Summary
Este artigo explica como usar o aprendizado de máquina supervisionado por simulação para analisar a morfologia das mitocôndrias em imagens de microscopia de fluorescência de células fixas.
Abstract
A análise quantitativa de organelas subcelulares, como mitocôndrias, em imagens de microscopia de fluorescência celular, é uma tarefa exigente devido aos desafios inerentes à segmentação dessas estruturas pequenas e morfologicamente diversas. Neste artigo, demonstramos o uso de um pipeline de segmentação e análise auxiliado por aprendizado de máquina para a quantificação da morfologia mitocondrial em imagens de microscopia de fluorescência de células fixas. A ferramenta de segmentação baseada em aprendizado profundo é treinada em imagens simuladas e elimina a necessidade de anotações de verdade no solo para aprendizado profundo supervisionado. Demonstramos a utilidade desta ferramenta em imagens de microscopia de fluorescência de cardiomioblastos fixos com uma expressão estável de marcadores de mitocôndrias fluorescentes e empregamos condições específicas de cultura celular para induzir mudanças na morfologia mitocondrial.
Introduction
Neste artigo, demonstramos a utilidade de uma ferramenta de aprendizado de máquina baseada em física para segmentação subcelular1 em imagens de microscopia de fluorescência de cardiomioblastos fixos expressando marcadores de mitocôndrias fluorescentes.
As mitocôndrias são as principais organelas produtoras de energia nas células de mamíferos. Especificamente, as mitocôndrias são organelas altamente dinâmicas e são frequentemente encontradas em redes que estão constantemente mudando em comprimento e ramificação. A forma das mitocôndrias afeta sua função, e as células podem mudar rapidamente sua morfologia mitocondrial para se adaptar a uma mudança no ambiente2. Para compreender esse fenômeno, a classificação morfológica das mitocôndrias em pontos, bastonetes ou redes é altamente informativa3.
A segmentação das mitocôndrias é crucial para a análise da morfologia mitocondrial nas células. Os métodos atuais para segmentar e analisar imagens de microscopia de fluorescência de mitocôndrias dependem de segmentação manual ou abordagens convencionais de processamento de imagens. Abordagens baseadas em limiares, como o Otsu4 , são menos precisas devido aos altos níveis de ruído nas imagens de microscopia. Normalmente, as imagens para a análise morfológica das mitocôndrias apresentam um grande número de mitocôndrias, tornando a segmentação manual tediosa. Abordagens matemáticas como o MorphoLibJ5 e abordagens de aprendizado de máquina semi-supervisionado como o Weka6 são altamente exigentes e exigem conhecimento especializado. Uma revisão das técnicas de análise de imagem para mitocôndrias7 mostrou que técnicas baseadas em aprendizagem profunda podem ser úteis para a tarefa. De fato, a segmentação de imagens na vida cotidiana para aplicações como a direção autônoma foi revolucionada com o uso de modelos baseados em aprendizado profundo.
O aprendizado profundo é um subconjunto do aprendizado de máquina que fornece algoritmos que aprendem com grandes quantidades de dados. Os algoritmos de aprendizagem profunda supervisionados aprendem relacionamentos a partir de grandes conjuntos de imagens que são anotadas com seus rótulos de verdade fundamental (GT). Os desafios no uso de aprendizagem profunda supervisionada para segmentar mitocôndrias em imagens de microscopia de fluorescência são duplos. Em primeiro lugar, o aprendizado profundo supervisionado requer um grande conjunto de dados de imagens de treinamento e, no caso da microscopia de fluorescência, fornecer esse grande conjunto de dados seria uma tarefa extensa em comparação com o uso de imagens tradicionais baseadas em câmera mais facilmente disponíveis. Em segundo lugar, as imagens de microscopia de fluorescência requerem anotações GT dos objetos de interesse nas imagens de treinamento, o que é uma tarefa tediosa que requer conhecimento especializado. Esta tarefa pode facilmente levar horas ou dias do tempo do especialista para uma única imagem de células com estruturas subcelulares marcadas fluorescentemente. Além disso, as variações entre os anotadores representam um problema. Para remover a necessidade de anotação manual e para poder aproveitar o desempenho superior das técnicas de aprendizado profundo, um modelo de segmentação baseado em aprendizado profundo foi usado aqui que foi treinado em imagens simuladas. Os simuladores baseados em física fornecem uma maneira de imitar e controlar o processo de formação de imagens em um microscópio, permitindo a criação de imagens de formas conhecidas. Utilizando um simulador baseado em física, um grande conjunto de dados de imagens de microscopia de fluorescência simulada de mitocôndrias foi criado para esse fim.
