Summary
Метапластические клетки поджелудочной железы являются предшественниками злокачественных клеток, которые дают начало опухолям поджелудочной железы. Тем не менее, выделение неповрежденных жизнеспособных клеток поджелудочной железы является сложной задачей. Здесь мы представляем эффективный метод диссоциации тканей поджелудочной железы. Затем клетки могут быть использованы для секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq) или для двух- или трехмерного совместного культивирования.
Abstract
Поджелудочная железа включает в себя две основные системы: эндокринную, которая вырабатывает и секретирует гормоны, и экзокринную систему, которая составляет примерно 90% поджелудочной железы и включает клетки, вырабатывающие и секретирующие пищеварительные ферменты. Пищеварительные ферменты вырабатываются в ацинарных клетках поджелудочной железы, хранятся в везикулах, называемых зимогенами, а затем высвобождаются в двенадцатиперстную кишку через проток поджелудочной железы для запуска метаболических процессов. Ферменты, продуцируемые ацинарными клетками, могут убивать клетки или разрушать внеклеточную РНК. Кроме того, ацинарные клетки хрупки, и общие протоколы диссоциации приводят к большому количеству мертвых клеток и внеклеточных протеаз и РНКаз. Таким образом, одной из самых больших проблем в переваривании тканей поджелудочной железы является восстановление неповрежденных и жизнеспособных клеток, особенно ацинарных клеток. Протокол, представленный в этой статье, показывает двухэтапный метод, который мы разработали для удовлетворения этой потребности. Протокол может быть использован для переваривания нормальной поджелудочной железы, поджелудочной железы, которые включают предраковые поражения, или опухолей поджелудочной железы, которые включают большое количество стромальных и иммунных клеток.
Introduction
Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC) является одним из самых агрессивных типов рака1. Клинические данные подтверждают представление о том, что PDAC развивается из клеток экзокринной системы, включая ацинарные клетки, в течение многих лет, что обусловлено мутациями в протоонкогене KRAS2.
Опухоли поджелудочной железы включают в себя множество различных типов клеток, и было продемонстрировано, что злокачественные клетки составляют только 20-50% массы опухоли. Различные типы клеток взаимодействуют с эпителиальными клетками, поддерживают их трансформацию и усиливают образование и рост опухолей. Ранние события вызывают ацинарную метаплазию, которая приводит к микроскопическим поражениям, называемым интраэпителиальной неоплазией поджелудочной железы (PanINs), которые в некоторых случаях могут перерасти в PDAC4.
Существует острая необходимость в исследовании этих взаимодействий и нацеливании на ключевые сигналы. Секвенирование РНК одной клетки (scRNA-seq) является мощным методом, который выявляет экспрессию генов с разрешением одной клетки, тем самым отслеживая изменения, которые претерпевают эпителиальные клетки, что позволяет исследовать развитие рака поджелудочной железы.
Рассечение тканей и их расщепление на отдельные клетки является первым этапом эксперимента scRNA-seq. Несколько факторов делают пищеварение тканей поджелудочной железы особенно сложным: i) ацинарные клетки составляют более 90% поджелудочной железы, а ацинарные клетки содержат большое количество пищеварительных ферментов, включая протеазы и РНКазы, которые снижают качество библиотек на основе РНК; (ii) ацинарные клетки очень чувствительны и могут лизироваться при использовании стандартных протоколов; (iii) Ацинарные клетки экспрессируют небольшое количество генов на очень высоких уровнях. Поэтому, если эти клетки лизировать во время эксперимента, это может привести к контаминации наблюдаемого профиля экспрессии генов других клеток; (iv) ткань поджелудочной железы, извлеченная из опухолей, является десмопластической, что затрудняет ее вскрытие без повреждения клеток. Таким образом, несмотря на то, что требуется поддержание высокой жизнеспособности всех типов клеток, большое количество и чувствительность ацинарных клеток добавляют дополнительную сложность. Эти факторы затрудняют получение одноклеточной суспензии, жизнеспособной более чем на 80% и не имеющей скоплений, как это требуется для экспериментов scRNA-seq.
