) (figur 2), stoppes den enzymatiske reaksjonen ved å vaske to ganger med enzymaktivitet stoppoppløsning i 5 minutter ved 4 °C. Fra dette trinnet, hold cellesuspensjonen på is.
- Før cellesuspensjonen gjennom et 70μm nylonnett og kontroller cellens levedyktighet under mikroskopet. Mindre størrelser av nylonnett kan redusere cellens levedyktighet.
- Oppløs og vask pelleten med 5-10 ml iskald bufret vaskeoppløsning. Tell cellene.
- Hvis flere røde blodlegemer observeres, behandle cellene med en rød blodcelle lysebuffer i 2 minutter ved romtemperatur. I tilfeller der det observeres kuler, bør prøven behandles på nytt med trypsin, som beskrevet i trinn 2.5. Levedyktighet oppdages med trypanblå under mikroskopet, og hvis levedyktigheten er mindre enn 80%, bør levende celler isoleres ved hjelp av magnetisk aktivert cellesortering (MACS) døde celler fjerningssett med MACS MS-kolonner (se tabell 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I et nylig publisert arbeid5 brukte vi protokollen beskrevet ovenfor for å utforske de tidlige stadiene av PDAC-utvikling ved hjelp av en musemodell. Musen ble genetisk konstruert for å inkludere kassettene Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato 7, som tillater ekspresjon av konstitutivt aktiv KRAS i acinarceller etter tamoxifeninjeksjon.
Etter cervikal dislokasjon (i henhold til museets etiske protokoll) ble bukspyttkjertelen resektert, og protokollen beskrevet ovenfor ble anvendt (se figur 1 og protokoll).
For å optimalisere dissosiasjonsprotokollen ble dissosiasjonen utført med eller uten pre-inkubasjon av vevet med trypsin C. Det ble funnet at pre-inkubasjon med trypsin C akselererte dissosiasjonen uten å påvirke levedyktigheten. I tillegg ble forskjellige kollagenaser, inkludert kollagenase D, kollagenase 1a og kollagenase P, forsøkt (se tabell 1). Det ble funnet at bruk av kollagenase D resulterte i massiv celledød, og faktisk i andre studier som brukte denne kollagenasen, var fraksjonen av acinarceller svært liten8. Bruken av kollagenase 1a ga heller ikke de forventede resultatene, da selv etter en 90 minutters inkubasjon med kollagenase 1a ble vevet ikke dissosiert. Bare kollagenase P tillot oss å dissociere vevet og opprettholde høy levedyktighet av alle celletyper.
Disse forsøkene ble gjentatt på syv forskjellige tidspunkter etter tamoxifeninjeksjon. Samtidig med acinar-til-duktal metaplasi og PanIN-lesjonsdannelse var det opphopning av stromale og immunceller, inkludert fibroblaster, og vevet ble desmoplastisk og stivt. De forskjellige tidspunktene etter tamoxifen-injeksjonen tillot oss å undersøke protokollen under flere forskjellige vevstilstander og måle utvinningen av epitel-, stromal- og immunceller.
Et bilde av en mus er vist i figur 2A og den isolerte bukspyttkjertelen, et luftig vev, er vist i figur 2C. Den røde fargen på vevet skyldes ekspresjonen av tdTomato i acinarcalene. Protokollen ble brukt med hell med alle vevstilstandene og med menneskelige prøver. Imidlertid kan inkubasjonstider med trypsin og kollagenase variere. Det er derfor viktig å overvåke prøven og observere dissosiasjonen av vevet og cellens levedyktighet hvert par minutter under mikroskopet. Tidlig i dissosiasjonsprotokollen var det lavt antall isolerte celler og et stort antall klumper (figur 2D, til venstre). Vårt mål var å oppnå isolerte levedyktige celler, som vist i figur 2D, midten, og unngå en reduksjon i antall levedyktige celler (figur 2D, høyre).
Det er viktig å merke seg at lengre inkubasjonstider reduserte cellens levedyktighet. Fra et vev 0,5 x 10 cm3 i størrelse, gjenvunnet vi totalt 5 x 106 celler, hvorav 5 x 105 var tdTomato positive celler. Ifølge fluorescensaktivert cellesortering (FACS) -analysen i figur 3, støtter vår bukspyttkjerteldissosiasjonsprotokoll gjenoppretting av flere celletyper, inkludert acinarceller, duktale celler, endotelceller, fibroblaster, immunceller og pericytter med høy levedyktighet. Imidlertid kan det faktiske forholdet mellom antall celler fra hver type i vevet før dissosiasjon være forskjellig, utledet fra fluorescensbildene av bukspyttkjertelfrosne seksjoner som inkluderer tdTomato-positive celler (figur 2E). Den høye levedyktigheten som oppnås ved bruk av protokollen beskrevet ovenfor, er vist ved FACS-analysen (figur 3) og telling av levende celler / døde celler gjort ved hjelp av et hemocytometer (figur 3H).