A simulação começa com a geração de geometria usando curvas paramétricas para geração de formas. Os emissores são colocados aleatoriamente na superfície da forma de forma uniformemente distribuída, de modo que a densidade corresponda aos valores experimentais. Uma função de propagação de ponto 3D (PSF) do microscópio é calculada usando uma aproximação computacionalmente eficiente8 do modelo 9 de Gibson-Lanni. Para combinar de perto as imagens simuladas com imagens experimentais, tanto a corrente escura quanto o ruído da foto são emulados para alcançar o realismo fotográfico. O GT físico é gerado na forma de um mapa binário. O código para gerar o conjunto de dados e treinar o modelo de simulação está disponível10, e a etapa para criar esse conjunto de dados simulado é descrita na Figura 1.
Mostramos a utilidade da segmentação baseada em aprendizado profundo treinada inteiramente em um conjunto de dados simulados, analisando imagens de microscopia confocal de cardiomioblastos fixos. Esses cardiomioblastos expressaram um marcador fluorescente na membrana externa mitocondrial, permitindo a visualização das mitocôndrias nas imagens de microscopia de fluorescência. Antes da realização do experimento dado como exemplo aqui, as células foram privadas de glicose e adaptadas à galactose por 7 dias em cultura. A substituição da glicose no meio de crescimento por galactose força as células em cultura a se tornarem mais oxidativas e, assim, dependentes de suas mitocôndrias para a produção de energia11,12. Além disso, isso torna as células mais sensíveis aos danos mitocondriais. Alterações morfológicas mitocondriais podem ser induzidas experimentalmente pela adição de um agente de desacoplamento mitocondrial, como o cianeto de carbonila m-clorofenilhidrazona (CCCP), ao meio de cultura celular13. A CCCP leva a uma perda do potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) e, assim, resulta em alterações nas mitocôndrias de uma morfologia mais tubular (tipo bastonete) para uma mais globular (tipo ponto)14. Além disso, as mitocôndrias tendem a inchar durante o tratamento da CCCP15. Mostramos a distribuição morfológica das alterações mitocondriais quando os cardiomioblastos adaptados à galactose foram tratados com o desacoplador mitocondrial CCCP. As segmentações de aprendizagem profunda das mitocôndrias nos permitiram classificá-las como pontos, hastes ou redes. Em seguida, derivamos métricas quantitativas para avaliar os comprimentos dos ramos e a abundância dos diferentes fenótipos mitocondriais. As etapas da análise são descritas na Figura 2, e os detalhes da cultura celular, imagem, criação de conjuntos de dados para segmentação baseada em aprendizagem profunda, bem como a análise quantitativa das mitocôndrias, são apresentados abaixo.
Protocol
NOTA: As secções 1-4 podem ser omitidas se trabalharmos com imagens microscópicas existentes de mitocôndrias com condições experimentais conhecidas.
1. Cultura celular
- Cultivar as células H9c2 em DMEM sem glicose suplementada com 2 mM L-glutamina, 1 mM de piruvato de sódio, 10 mM de galactose, 10% de FBS, 1% de estreptomicina/penicilina e 1 μg/mL de puromicina. Permitir que as células se adaptem à galactose por pelo menos 7 dias em cultura antes dos experimentos.
NOTA: As células H9c2 usadas aqui foram geneticamente modificadas para expressar mitocôndrias fluorescentes e também adquiriram um gene de resistência à puromicina. A adição deste antibiótico garante o crescimento de células com o gene de resistência e, portanto, mitocôndrias fluorescentes. - Semear as células H9c2 para o experimento quando a confluência celular atingir aproximadamente 80% (frasco de cultura T75, avaliado por microscopia de campo brilhante). Pré-aqueça o meio e a tripsina a 37°C durante, pelo menos, 15 minutos antes de prosseguir.
NOTA: É possível realizar o experimento em paralelo com duas ou mais condições diferentes de cultura celular. A confluência celular H9c2 não deve estar acima de 80% para evitar a perda de células mioblásticas. Com 100% de confluência, as células formam miotubos e começam a se diferenciar. - Prepare-se para semear as células, operando em um exaustor de fluxo laminar estéril, colocando uma tampa de vidro #1.5 para cada condição experimental em um poço de uma placa de 12 poços. Rotule cada condição e os detalhes experimentais na placa de 12 poços.
- Mover o balão de cultura celular da incubadora para a superfície de trabalho no exaustor. Aspirar o meio usando um sistema de aspiração ou pipeta eletrônica e, em seguida, lavar duas vezes com 5 mL de PBS (temperatura ambiente).
- Mova a tripsina pré-aquecida para a superfície de trabalho e aspirar a lavagem final do PBS; em seguida, adicionar a tripsina pré-aquecida para descolar as células (1 ml para um balão de cultura T75). Colocar o balão de cultura de volta na incubadora durante 2-3 min a 37°C.
- Mova o meio pré-aquecido para a superfície de trabalho no final da incubação. Verifique se as células se desprenderam usando um microscópio de campo brilhante.
- Se todas as células não tiverem se desprendido, aplique várias torneiras cuidadosas, mas firmes, ao lado do balão para separar as células restantes.