Здесь мы разработали протокол с использованием трипсина С и коллагеназы Р, а также частого мониторинга тканей. Это поддерживает диссоциацию на одиночные клетки, сохраняя при этом высокую жизнеспособность, что способствует успеху экспериментов scRNA-seq 5,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Объединенный комитет по этике (Institutional Animal Care and Use Committee) Еврейского университета (Иерусалим, Израиль) и медицинского центра «Хадасса» (Иерусалим, Израиль) одобрил протокол исследования по благополучию животных (MD-18-15417-5 «Тканевая динамика при раке поджелудочной железы у мышей»), и представленный здесь протокол соответствовал всем соответствующим этическим нормам для испытаний и исследований на животных. Еврейский университет является аккредитованным Международной ассоциацией по оценке и аккредитации института по уходу за лабораторными животными.
ПРИМЕЧАНИЕ: Штаммы мышей #007908, #019378 и #008179 были получены в лаборатории Джексона. ПРТ (Kras+/LSL-G12D; Ptf1a-CreER; Мыши Rosa26LSL-tdTomato) были созданы путем скрещивания вышеуказанных штаммов. Для исследования использовались мыши обоих полов в возрасте от 6 недель до 15 месяцев. Тамоксифен получали путем растворения порошка в кукурузном масле. Взрослым мышам (в возрасте 6-8 недель, самкам и самцам) вводили тамоксифен подкожно на 0-й и 2-й дни в дозе 400 мг/кг и обследовали два раза в неделю после инъекции. Невозможно было измерить опухоли по их внутреннему расположению; Поэтому эвтаназию проводили, если наблюдались аномальные клинические признаки согласно этическому протоколу. Мышей усыпляли в разные моменты времени после индукции тамоксифена, используя изофлуран и вывих шейки матки.
1. Расслоение поджелудочной железы
ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимального выхода во время экстракции и обеспечения хорошей жизнеспособности клеток решающее значение имеет быстрое препарирование. Чтобы сократить время, необходимое для изоляции поджелудочной железы, все инструменты и оборудование должны быть готовы на льду перед эвтаназией мыши.
- Усыпьте мышь с помощью удушьяСО2 и проверьте с помощью вывиха шейки матки. Начиная с этого этапа, все процедуры должны выполняться стерильными препарирующими инструментами.
- Зафиксируйте мышь и опрыскайте живот 70% этиловым спиртом. Ножницами и щипцами сделайте V-образный разрез 2,5 см в области гениталий и продвигайтесь вверх до полного раскрытия брюшной полости.
- Расположите живот с левой стороны мыши. Найдите поджелудочную железу, которая находится рядом с селезенкой. Отделите поджелудочную железу от желудка и двенадцатиперстной кишки с помощью двух щипцов (без разрыва). Продолжайте и отделите поджелудочную железу от тонкой кишки, тощей кишки и подвздошной кишки.
- Переместите поджелудочную железу в правую сторону от мыши. Отделите щипцами оставшиеся соединения между поджелудочной железой и грудной полостью, чтобы полностью отделить поджелудочную железу и прикрепленную селезенку.
- Удалите поджелудочную железу и разложите ее для исследования в чашке Петри на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе необходимо соблюдать осторожность, чтобы удалить только поджелудочную железу, а не брыжеечную жировую ткань или другие соседние ткани вместе с поджелудочной железой, чтобы избежать клеточного загрязнения.
2. Ферментативная и механическая диссоциация поджелудочной железы
- Заранее подготовьте следующие буферы.
- Диссоциационный буфер 1: 4 мл трипсина С + 6 мл фосфатного солевого буфера (PBS) (см. таблицу 1) для каждого образца.
- Диссоциационный буфер 2: 9 мл сбалансированного раствора соли Хэнкса (HBSS) 1x; 4% бычий сывороточный альбумин (БСА); 1 мл коллагеназы Р (10 мг/мл); 200 мкл ингибитора трипсина (10 мг/мл); и 200 мкл ДНКазы I (10 мг/мл) (см. таблицу 1).
