Summary
Denne artikkelen forklarer hvordan du bruker simuleringsovervåket maskinlæring for å analysere mitokondrienes morfologi i fluorescensmikroskopibilder av faste celler.
Abstract
Den kvantitative analysen av subcellulære organeller som mitokondrier i cellefluorescensmikroskopibilder er en krevende oppgave på grunn av de iboende utfordringene i segmenteringen av disse små og morfologisk forskjellige strukturer. I denne artikkelen demonstrerer vi bruken av en maskinlæringsstøttet segmenterings- og analyserørledning for kvantifisering av mitokondriell morfologi i fluorescensmikroskopibilder av faste celler. Det dype læringsbaserte segmenteringsverktøyet er opplært på simulerte bilder og eliminerer kravet til grunnsannhetsmerknader for overvåket dyp læring. Vi demonstrerer nytten av dette verktøyet på fluorescensmikroskopibilder av faste kardiomyoblaster med et stabilt uttrykk av fluorescerende mitokondriermarkører og bruker spesifikke cellekulturforhold for å indusere endringer i mitokondriell morfologi.
Introduction
I dette papiret demonstrerer vi nytten av et fysikkbasert maskinlæringsverktøy for subcellulær segmentering1 i fluorescensmikroskopibilder av faste kardiomyoblaster som uttrykker fluorescerende mitokondriermarkører.
Mitokondrier er de viktigste energiproduserende organeller i pattedyrceller. Spesielt er mitokondrier svært dynamiske organeller og finnes ofte i nettverk som stadig endrer seg i lengde og forgrening. Formen på mitokondrier påvirker deres funksjon, og celler kan raskt endre sin mitokondrielle morfologi for å tilpasse seg en endring i miljøet2. For å forstå dette fenomenet er den morfologiske klassifiseringen av mitokondrier som prikker, stenger eller nettverk svært informativ3.
Segmenteringen av mitokondrier er avgjørende for analysen av mitokondriell morfologi i celler. Nåværende metoder for å segmentere og analysere fluorescensmikroskopibilder av mitokondrier er avhengige av manuell segmentering eller konvensjonelle bildebehandlingsmetoder. Terskelbaserte tilnærminger som Otsu4 er mindre nøyaktige på grunn av de høye støynivåene i mikroskopibilder. Vanligvis har bilder for morfologisk analyse av mitokondrier et stort antall mitokondrier, noe som gjør manuell segmentering kjedelig. Matematiske tilnærminger som MorphoLibJ5 og semi-overvåkede maskinlæringsmetoder som Weka6 er svært krevende og krever ekspertkunnskap. En gjennomgang av bildeanalyseteknikkene for mitokondrier7 viste at dype læringsbaserte teknikker kan være nyttige for oppgaven. Faktisk har bildesegmentering i hverdagsbilder for applikasjoner som selvkjøring blitt revolusjonert med bruk av dype læringsbaserte modeller.
Dyp læring er en delmengde av maskinlæring som gir algoritmer som lærer av store mengder data. Overvåkede dype læringsalgoritmer lærer relasjoner fra store sett med bilder som er kommentert med deres ground truth (GT) etiketter. Utfordringene ved bruk av veiledet dyp læring for segmentering av mitokondrier i fluorescensmikroskopibilder er todelt. For det første krever overvåket dyp læring et stort datasett med treningsbilder, og når det gjelder fluorescensmikroskopi, vil det være en omfattende oppgave å gi dette store datasettet sammenlignet med når man bruker lettere tilgjengelige tradisjonelle kamerabaserte bilder. For det andre krever fluorescensmikroskopibilder GT-merknader av objektene av interesse i treningsbildene, noe som er en kjedelig oppgave som krever ekspertkunnskap. Denne oppgaven kan lett ta timer eller dager av ekspertens tid for et enkelt bilde av celler med fluorescerende merkede subcellulære strukturer. Videre utgjør variasjoner mellom annotatorer et problem. For å fjerne behovet for manuell merknad, og for å kunne utnytte den overlegne ytelsen til dype læringsteknikker, ble det her brukt en dyp læringsbasert segmenteringsmodell som ble trent på simulerte bilder. Fysikkbaserte simulatorer gir en måte å etterligne og kontrollere prosessen med bildedannelse i et mikroskop, slik at du kan lage bilder av kjente former. Ved hjelp av en fysikkbasert simulator ble et stort datasett av simulerte fluorescensmikroskopibilder av mitokondrier opprettet for dette formålet.