- Devolva o frasco de cultura à superfície de trabalho. Adicionar 4 ml de meio de cultura celular ao balão de cultura utilizando uma pipeta electrónica para parar a acção da tripsina. Ao adicionar o meio de cultura ao balão, utilizar a pipeta para dispersar repetidamente o meio pela superfície para se desprender e reunir as células numa suspensão celular.
- Pipetar a suspensão celular (5 ml) do balão para um tubo de 15 ml.
- Centrifugar as células a 200 x g durante 5 min. Abra o tubo no exaustor, remova o sobrenadante por aspiração e ressuspenda a pastilha celular suavemente em 5 mL de meio de cultura celular.
- Avalie o número de células analisando um pequeno volume da suspensão celular em um contador de células automatizado. Observe o número de células vivas por mililitro de meio de cultura.
- Mova o volume desejado (por exemplo, 150 μL por poço) da suspensão celular, calculado para uma densidade de semeadura de aproximadamente 2 x 104 células/cm2, para um tubo de centrífuga pré-marcado de 15 mL. Adicionar o meio de cultura celular pré-aquecido ao tubo de centrífuga de 15 mL a um volume pré-calculado com base no número de poços. Para placas de 12 poços, use um volume total de 1 mL para cada poço.
- Certifique-se de que a suspensão de células diluídas está devidamente misturada, pipetando o conteúdo do tubo de centrífuga para cima e para baixo várias vezes antes de dispensar o volume apropriado para cada poço. Uma vez que a suspensão celular é dispensada no poço, agite a placa de maneira cuidadosamente controlada em cada direção para melhor distribuir as células por todos os poços. Coloque a placa de 12 poços na incubadora a 37°C até o dia seguinte.
- Verifique as células com um microscópio de campo brilhante para avaliar o crescimento. Se as células tiverem atingido um crescimento suficiente para aproximadamente 80% de confluência, prossiga para os próximos passos; caso contrário, repita a avaliação diariamente até que o crescimento suficiente seja alcançado.
2. Procedimento experimental
- Calcular as quantidades necessárias dos materiais para a experiência de acordo com as concentrações de solução-mãe. Descongelar os materiais congelados (solução-mãe de CCCP a 30 mM) a 37 °C e ajustar o meio de cultura celular para pré-aquecer a 37 °C.
- Uma vez descongelada, criar uma solução de trabalho de 10 μM CCCP diluindo a solução-mãe (1:3.000) em meio de cultura celular.
NOTA: Não pipetar volumes inferiores a 1 μL. - Inicie os tratamentos experimentais uma vez que todos os materiais necessários estejam preparados e pré-aquecidos. Aspirar o meio de cultura celular dos poços da placa de 12 poços e, em seguida, aplicar rapidamente o meio pré-aquecido fresco nos poços de controle e o meio pré-aquecido com solução CCCP de 10 μM nos poços de condição de teste.
- Incubar a placa de 12 poços na incubadora de células a 37°C por 2 h. Durante o período de incubação, prepare a solução de fixação.
- Para a preparação da solução de fixação, use paraformaldeído a 4% (PFA) pré-fabricado para diluir a solução de estoque de glutaraldeído (GA) a 25% a 0,2% (1:125). Ajuste a solução para pré-aquecer a 37°C. Para uma placa de 12 poços, 500 μL é suficiente por poço.
CUIDADO: PFA e GA são produtos químicos tóxicos. Trabalhe em um exaustor químico com equipamento de proteção. Consulte seus respectivos SDS para obter detalhes. - Quando o período de incubação estiver completo, remova a placa de 12 poços da incubadora e coloque-a na superfície de trabalho.
NOTA: O trabalho não requer mais um ambiente estéril. - Aspirar o meio de cultura celular dos poços e aplicar a solução de fixação pré-aquecida. Devolva a placa de 12 poços à incubadora a 37°C por 20 min.
- Aspirar a solução de fixação após completar a incubação e lavar cada poço duas vezes com PBS à temperatura ambiente. É possível pausar o experimento nesta fase do protocolo e continuar mais tarde.
- Se o experimento for pausado, adicione 1 mL de PBS por poço, sele a placa de 12 poços com filme plástico (parafilme) e armazene a 4°C.
3. Coloração e montagem das células nas folhas de cobertura
- Descongele o estoque de DAPI (mancha nuclear) e gire para baixo em uma minicentrífuga antes de abrir. Preparar a solução de coloração DAPI diluindo o estoque de DAPI em PBS (1:1.000).
- Aspirar o PBS da placa de 12 poços e aplicar 1 mL de solução de coloração DAPI em cada poço. Incubar no escuro à temperatura ambiente durante 5 min.
- Aspirar a solução de coloração DAPI. Lave duas vezes com 2 mL de PBS por poço.
- Prepare lâminas de microscópio de vidro fosco (lâminas de vidro) lavando-as em etanol a 70%, seguidas de três lavagens em PBS. Seque cuidadosamente as lâminas usando toalhas de papel sem fiapos e direcione-as para a luz para verificar se há sinais de poeira ou graxa.