- Буфер для промывки: 50 мл HBSS 1x; 2 г БСА; 1 мл ингибитора трипсина (10 мг/мл); и 1 мл ДНКазы 1 (10 мг/мл).
- Раствор для остановки активности ферментов: HBSS 1x, содержащий 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 150 г ДНКазы I (0,2 мг/мл).
- Поместите поджелудочную железу в пробирку объемом 50 мл на лед. Промыть поджелудочную железу в 10% FBS в HBSS 1x. Жировая ткань всплывет, а поджелудочная железа опустится. Это простой способ визуализировать и быстро удалить загрязняющую белую жировую ткань, все еще прикрепленную к поджелудочной железе.
- Перенесите ткань поджелудочной железы мыши в стерильную чашку Петри, содержащую 5 мл HBSS 1x на льду. Разрежьте поджелудочную железу на небольшие кусочки от 1 до 3мм3 с помощью ножниц Нойеса и скальпеля (рис. 2А). В случае более чем одной пробы образцы следует держать на льду в 10% FBS/HBSS 1x.
- Перенесите ткани в центрифужную пробирку. Центрифуга при 350 x g при 4 °C в течение 5 мин. Аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость для удаления фрагментов клеток и клеток крови.
- Повторно суспендировать кусочки в диссоциационном буфере 1, содержащем 0,02% трипсина С-0,05% ЭДТА, в течение 10 мин при 37 °C при перемешивании (180 об/мин). Немедленно вымойте 10% модифицированным средством Eagle's medium (DMEM) от FBS/Dulbecco. Центрифугу в течение 5 мин при 350 г при 4 °C.
- Промывают еще раз, повторно суспендировав гранулы в 10 мл буфера для промывки и центрифугируя при 350 x g в течение 5 мин при 4 °C перед следующим этапом диссоциации.
- Инкубируют поджелудочную железу в диссоциационном буфере 2 в течение 15 мин при 37 °C при перемешивании (180 об/мин).
- Через 15 мин проводят механическую диссоциацию, энергично пипетируя фрагменты поджелудочной железы вверх и вниз в стерильных пипетках уменьшения размера (серологические пипетки объемом 25, 10 и 5 мл) 10 раз и доводят до 37 °C.
- Еще через 5 мин повторите механическую диссоциацию и с помощью световой микроскопии контролируйте диссоциацию в зависимости от количества одноклеточной суспензии. Обычно, если на этом этапе менее 90% суспензии состоит из изолированных единичных клеток, необходим более длительный инкубационный период. Используйте трипановый синий для контроля жизнеспособности клеток.
- Продолжайте инкубацию и отбирайте пробы для обнаружения диссоциации каждые 5 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Общее время инкубации зависит от ткани и может варьироваться в зависимости от образца. Инкубация и диссоциация тканей должны закончиться, когда 90% клеток будут разделены на отдельные клетки или когда будет обнаружено снижение жизнеспособности.
- После того, как ткань поджелудочной железы хорошо диссоциирует (что соответствует исчезновению фрагментов поджелудочной железы и нарастанию помутнения раствора) (рис. 2), остановить ферментативную реакцию путем двукратного промывания раствором с активностью фермента в течение 5 мин при 4 °С. С этого шага держите клеточную суспензию на льду.
- Пропустите клеточную суспензию через нейлоновую сетку размером 70 мкм и проверьте жизнеспособность клетки под микроскопом. Меньшие размеры нейлоновой сетки могут снизить жизнеспособность клеток.
- Ресуспендируйте и промойте гранулу 5-10 мл ледяного буферного промывочного раствора. Подсчитайте ячейки.
- Если наблюдается несколько эритроцитов, обработайте клетки буфером для лизиса эритроцитов в течение 2 мин при комнатной температуре. В тех случаях, когда наблюдаются скопления, образец следует снова обработать трипсином, как описано в шаге 2.5. Жизнеспособность определяется с помощью трипанового синего под микроскопом, и если жизнеспособность составляет менее 80%, живые клетки следует выделять с помощью набора для удаления мертвых клеток с магнитно-активированной сортировкой клеток (MACS) со столбцами MACS MS (см. таблицу 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В недавно опубликованной работе5 мы применили протокол, описанный выше, для изучения ранних стадий разработки PDAC с использованием мышиной модели. Мышь была генетически модифицирована, чтобы включить кассеты Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato7, которые позволяют экспрессировать конститутивно активные KRAS в ацинарных клетках после инъекции тамоксифена.