Simuleringen starter med geometrigenerering ved hjelp av parametriske kurver for formgenerering. Emittere er tilfeldig plassert på overflaten av formen på en jevnt fordelt måte slik at tettheten samsvarer med eksperimentelle verdier. En 3D-punktspredningsfunksjon (PSF) av mikroskopet beregnes ved hjelp av en beregningseffektiv tilnærming8 av Gibson-Lanni modell9. For å matche de simulerte bildene med eksperimentelle bilder, emuleres både den mørke strømmen og skuddstøyen for å oppnå fotorealisme. Den fysiske GT genereres i form av et binært kart. Koden for generering av datasettet og opplæring av simuleringsmodellen er tilgjengelig10, og trinnet for å lage dette simulerte datasettet er skissert i figur 1.
Vi viser nytten av dyp læringsbasert segmentering trent helt på et simulert datasett ved å analysere konfokale mikroskopibilder av faste kardiomyoblaster. Disse kardiomyoblastene uttrykte en fluorescerende markør i mitokondriell ytre membran, noe som muliggjorde visualisering av mitokondriene i fluorescensmikroskopibildene. Før forsøket ble gitt som et eksempel her, ble cellene fratatt glukose og tilpasset galaktose i 7 dager i kultur. Å erstatte glukose i vekstmediet med galaktose tvinger cellene i kulturen til å bli mer oksidative og dermed avhengige av mitokondriene for energiproduksjon11,12. Videre gjør dette cellene mer følsomme for mitokondriell skade. Mitokondrielle morfologiendringer kan eksperimentelt induseres ved å tilsette et mitokondrielt frakoblingsmiddel som karbonylcyanid m-klorfenylhydrason (CCCP) til cellekulturmediet13. CCCP fører til tap av mitokondriell membranpotensial (ΔΨm) og resulterer dermed i endringer i mitokondriene fra en mer rørformet (stavlignende) til en mer kuleformet (prikklignende) morfologi14. I tillegg har mitokondrier en tendens til å hovne opp under CCCP-behandling15. Vi viser den morfologiske fordelingen av mitokondrier når de galaktosetilpassede kardiomyoblastene ble behandlet med mitokondriell frakobling CCCP. De dype læringssegmentasjonene av mitokondriene gjorde det mulig for oss å klassifisere dem som prikker, stenger eller nettverk. Vi utledet deretter kvantitative beregninger for å vurdere grenlengdene og overfloden av de forskjellige mitokondrielle fenotypene. Trinnene i analysen er skissert i figur 2, og detaljene i cellekulturen, bildebehandling, datasettopprettelse for dyp læringsbasert segmentering, samt kvantitativ analyse av mitokondriene, er gitt nedenfor.
Protocol
MERK: §§ 1-4 kan utelates ved arbeid med eksisterende mikroskopibilder av mitokondrier med kjente forsøkstilstander.
1. Cellekultur
- Dyrk H9c2-cellene i DMEM uten glukose supplert med 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 10 mM galaktose, 10% FBS, 1% streptomycin / penicillin og 1 μg / ml puromycin. La cellene tilpasse seg galaktose i minst 7 dager i kultur før forsøkene.
MERK: H9c2-cellene som brukes her, er genetisk modifisert for å uttrykke fluorescerende mitokondrier og har også fått et puromycinresistensgen. Tilsetningen av dette antibiotika sikrer veksten av celler med resistensgenet og dermed fluorescerende mitokondrier. - Frø H9c2-cellene til forsøket når cellekonfluensen når ca. 80% (T75-kulturkolbe, vurdert ved lysfeltmikroskopi). Forvarm mediet og trypsin til 37 °C i minst 15 minutter før du fortsetter.
MERK: Det er mulig å utføre eksperimentet parallelt med to eller flere forskjellige cellekulturforhold. H9c2-cellekonfluensen bør ikke være over 80% for å forhindre tap av myoblastiske celler. Ved 100% sammenløp danner cellene myorør og begynner å differensiere. - Forbered deg på såing av cellene, som opererer i en steril laminær strømningshette, ved å plassere en # 1,5 glassdeksel for hver eksperimentell tilstand i en brønn på en 12-brønns plate. Merk hver tilstand og de eksperimentelle detaljene på platen med 12 brønner.