NOTA: Luvas são necessárias para esta etapa. - Rotule as lâminas de vidro com os detalhes experimentais. Transfira o meio de montagem para um tubo de microcentrífuga e gire para baixo em uma minicentrífuga.
- Prepare-se para montar as tampas organizando o espaço de trabalho. Mantenha uma placa de 12 poços com folhas de cobertura, lâminas de vidro rotuladas, meio de montagem, uma pipeta, pontas de pipeta de 10 μL, toalhas de papel sem fiapos e pinças prontas.
- Aplique 10 μL de meio de montagem (ProLong Glass) a uma lâmina de vidro preparada para montar uma tampa.
- Pegue a folha de cobertura da placa de 12 poços usando uma pinça e tire a umidade da tampa tocando brevemente a borda e a parte de trás da folha de cobertura na toalha de papel sem fiapos preparada. Abaixe suavemente a tampa para baixo na gota do meio de montagem.
- Repita os dois passos acima para cada deslizamento de cobertura. Coloque as gotículas médias de montagem para permitir entre uma e quatro folhas de cobertura por lâmina de vidro.
- Certifique-se de que as lâminas de vidro estejam em uma superfície plana para evitar que as tampas montadas se movam. Coloque as lâminas de vidro em um local escuro à temperatura ambiente durante a noite para permitir que o meio de montagem se ajuste. As amostras agora estão prontas para geração de imagens. O experimento pode ser pausado nesta fase do protocolo e continuado posteriormente.
- Se o experimento for pausado nesta fase, depois de permitir que as amostras se fixem durante a noite à temperatura ambiente, cubra-as com papel alumínio para protegê-las da luz e armazene-as a 4 ° C.
4. Microscopia e imagem
- Cubra as amostras em papel alumínio para transporte (se ainda não estiver feito).
- Ao chegar à instalação de microscopia, use H2O duplamente destilado com papel de filtro de microscópio para limpar os resíduos de PBS das folhas de cobertura nas lâminas de vidro. Verifique se não há manchas nas tampas, segurando as lâminas de vidro em direção a uma luz brilhante.
- Passe pelo procedimento de inicialização do microscópio. Selecione a objetiva apropriada (Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil M27) e adicione o meio de imersão.
- Coloque a amostra no suporte da amostra. Dentro do software do microscópio, use a guia "Localizar" para ativar a iluminação de fluorescência EGFP e, usando os óculos, ajuste manualmente o nível z para ter a amostra em foco. Desligue a iluminação de fluorescência ao encontrar o foco.
- Alterne para a guia "Adquirir" dentro do software do microscópio. Use a "Configuração inteligente" para selecionar os canais de fluorescência a serem usados para geração de imagens. Para este experimento, foram selecionadas as predefinições de canais EGFP e DAPI.
- Ajuste a intensidade de cada canal a partir das configurações iniciais usando o histograma de intensidade como um guia para otimizar a intensidade do sinal. A geração de imagens pode começar agora.
- Para geração de imagens, use a opção do software para colocar as posições de imagem em uma matriz e centralize a matriz no meio da folha de cobertura com 12 posições totais a serem visualizadas. Verifique se cada posição na matriz contém células. Se não houver células, ajuste a posição para uma área com células.
- Ajuste o foco de cada posição na matriz usando o foco automático do software do microscópio e siga isso com um ajuste fino manual para garantir que o maior número possível de mitocôndrias esteja em foco.
Observação : O canal EGFP é usado para esses ajustes manuais. - Obtenha as imagens usando este método para cada folha de cobertura. Salve os arquivos de imagem e prossiga para as etapas para análise morfológica.
5. Gerando dados de treinamento simulados
- Baixe o código10 e descompacte o conteúdo. Siga as instruções em README.md para configurar o ambiente necessário.
- Navegue até a pasta chamada "src", que é a pasta base deste projeto. As pastas numeradas dentro contêm códigos que são específicos para diferentes etapas de uso da ferramenta.
Observação : use o comando "cd <>" para navegar para quaisquer subpastas do código. Para executar qualquer arquivo python, use o comando "python < >.py ". A apresentação chamada "Tutorial.pptx" contém um conjunto completo de instruções para usar o modelo de segmentação. - Faça uma cópia ou use a pasta "2. Mitochondria Simulation Airy", e renomeá-lo (Airy é usado aqui, pois é a função PSF mais próxima de um microscópio confocal, que foi usado como o microscópio atual). Vá para a pasta chamada "simulador".
Observação : esta pasta contém todos os arquivos relacionados à simulação dos dados de treinamento. Existem três conjuntos de parâmetros a serem definidos para a simulação. - Primeiro, para o simulador no arquivo de configuração em lote "simulator/batch/bxx.csv", defina os parâmetros para cerca da amostra, incluindo o número de mitocôndrias, a faixa de diâmetros e os comprimentos das estruturas, a faixa do eixo z que a estrutura exibe e a densidade dos fluoróforos.