После вывиха шейки матки (согласно этическому протоколу мыши) была проведена резекция поджелудочной железы и применен протокол, описанный выше (см. рис. 1 и протокол).
Для оптимизации протокола диссоциации диссоциацию проводили с предварительной инкубацией ткани трипсином С или без нее. Установлено, что прединкубационное исследование с трипсином С ускоряло диссоциацию, не влияя на жизнеспособность. Кроме того, были опробованы различные коллагеназы, включая коллагеназу D, коллагеназу 1a и коллагеназу P (см. таблицу 1). Было обнаружено, что использование коллагеназы D приводило к массивной гибели клеток, и действительно, в других исследованиях, в которых использовалась эта коллагеназа, доля ацинарных клеток былаочень мала. Применение коллагеназы 1а также не дало ожидаемых результатов, так как даже после 90-минутной инкубации с коллагеназой 1а ткань не диссоциировала. Только коллагеназа Р позволила диссоциировать ткань и сохранить высокую жизнеспособность всех типов клеток.
Эти эксперименты были повторены в семи различных временных точках после инъекции тамоксифена. Одновременно с ацинарно-протоковой метаплазией и образованием поражения PanIN происходило накопление стромальных и иммунных клеток, в том числе фибробластов, ткань становилась десмопластической и жесткой. Различные временные моменты после инъекции тамоксифена позволили нам изучить протокол при нескольких различных состояниях тканей и измерить восстановление эпителиальных, стромальных и иммунных клеток.
Фотография мыши показана на рисунке 2А, а изолированная поджелудочная железа, пушистая ткань, показана на рисунке 2С. Красный цвет ткани обусловлен экспрессией tdTomato в ацинарных клетках. Протокол был успешно использован со всеми состояниями тканей и с образцами человека. Однако время инкубации трипсина и коллагеназы может варьироваться. Поэтому важно контролировать образец и наблюдать за диссоциацией ткани и жизнеспособностью клеток каждые несколько минут под микроскопом. На ранней стадии протокола диссоциации наблюдалось низкое количество изолированных клеток и большое количество скоплений (рис. 2D, слева). Наша цель состояла в том, чтобы получить изолированные жизнеспособные клетки, как показано на рисунке 2D, посередине, и избежать уменьшения количества жизнеспособных клеток (рис. 2D, справа).
Важно отметить, что более длительное время инкубации снижало жизнеспособность клеток. Начиная с ткани размером 0,5 х 10 см3 , мы восстановили в общей сложности 5 х 106 клеток, 5 х 105 из которых были tdTomato положительными клетками. Согласно анализу флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) на рисунке 3, наш протокол диссоциации поджелудочной железы поддерживает восстановление нескольких типов клеток, включая ацинарные клетки, протоковые клетки, эндотелиальные клетки, фибробласты, иммунные клетки и перициты с высокой жизнеспособностью. Тем не менее, фактическое соотношение между количеством клеток каждого типа в ткани до диссоциации может быть различным, исходя из флуоресцентных изображений замороженных срезов поджелудочной железы, которые включают tdTomato-положительные клетки (рис. 2E). Высокая жизнеспособность, достигнутая с помощью протокола, описанного выше, показана анализом FACS (Рисунок 3) и подсчетом живых и мертвых клеток, выполненным с помощью гемоцитометра (Рисунок 3H).