For hver prøve utførte vi scRNA-seq, og i samsvar med FACS-analysen bekreftet vi påvisning av alle ovennevnte celletyper (figur 4A,B), i hvert av resektert vev fra alle tidspunktene etter tamoxifen-injeksjon. Vi undersøkte også uttrykket av karboksypeptidase 1 (Cpa1), som koder for karboksypeptidase1. Cpa1-ekspresjon i acinarceller er ekstremt høy og kan indikere i hvilken grad acinarceller ble lysert under dissosiasjonen, samt i hvilken grad de har forurenset transkriptomet til andre celletyper. Vi påviste minimal forurensning, som det fremgår av figur 4C,D. Den milde dissosiasjonen resulterer også i høy levedyktighet som gjør at vi kan følge opp med cellesortering av ønskede celletyper for ytterligere eksperimenter (figur 3).
Sammen støtter kvaliteten på dissosiasjonsprotokollen forskjellige oppfølgingseksperimenter, inkludert scRNA-seq.
Figur 1: Skjema for protokollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Isolering av bukspyttkjertelceller. (A) Et bilde som viser bukspyttkjertelen (i rødt), leveren og milten i musen etter fullstendig åpning av bukhulen. (B) Samme mus som i (A) etter fjerning av bukspyttkjertelen. (C) Disseksjon av bukspyttkjertelen. Bukspyttkjertelen etter fjerning fra dyret (venstre). Bukspyttkjertelen etter spaltninger i små biter (midten). Faseseparasjon etter sentrifugering (høyre). (D) Overvåking av cellene under mikroskopet for å undersøke enkeltcelle levedyktighet. Total primær pankreascelleisolasjon (20x). Klumper av celler etter 15 min med enzymatisk reaksjon (venstre). Encellet suspensjon etter 25 minutter med enzymatisk reaksjon (midten). Redusert celle levedyktighet etter en lang inkubasjon (høyre). (E) Fluorescensbilder av et frosset pankreassnitt. Acinar celler er tdTomato positive; DAPI-farging i blått (bilde ved 40x). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: FACS-analyse av encellet suspensjon av kreft i bukspyttkjertelen . (A) tdTomat positive og negative celler. (B) Flowcytometri av usorterte (røde) versus sorterte (blå) acinarceller. (C,F) Ufargede celler, APC og PB450. (D) FACS-analyse etter farging med Anti-CD31, en markør for endotelceller. (E) FACS-analyse etter farging med Anti-CD140b, en markør for pericytter. (G) FACS-analyse etter farging med Anti-CD11c, en markør for dendrittiske celler og makrofager. (H) Forholdet mellom levende celler og døde celler i fire forskjellige pankreascelleisolasjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Analyse av scRNA-seq-data som ble produsert ved hjelp av protokollen som vi beskriver i den nåværende artikkelen. (A) UMAP som viser scRNA-seq av bukspyttkjertelen hos mus ved forskjellige tidspunkter etter tamoksifeninjeksjon, som angitt på høyre side av panelet. (B) Celletyper ble bestemt basert på kjente markører. (C,D) Celler er farget i henhold til uttrykksnivået av Cpa1 (i C) eller nivået av tdTomato (i D). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikkelen presenterer vi en protokoll for dissosiasjon av bukspyttkjertelvev. Protokollen er enkel, enkel å bruke, og gir et verktøy for å isolere levedyktige enkeltceller fra bukspyttkjertelvev på forskjellige stadier under malignitetsprosessen, inkludert solide svulster. I tidligere studier ble forskjellige typer kollagenaser brukt til å fordøye bukspyttkjertelen 8,9. Ved hjelp av en svært potent kollagenase, slik som kollagenase D, resulterer i en stor populasjon av immunceller og en lavere prosentandel av epitelceller. Bruken av kollagenase P tillater bukspyttkjertelfordøyelse som er egnet for intakt eller tumor bukspyttkjertelvev.