- Flytt cellekulturflasken fra inkubatoren til arbeidsflaten i hetten. Aspirer mediet ved hjelp av et aspirasjonssystem eller elektronisk pipette, og vask deretter to ganger med 5 ml PBS (romtemperatur).
- Flytt det forvarmede trypsinet til arbeidsflaten, og aspirer den endelige PBS-vasken; Deretter legger du til det forvarmede trypsinet for å løsne cellene (1 ml for en T75-kulturflaske). Plasser kulturflasken tilbake i inkubatoren i 2-3 min ved 37 °C.
- Flytt det forvarmede mediet til arbeidsflaten mot slutten av inkubasjonen. Kontroller at cellene har løsnet ved hjelp av et lysfeltmikroskop.
- Hvis alle cellene ikke har løsnet, bruk flere forsiktige, men faste kraner på siden av kolben for å løsne de resterende cellene.
- Sett kulturflasken tilbake til arbeidsflaten. Tilsett 4 ml cellekulturmedium til kulturkolben ved hjelp av en elektronisk pipette for å stoppe trypsinvirkningen. Når du tilsetter kulturmedium til kolben, bruk pipetten til gjentatte ganger å spre mediet over overflaten for å løsne og samle cellene i en cellesuspensjon.
- Pipetter cellesuspensjonen (5 ml) fra kolben til et 15 ml rør.
- Sentrifuger cellene ved 200 x g i 5 minutter. Åpne røret i hetten, fjern supernatanten ved aspirasjon, og resuspend cellepelleten forsiktig i 5 ml cellekulturmedier.
- Vurder antall celler ved å analysere et lite volum av cellesuspensjonen i en automatisert celleteller. Legg merke til antall levende celler per milliliter kulturmedier.
- Flytt ønsket volum (f.eks. 150 μL per brønn) av cellesuspensjonen, beregnet for en såtetthet på ca. 2 x 104 celler/cm2, inn i et forhåndsmerket 15 ml sentrifugerør. Tilsett det forvarmede cellekulturmediet til 15 ml sentrifugerøret ved et forhåndsberegnet volum basert på antall brønner. For plater med 12 brønner, bruk et totalvolum på 1 ml for hver brønn.
- Forsikre deg om at den fortynnede cellesuspensjonen blandes riktig ved å pipettere innholdet i sentrifugerøret opp og ned flere ganger før du dispenserer riktig volum til hver brønn. Når cellesuspensjonen er dispensert i brønnen, rist platen på en nøye kontrollert måte i hver retning for bedre å fordele cellene gjennom brønnene. Plasser tallerkenen med 12 brønner i inkubatoren ved 37 °C til neste dag.
- Sjekk cellene med et lysfeltmikroskop for å evaluere veksten. Hvis cellene har oppnådd tilstrekkelig vekst til omtrent 80% sammenløp, fortsett til de neste trinnene; Ellers gjenta evalueringen daglig til tilstrekkelig vekst er nådd.
2. Eksperimentell prosedyre
- Beregn mengdene som trengs av materialene til forsøket i henhold til konsentrasjonene av stamløsningen. Tine de frosne materialene (30 mM CCCP lagerløsning) ved 37 °C, og sett cellekulturmediet til forvarming ved 37 °C.
- Når den er tint, lager du en arbeidsløsning på 10 μM CCCP ved å fortynne stamløsningen (1:3 000) i cellekulturmedium.
MERK: Ikke pipettevolumer mindre enn 1 μL. - Start eksperimentelle behandlinger når alle nødvendige materialer er forberedt og forvarmet. Aspirer cellekulturmediet fra brønnene på 12-brønnsplaten, og påfør deretter raskt det ferske forvarmede mediet på kontrollbrønnene og det forvarmede mediet med 10 μM CCCP-løsning på testtilstandsbrønnene.
- Inkuber 12-brønnsplaten i 37 °C-celleinkubatoren i 2 timer. I inkubasjonsperioden forbereder du fikseringsløsningen.
- For fremstilling av fikseringsløsningen, bruk ferdiglaget 4% paraformaldehyd (PFA) for å fortynne 25% glutaraldehyd (GA) stamløsning til 0,2% (1:125). Sett løsningen til forvarming ved 37 °C. For en plate med 12 brønner er 500 μL tilstrekkelig per brønn.