- Em seguida, defina os parâmetros relacionados ao sistema óptico.
- Este conjunto inclui o tipo de microscópio (que determina qual modelo PSF é selecionado), a abertura numérica (N.A.), a ampliação (M), o tamanho do pixel (em μm), o comprimento de onda de emissão dos fluoróforos e o parâmetro de ruído de fundo, etc.
- Defina os parâmetros ópticos de N.A., a ampliação e o comprimento de onda mínimo do conjunto de dados no arquivo "simulator/microscPSFmod.py".
- Defina o valor desejado para o tamanho do pixel e defina o comprimento de onda de emissão do conjunto de dados como parâmetro para a função "process_matrix_all_z" no arquivo "simulator/generate_batch_parallel.py".
- Defina os três últimos parâmetros da função "save_physics_gt" no arquivo "simulator/generate_batch_parallel.py". Os parâmetros são tamanho do pixel (no nm), tamanho da imagem de saída e max_xy.
- Defina o terceiro conjunto de parâmetros em relação ao conjunto de dados de saída, como o tamanho das imagens de saída, o número de blocos em cada imagem e o número total de imagens, no arquivo "simulator/generate_batch_parallel.py".
- Execute o arquivo "simulator/generate_batch_parallel.py" para iniciar a simulação.
- Para obter a imagem de tamanho final, faça uma cópia da pasta chamada "5. Preparação de dados e treinamento/preparação de dados" na pasta inicial e navegue até ela.
NOTA: Cada imagem do conjunto de dados sintético é formada pela criação de uma montagem de quatro imagens simuladas de 128 pixels x 128 pixels, o que dá um tamanho final de imagem de 256 pixels x 256 pixels. Isso primeiro gera muitos blocos individuais (cerca de 12.000) para as imagens do microscópio (na pasta "saída") e segmentações de verdade do solo (na pasta "saída/physics_gt").- Defina os parâmetros do número do lote, o número de imagens por lote e o intervalo de ruído em "data_generator.py".
- Execute o arquivo "data_generator.py" para criar as imagens de montagem.
- Copie as pastas chamadas "imagem" e "segmento" para o "5. Preparação de dados e treinamento/datatrain/train" pasta da pasta "5. Preparação e Treinamento de Dados/preparação de dados/dados".
6. Segmentação baseada em aprendizagem profunda
- Treine o modelo de segmentação nas imagens simuladas da seguinte maneira:
- Para treinar o modelo de segmentação para um novo microscópio, navegue até o "5. Data Preparation and Training/train" e defina os parâmetros do tamanho do lote, o modelo de backbone para a segmentação, o número de épocas e a taxa de aprendizado para treinamento no arquivo "train_UNet.py".
- Execute "train_UNet.py" para iniciar o treinamento. O processo de treinamento exibe a métrica para o desempenho da segmentação no conjunto de validação simulado.
Observação : após a conclusão do treinamento, o modelo é salvo como "best_model.h5" no "5. Preparação de Dados e Treinamento/treinamento" folder.
- Teste o modelo em imagens de microscópio reais que são divididas para um tamanho desejável para o modelo treinado através das etapas a seguir.
- Navegue até "6. Prepare Test Data" e copie o ". png" formatar arquivos dos dados para a pasta "png".
- Execute o arquivo "split_1024_256.py" para dividir as imagens em um tamanho desejável para o modelo treinado. Isso cria cortes de tamanho de 256 pixels x 256 pixels das imagens na pasta "dados".
- Copie a pasta "dados" criada para o "7. Segmentação de teste" pasta.
- Navegue até a pasta "7. Test Segmentation" e defina o nome do modelo salvo a ser usado.
- Para segmentar as culturas, execute o arquivo "segment.py". As imagens segmentadas são salvas na pasta "saída".
7. Análise morfológica: Análise da morfologia mitocondrial dos dois grupos de dados, "Glicose" e "CCCP"
- Organize os dados a serem analisados (uma pasta para cada imagem, com cada pasta contendo as culturas de saída segmentadas de uma imagem).
- Baixe e coloque o arquivo suplementar chamado "make_montage.py" na pasta chamada "7. Segmentação de Testes".
- Execute o arquivo "make_montage.py" para costurar a saída segmentada de volta ao tamanho original da imagem.
- Crie uma nova pasta chamada "9. Análise Morfológica " dentro da pasta "src ".
- Instale os pacotes Skan16 e Seaborn Python no ambiente usando o comando "pip install seaborn[stats] skan".
NOTA: As máscaras de segmentação são esqueletizadas usando a biblioteca chamada Skan para permitir a análise da topologia de cada mitocôndria individual. - Coloque o arquivo suplementar " analyze_mitochondria.py " na pasta "9. Análise Morfológica".
- Organize as imagens de diferentes grupos do experimento em diferentes pastas dentro da pasta "7. Segmentação de Testes".