Basert på våre observasjoner kan alle celletyper isoleres. Vi har tidligere validert infiltrasjonen av immun-T-celler, for eksempel ved hjelp av immunhistokjemi5; Vi mener at det relative celletallet som vi observerte i vår analyse er en riktig tilnærming til den faktiske representasjonen av celler i vevet, bortsett fra Acinar-celler som er skjøre og derfor var underrepresentert. Vi anbefaler bruk av immunhistokjemi eller romlig transkriptomikk10,11,12 dersom det er behov for nøyaktige andeler av celletyper i vevet. I tillegg observerte vi at dissosiasjonen av vev fra villtypemus i fravær av konstitutivt aktivt KRAS-uttrykk er mer utfordrende og krever hyppigere overvåking, for å stoppe den enzymatiske reaksjonen i tide ved å legge 10% FBS til vaskebufferen og unngå massiv celledød. Dette er også konsistent med forurensning fra noen svært rikelig acinar transkripsjoner, for eksempel Cpa1, selv om vår protokoll minimerer dette problemet.
Celleisolasjonen kan brukes til scRNA-seq, som vi viste5, for dyrking av celler, eller som utgangsmateriale for organoider, for eksempel.
Behovet for ferskt vev er en begrensning av metoden. En alternativ tilnærming som fokuserer på isolering av kjerner, enkeltkjerne RNA-sekvensering (sNuc-seq)13, ble nylig brukt til å undersøke PDAC-svulster fra pasienter med en enkeltcelleoppløsning11; i fremtiden vil det være interessant å sammenligne datakvaliteten til bukspyttkjertelepitelceller som er oppnådd fra sNuc-seq sammenlignet med scRNA-seq. Det er viktig at kjerneutvinning ikke tillater celledyrking, og sortering for å berike for bestemte celletyper er ekstremt utfordrende. Derfor vil vevsdissosiasjonsprotokollen være nyttig i fremtiden for scRNA-seq-eksperimenter og for disse tilleggsapplikasjonene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Dr. Avital Sarusi-Portuguez for hjelp i dataanalyse og Dr. Dror Kolodkin-Gal for hjelp til å etablere protokollen i en tidligere studie. Vi takker alle tidligere og nåværende medlemmer av Parnas-laboratoriet. Vi takker Dr. Gillian Kay og Dr. Michael Kanovsky for deres hjelp i redigering. Dette prosjektet har mottatt finansiering fra Israel Science Foundation grant (nr. 526/18 OP), Alex U. Soyka Program, og et stipend fra Israel Cancer Research Fund (Research Career Development Award).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent or Resource | |||
| 70 µm nylon mesh | Corning | cat##431751 | |
| BSA | Sigma Aldrich | cat# A7906 | |
| Collagenase P | Roche | cat# 11213857001 | |
| Critical Commercial Assay | |||
| DAPI | Sigma Aldrich | cat#MBD0015 | |
| Dnase I | Roche | cat# 10104159001 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Fetal Bovine Serum South American | ThermoFisher | Cat#10270106 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Biological industries | cat#02-018-1A | |
| KRASLSL-G12D mice | Jackson Laboratory | JAX008179 | |
| MACS dead cells removal kit | Milteny Biotec | cat#130-090-101 | |
| PBS | Biological industries | cat#02-023-1A | |
| Ptf1a-CreER mice | Jackson Laboratory | JAX019378 | |
| Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX007908 | |
| Trypsin C-EDTA 0.05% | Biological industries | cat# 03-053-1A | |
| Trypsin inhibitor | Roche | cat#T6522 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Peng, J., et al. Author correction: single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Research. 29 (9), 777 (2019).
- Hruban, R. H., Wilentz, R. E., Kern, S. E.
- Schlesinger, Y., et al. Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells' heterogeneity. Nature Communications. 11 (1), 4516 (2020).
- Kolodkin-Gal, D., et al. Senolytic elimination of Cox2-expressing senescent cells inhibits the growth of premalignant pancreatic lesions. Gut. 71 (2), 345-355 (2021).
- Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
- Elyada, E., et al. Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts. Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).
- Bernard, V., et al. Single-cell transcriptomics of pancreatic cancer precursors demonstrates epithelial and microenvironmental heterogeneity as an early event in neoplastic progression. Clinical Cancer Research. 25 (7), 2194-2205 (2019).
- Moncada, R., et al. Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas. Nature Biotechnology. 38 (3), 333-342 (2020).
- Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptome profiling of pancreatic cancer identifies multicellular dynamics associated with neoadjuvant treatment. Nature Genetics. 54 (8), 1178-1191 (2022).
- Cui Zhou, D., et al. Spatially restricted drivers and transitional cell populations cooperate with the microenvironment in untreated and chemo-resistant pancreatic cancer. Nature Genetics. 54 (9), 1390-1405 (2022).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