Для каждого образца мы выполнили scRNA-seq и, в соответствии с анализом FACS, подтвердили обнаружение всех вышеупомянутых типов клеток (рис. 4A, B) в каждой из резецированных тканей во всех временных точках после инъекции тамоксифена. Мы также исследовали экспрессию карбоксипептидазы 1 (Cpa1), которая кодирует карбоксипептидазу1. Экспрессия Cpa1 в ацинарных клетках чрезвычайно высока и может указывать на то, в какой степени ацинарные клетки были лизированы во время диссоциации, а также на степень, в которой они контаминировали транскриптом других типов клеток. Мы обнаружили минимальное загрязнение, как видно на рисунке 4C, D. Мягкая диссоциация также приводит к высокой жизнеспособности, что позволяет нам продолжить сортировку желаемых типов клеток для дополнительных экспериментов (рис. 3).
В совокупности качество протокола диссоциации позволяет проводить различные последующие эксперименты, включая scRNA-seq.
Рисунок 1: Схема протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Выделение клеток поджелудочной железы. (А) Фотография, показывающая поджелудочную железу (красного цвета), печень и селезенку мыши после полного вскрытия брюшной полости. (Б) Та же мышь, что и в (А) после удаления поджелудочной железы. (В) Рассечение поджелудочной железы. Поджелудочная железа после удаления у животного (слева). Поджелудочная железа после расщепления на мелкие кусочки (середина). Разделение фаз после центрифугирования (справа). (D) Наблюдение за клетками под микроскопом для изучения жизнеспособности отдельных клеток. Тотальное первичное выделение клеток поджелудочной железы (20x). Скопления клеток через 15 минут ферментативной реакции (слева). Одноклеточная суспензия после 25 мин ферментативной реакции (средняя). Снижение жизнеспособности клеток после длительной инкубации (справа). (E) Флуоресцентные изображения замороженного отдела поджелудочной железы. Ацинарные клетки tdTomato положительны; Окрашивание DAPI в синий цвет (фото на 40х). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: FACS-анализ одноклеточной суспензии рака поджелудочной железы . (A) tdTomato положительные и отрицательные клетки. (B) Проточная цитометрия несортированных (красный) и сортированных (синий) ацинарных клеток. (С,Ж) Неокрашенные ячейки, APC и PB450. (D) Анализ FACS после окрашивания анти-CD31, маркером эндотелиальных клеток. (E) Анализ FACS после окрашивания анти-CD140b, маркером перицитов. (G) FACS-анализ после окрашивания Anti-CD11c, маркером дендритных клеток и макрофагов. (H) Соотношение живых и мертвых клеток в четырех различных изоляторах клеток поджелудочной железы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Анализ данных scRNA-seq, полученных с использованием протокола, который мы опишем в данной статье. (A) UMAP, показывающий scRNA-seq поджелудочной железы мыши в разные моменты времени после инъекции тамоксифена, как показано в правой части панели. (B) Типы клеток определялись на основе известных маркеров. (С,Д) Ячейки раскрашиваются в соответствии с уровнем экспрессии Cpa1 (в C) или уровнем tdTomato (в D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье мы представляем протокол диссоциации тканей поджелудочной железы. Протокол прост, удобен в использовании и предоставляет инструмент для выделения жизнеспособных единичных клеток из ткани поджелудочной железы на разных стадиях злокачественного процесса, включая солидные опухоли. В предыдущих исследованиях для переваривания поджелудочной железы использовались различные типы коллагеназ 8,9. Использование очень мощной коллагеназы, такой как коллагеназа D, приводит к большой популяции иммунных клеток и более низкому проценту эпителиальных клеток. Использование коллагеназы Р позволяет переваривать поджелудочную железу, что подходит для интактной или опухолевой ткани поджелудочной железы.
Исходя из наших наблюдений, можно выделить все типы клеток. Ранее мы валидировали инфильтрацию иммунных Т-клеток, например, с помощью иммуногистохимии5; Мы полагаем, что относительное количество клеток, которое мы наблюдали в нашем анализе, является правильным приближением к фактическому представлению клеток в ткани, за исключением ацинарных клеток, которые являются хрупкими и, следовательно, были недостаточно представлены. Мы рекомендуем использовать иммуногистохимию или пространственную транскриптомику10,11,12, если есть необходимость в точных пропорциях типов клеток в ткани. Кроме того, мы заметили, что диссоциация тканей мышей дикого типа при отсутствии конститутивно активной экспрессии KRAS является более сложной задачей и требует более частого мониторинга, чтобы вовремя остановить ферментативную реакцию путем добавления 10% FBS в буфер промывки и избежать массовой гибели клеток. Это также согласуется с контаминацией от некоторых очень распространенных ацинарных транскриптов, таких как Cpa1, хотя наш протокол сводит эту проблему к минимуму.