- Defina os parâmetros de "tamanho do pixel" e "caminho de entrada" no arquivo "analyze_mitochondria.py".
- Execute o arquivo " analyze_mitochondria.py" para executar o código para esqueletizar e criar gráficos da análise.
Representative Results
Os resultados das segmentações de aprendizagem profunda das mitocôndrias em imagens confocais de cardiomioblastos fixos expressando marcadores de mitocôndrias fluorescentes mostram a utilidade deste método. Este método é compatível com outros tipos de células e sistemas de microscopia, exigindo apenas reciclagem.
Cardiomioblastos H9c2 adaptados à galactose com mitocôndrias fluorescentes foram tratados com ou sem CCCP por 2 h. As células foram então fixadas, coradas com corante nuclear e montadas em lâminas de vidro para análise de microscopia de fluorescência. Um microscópio confocal foi utilizado para adquirir imagens das células controle e tratadas com CCCP. Realizamos nossa análise em 12 imagens confocais, com aproximadamente 60 células por condição. O estado morfológico das mitocôndrias em cada imagem foi então determinado e quantificado. As máscaras de segmentação obtidas a partir do modelo treinado foram esqueletizadas para permitir a análise da topologia de cada mitocôndria individual para este experimento. O comprimento do ramo das mitocôndrias individuais foi utilizado como parâmetro para classificação. As mitocôndrias individuais foram classificadas em classes morfológicas pela seguinte regra. Especificamente, qualquer esqueleto mitocondrial com um comprimento inferior a 1.500 nm foi considerado um ponto, e as mitocôndrias mais longas foram categorizadas em rede ou bastonete. Se houvesse pelo menos uma junção onde dois ou mais ramos se cruzavam, isso era definido como uma rede; caso contrário, a mitocôndria foi classificada como bastonete. Uma imagem de exemplo com os esqueletos mitocondriais marcados com as classes de morfologia é mostrada na Figura 3.
A categorização da morfologia mitocondrial na Figura 4A mostra que é possível detectar alterações significativas quando o CCCP é aplicado por 2 h; isso é mais claramente demonstrado pelo aumento de pontos para as células tratadas com CCCP.
O comprimento médio do ramo na Figura 4B é outro caminho para ilustrar mudanças detectáveis e significativas na morfologia. Tanto os bastonetes quanto as redes foram, como esperado, significativamente reduzidos em relação ao controle quando as células foram tratadas com CCCP. O aumento significativo nos comprimentos médios dos ramos dos pontos também era esperado, dado o inchaço que as mitocôndrias sofrem quando expostas ao CCCP.
Figura 1: Tubulação para simulação de imagens de microscopia de fluorescência. A tubulação inclui (i) geração de geometria 3D, (ii) emulação de emissores e fotocinética, (iii) convolução de PSF 3D, (iv) adição de ruído e (v) binarização. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Etapas da análise baseada em aprendizado de máquina da morfologia mitocondrial . (1) As imagens a serem segmentadas são primeiro cortadas em tamanhos aceitáveis para o modelo de segmentação. (2) A segmentação baseada em aprendizagem profunda é aplicada aos cortes de imagem. (3) As culturas de produção segmentadas são adaptadas à sua dimensão original. (4) As segmentações montadas são esqueletizadas. (6) A análise morfológica é realizada com base na topologia das esqueletizações. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Esqueleto mitocondrial sobreposto na saída de segmentação de imagens de microscopia . (A) A saída de segmentação. (B) O esqueleto em linha reta (distância euclidiana entre os pontos inicial e final de um ramo) é sobreposto sobre a saída de segmentação. O código de cores do esqueleto representa a classe das mitocôndrias. As redes são vermelhas, as hastes são verdes e os pontos são de cor roxa. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise da morfologia mitocondrial. (A) Uma visão geral da porcentagem relativa de diferentes categorias morfológicas com base no comprimento mitocondrial total. (B) Comparação do comprimento médio do ramo mitocondrial entre as condições experimentais e entre as categorias morfológicas. O eixo x exibe as categorizações morfológicas e o eixo y exibe o comprimento médio do ramo das mitocôndrias em nanômetros (nm). A significância estatística na forma de valores de p é mostrada como * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 e **** p < 0,0001. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Caso de falha de segmentação. Uma alta densidade de mitocôndrias é um cenário desafiador para o modelo de segmentação. O esqueleto colorido mostra as mitocôndrias únicas mais longas detectadas na imagem. Ao passar pelas medições de comprimento, esses cenários podem ser detectados e trabalhados para melhorar os resultados de segmentação usando o operador morfológico erode (emagrece o esqueleto detectado). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Discutimos as precauções relacionadas às etapas críticas do protocolo nos parágrafos sobre "geração de geometria" e "parâmetros do simulador". O parágrafo intitulado "aprendizado de transferência" discute modificações para maior rendimento ao se adaptar a múltiplos microscópios. Os parágrafos sobre "análise de partículas" e "geração de outras estruturas subcelulares" referem-se a futuras aplicações deste método. O parágrafo sobre a "diferença da verdade biológica" discute as diferentes razões pelas quais as simulações podem diferir dos dados reais e se essas razões afetam nossa aplicação. Finalmente, discutimos um cenário desafiador para o nosso método no parágrafo "estruturas densamente compactadas".
Geração de geometria
Para gerar a geometria 3D das mitocôndrias, uma estrutura 2D simples criada a partir de curvas b-spline como esqueletos funciona bem para a criação do conjunto de dados sintético. Essas formas sintéticas emulam de perto as formas das mitocôndrias observadas em culturas de células 2D. No entanto, no caso do tecido 3D, como o tecido cardíaco, a forma e o arranjo das mitocôndrias são bastante diferentes. Nesses casos, o desempenho do modelo de segmentação pode melhorar com a adição de direcionalidade nas imagens simuladas.
Parâmetros do simulador
Deve-se ter cuidado ao definir os parâmetros do simulador para garantir que eles correspondam aos dos dados nos quais executar a inferência, pois a falha em fazer isso pode levar a um desempenho menor na segmentação. Um desses parâmetros é a faixa de relação sinal-ruído (SNR). O intervalo do SNR dos dados a ensaiar deve corresponder aos valores do conjunto de dados simulado. Além disso, o PSF usado deve corresponder ao dos dados de teste de destino. Por exemplo, imagens treinadas por modelo de um PSF confocal não devem ser usadas para testar imagens de um microscópio epifluorescente. Outro parâmetro a ser observado é o uso de ampliação adicional nos dados de teste. Se tiver sido utilizada uma ampliação adicional nos dados de ensaio, o simulador também deve ser ajustado de forma adequada.
Transferir aprendizado
O aprendizado de transferência é o fenômeno de alavancar um modelo aprendido treinado em uma tarefa para uso em outra tarefa. Este fenômeno também é aplicável ao nosso problema em relação a diferentes tipos de dados de microscópio. Os pesos do modelo de segmentação (fornecido com o código-fonte) que é treinado em um tipo de dados de microscopia podem ser usados para inicializar um modelo de segmentação a ser usado em outro tipo de dados de microscópio óptico. Isso nos permite treinar em um subconjunto significativamente menor do conjunto de dados de treinamento (3.000 imagens em comparação com 10.000), reduzindo assim os custos computacionais da simulação.
Análise de partículas
A análise de partículas também pode ser realizada nas máscaras segmentadas. Isso pode fornecer informações sobre a área e a curvatura, etc., das mitocôndrias individuais. Essas informações também podem servir como métricas para a comparação quantitativa de mitocôndrias (não utilizadas para este experimento). Por exemplo, atualmente, definimos a morfologia dos pontos usando um limiar baseado no comprimento das mitocôndrias. Pode ser útil, em alguns casos, incorporar a elipticidade para separar melhor pequenas mitocôndrias semelhantes a bastonetes de puncta ou mitocôndrias semelhantes a pontos. Alternativamente, se certas condições biológicas fazem com que as mitocôndrias se enrolem, a quantificação da curvatura pode ser de interesse para analisar a população mitocondrial.
Geração de outras estruturas subcelulares
A segmentação física de estruturas subcelulares tem sido demonstrada para mitocôndrias e vesículas1. Embora as vesículas exibam formas variadas, seus tamanhos são menores e aparecem como esferas simples quando observadas através de um microscópio de fluorescência. Assim, a geometria das vesículas é simulada usando estruturas esféricas de uma faixa de diâmetro apropriada. Isso implica uma mudança na função gera a geometria (cilindros no caso das mitocôndrias e esferas no caso das vesículas) das estruturas e os respectivos parâmetros (etapa 5.4 na seção do protocolo). Geometricamente, o retículo endoplasmático e os microtúbulos também têm sido simulados como estruturas tubulares17. A modelagem do retículo endoplasmático com diâmetro de 150 nm e microtúbulos com diâmetro externo médio de 25 nm e tubo oco interno de 15 nm de diâmetro fornece aproximações das formas dessas estruturas. Outro parâmetro que irá variar para cada uma dessas estruturas subcelulares é a densidade do fluoróforo. Isto é calculado com base na distribuição da biomolécula à qual os fluoróforos se ligam e na probabilidade de ligação.