Выделение клеток может быть использовано для секвенирования scRNA, как мы показали5, для культивирования клеток или, например, в качестве исходного материала для органоидов.
Потребность в свежей ткани является одним из ограничений метода. Альтернативный подход, основанный на выделении ядер, секвенирование одноядерной РНК (sNuc-seq)13, недавно был использован для исследования опухолей PDAC у пациентов с одноклеточным разрешением11; В будущем будет интересно сравнить качество данных эпителиальных клеток поджелудочной железы, полученных из sNuc-seq, с scRNA-seq. Важно отметить, что экстракция ядра не позволяет культивировать клетки, а сортировка для обогащения для определенных типов клеток чрезвычайно сложна. Таким образом, протокол диссоциации тканей будет полезен в будущем для экспериментов scRNA-seq и для этих дополнительных приложений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Авиталь Саруси-Португес за помощь в анализе данных и д-ра Дрора Колодкина-Гала за помощь в создании протокола в предыдущем исследовании. Мы благодарим всех бывших и нынешних сотрудников лаборатории «Парнас». Благодарим д-ра Джиллиан Кей и д-ра Майкла Кановски за помощь в редактировании. Этот проект получил финансирование за счет гранта Израильского научного фонда (No 526/18 O.P.), программы Алекса У. Сойки и гранта Израильского фонда исследования рака (Research Career Development Award).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent or Resource | |||
| 70 µm nylon mesh | Corning | cat##431751 | |
| BSA | Sigma Aldrich | cat# A7906 | |
| Collagenase P | Roche | cat# 11213857001 | |
| Critical Commercial Assay | |||
| DAPI | Sigma Aldrich | cat#MBD0015 | |
| Dnase I | Roche | cat# 10104159001 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Fetal Bovine Serum South American | ThermoFisher | Cat#10270106 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Biological industries | cat#02-018-1A | |
| KRASLSL-G12D mice | Jackson Laboratory | JAX008179 | |
| MACS dead cells removal kit | Milteny Biotec | cat#130-090-101 | |
| PBS | Biological industries | cat#02-023-1A | |
| Ptf1a-CreER mice | Jackson Laboratory | JAX019378 | |
| Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX007908 | |
| Trypsin C-EDTA 0.05% | Biological industries | cat# 03-053-1A | |
| Trypsin inhibitor | Roche | cat#T6522 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Peng, J., et al. Author correction: single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Research. 29 (9), 777 (2019).
- Hruban, R. H., Wilentz, R. E., Kern, S. E.
- Schlesinger, Y., et al. Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells' heterogeneity. Nature Communications. 11 (1), 4516 (2020).
- Kolodkin-Gal, D., et al. Senolytic elimination of Cox2-expressing senescent cells inhibits the growth of premalignant pancreatic lesions. Gut. 71 (2), 345-355 (2021).
- Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
- Elyada, E., et al. Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts. Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).
- Bernard, V., et al. Single-cell transcriptomics of pancreatic cancer precursors demonstrates epithelial and microenvironmental heterogeneity as an early event in neoplastic progression. Clinical Cancer Research. 25 (7), 2194-2205 (2019).
- Moncada, R., et al. Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas. Nature Biotechnology. 38 (3), 333-342 (2020).
- Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptome profiling of pancreatic cancer identifies multicellular dynamics associated with neoadjuvant treatment. Nature Genetics. 54 (8), 1178-1191 (2022).
- Cui Zhou, D., et al. Spatially restricted drivers and transitional cell populations cooperate with the microenvironment in untreated and chemo-resistant pancreatic cancer. Nature Genetics. 54 (9), 1390-1405 (2022).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