Diferença da verdade biológica do solo
Os dados simulados usados para o treinamento supervisionado por simulação do modelo de aprendizado profundo diferem dos dados reais de várias maneiras. i) A ausência de rotulagem não específica nos dados simulados difere dos dados reais, uma vez que existem frequentemente fluoróforos flutuantes nos dados reais. Isso faz com que um valor médio de plano de fundo mais alto na imagem real. Essa diferença é atenuada pela correspondência do SNR e pela definição do valor de plano de fundo de modo que ele corresponda aos valores reais observados. (ii) O movimento das estruturas subcelulares e a fotocinética são duas fontes de dinâmica no sistema. Estruturas em movimento em células vivas (que se movem na faixa de alguns milissegundos) causam desfoque de movimento. O tempo de exposição é reduzido durante a aquisição de dados reais para evitar o efeito de desfocagem. Por outro lado, não simulamos timelapse e assumimos estruturas imóveis; essa suposição é válida quando o tempo de exposição nos dados reais é pequeno. No entanto, essa suposição pode produzir um erro na saída se o tempo de exposição dos dados reais for grande o suficiente para introduzir o desfoque de movimento. A fotocinética, por outro lado, é da ordem de nanossegundos a microssegundos e pode ser omitida na simulação, uma vez que os tempos de exposição habituais dos experimentos são longos o suficiente (na ordem de milissegundos) para calcular a média dos efeitos da fotocinética. (iii) O ruído em imagens de microscópio tem diferentes fontes, e essas fontes têm diferentes funções de densidade de probabilidade. Em vez de modelar essas fontes individuais de ruído, nós o aproximamos como um ruído gaussiano sobre um fundo constante. Essa diferença não altera significativamente a distribuição dos dados para as condições de baixa relação sinal-fundo (na faixa de 2-4) e quando se trata da macrodensidade dos fluoróforos1. (iv) Artefatos em imagens podem surgir de aberrações, derivas e borrões sistemáticos. Assumimos que o microscópio esteja bem alinhado e que as regiões escolhidas para análise nos dados reais sejam desprovidas desses artefatos. Há também a possibilidade de modelagem de alguns desses artefatos no PSF18,19,20.
Estruturas densamente embaladas
As dificuldades em não ser capaz de diferenciar hastes sobrepostas de redes é um problema persistente na segmentação de dados de microscopia 2D. Um cenário extremamente desafiador é apresentado na Figura 5, onde as mitocôndrias estão densamente embaladas, o que leva a resultados subótimos no modelo de segmentação e na análise a seguir. Apesar desse desafio, o uso de operadores morfológicos em tais situações para reduzir a esqueletização pode ajudar a quebrar essas redes excessivamente conectadas, permitindo que mudanças significativas em todas as categorias de morfologia mitocondrial ainda sejam detectadas. Além disso, o uso de um microscópio confocal em vez de um microscópio de campo largo para imagens é um método para mitigar parcialmente esse problema, eliminando a luz fora de foco. Além disso, no futuro, seria útil realizar segmentação 3D para diferenciar mitocôndrias que se cruzam (ou seja, formam fisicamente uma rede) de mitocôndrias semelhantes a bastonetes cujas projeções em um único plano se sobrepõem umas às outras.
A segmentação de aprendizagem profunda é uma ferramenta promissora que oferece expandir as capacidades de análise dos usuários de microscopia, abrindo assim a possibilidade de análise automatizada de dados complexos e grandes conjuntos de dados quantitativos, que antes seriam incontroláveis.
Disclosures
Os autores declaram que não há conflitos de interesse relacionados a este artigo.
Acknowledgments
Os autores reconhecem a discussão com Arif Ahmed Sekh. Zambarlal Bhujabal é reconhecido por ajudar na construção das células H9c2 estáveis. Reconhecemos o seguinte financiamento: Bolsa de início do ERC n.º 804233 (a K.A.), Bolsa de Projeto de Investigador para Renovação Científica n.º 325741 (a D.K.P.), subvenção da Autoridade Regional de Saúde do Norte da Noruega n.º HNF1449-19 (Å.B.B.), e o projeto de financiamento temático da UiT, VirtualStain with Cristin Project ID 2061348 (D.K.P., Å.B.B., K.A., e A.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate | FALCON | 353043 | |
| Aqueous Glutaraldehyde EM Grade 25% | Electron Microscopy Sciences | 16200 | |
| Axio Vert.A1 | Zeiss | Brightfield microscope | |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| Computer | n/a | n/a | Must be running Linux/Windows Operating System having an NVIDIA GPU with at least 4GB of memory |
| Coverslips | VWR | 631-0150 | |
| DAPI (stain) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| DMEM | gibco | 11966-025 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Glass Slides (frosted edge) | epredia | AA00000112E01MNZ10 | |
| H9c2 mCherry-EGFP-OMP25 | In-house stable cell line derived from purchased cell line | ||
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51033557 | |
| LSM 800 | Zeiss | Confocal Microscope | |
| Mounting Media (Glass) | Thermo Fisher Scientific | P36980 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Thermo Fisher Scientific | J19943-K2 | |
| Plan-Apochromat 63x oil (M27) objective with an NA of 1.4 | Zeiss | 420782-9900-000 | |
| Sterile laminar flow hood | Labogene | SCANLAF MARS | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Vacusafe aspiration system | VACUUBRAND | 20727400 | |
| ZEN 2.6 | Zeiss |
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