FORSIKTIG: PFA og GA er giftige kjemikalier. Arbeid i en kjemisk hette med verneutstyr. Se deres respektive SDS for detaljer. - Når inkubasjonsperioden er fullført, fjern 12-brønnsplaten fra inkubatoren og legg den på arbeidsflaten.
MERK: Arbeidet krever ikke lenger et sterilt miljø. - Aspirer cellekulturmediet fra brønnene, og bruk den forvarmede fikseringsløsningen. Sett tallerkenen med 12 brønner tilbake til 37 °C-inkubatoren i 20 minutter.
- Aspirer fikseringsløsningen etter å ha fullført inkubasjonen, og vask hver brønn to ganger med romtemperatur PBS. Det er mulig å pause eksperimentet på dette stadiet av protokollen og fortsette senere.
- Hvis eksperimentet er satt på pause, tilsett 1 ml PBS per brønn, forsegl 12-brønnsplaten med plastfilm (parafilm) og oppbevar ved 4 °C.
3. Farging og montering av cellene på dekslene
- Tine DAPI (kjernefysisk flekk) lager, og spinn ned i en mini sentrifuge før åpning. Klargjør DAPI-fargeløsning ved å fortynne DAPI-lager i PBS (1:1,000).
- Aspirer PBS fra 12-brønnsplaten, og påfør 1 ml DAPI-fargeløsning til hver brønn. Inkuber i mørket ved romtemperatur i 5 minutter.
- Aspirer DAPI-fargeløsningen. Vask to ganger med 2 ml PBS per brønn.
- Forbered frostede glassmikroskop lysbilder (glassglass) ved å vaske dem i 70% etanol, etterfulgt av tre vasker i PBS. Tørk forsiktig av lysbildene med lofrie papirhåndklær, og rett dem mot lyset for å se etter tegn på støv eller fett.
MERK: Hansker er påkrevd for dette trinnet. - Merk glassglassene med eksperimentelle detaljer. Overfør monteringsmediet til et mikrosentrifugerør, og spinn ned i en mini-sentrifuge.
- Forbered deg på montering av dekslene ved å ordne arbeidsområdet. Hold en 12-brønns tallerken med deksel, merkede glassglass, monteringsmedium, en pipette, 10 μL pipettespisser, lofrie papirhåndklær og pinsett klar.
- Påfør 10 μL monteringsmedium (ProLong Glass) på et forberedt glassglass for å montere et deksel.
- Plukk opp dekselet fra tallerkenen med 12 brønner med pinsett, og smør fuktigheten av dekselet ved å berøre kanten og baksiden av dekselet til det tilberedte lofrie papirhåndkleet. Senk dekslet forsiktig ned på dråpen til monteringsmediet.
- Gjenta de to trinnene ovenfor for hvert deksel. Plasser monteringsmediumdråpene for å tillate mellom ett og fire deksel per glassglass.
- Forsikre deg om at glassglassene er på en flat overflate for å unngå at de monterte dekslene beveger seg. Plasser glassglassene på et mørkt sted ved romtemperatur over natten for å la monteringsmediet stivne. Prøvene er nå klare for avbildning. Eksperimentet kan settes på pause på dette stadiet av protokollen og fortsettes senere.
- Hvis forsøket er satt på pause på dette stadiet, må du dekke dem i aluminiumsfolie for å beskytte dem mot lys etter å ha tillatt prøvene over natten ved romtemperatur, og lagre dem ved 4 ° C.
4. Mikroskopi og avbildning
- Dekk prøvene i aluminiumsfolie for transport (hvis ikke allerede gjort).
- Ved ankomst til mikroskopianlegget, bruk dobbeltdestillert H2O med mikroskopfilterpapir for å rengjøre PBS-restene av dekslene på glassglassene. Kontroller at det ikke er flekker på dekslene ved å holde glassglassene mot et sterkt lys.
- Gå gjennom oppstartsprosedyren for mikroskopet. Velg riktig mål (Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil M27), og tilsett nedsenkingsmedium.
- Plasser prøven i prøveholderen. I mikroskopprogramvaren bruker du "Locate" -fanen for å aktivere EGFP-fluorescensbelysningen, og bruk okularene til å justere z-nivået manuelt for å få prøven i fokus. Slå av fluorescensbelysningen når du finner fokuset.
- Bytt til "Skaff" -fanen i mikroskopprogramvaren. Bruk "Smart Setup" for å velge fluorescenskanalene som skal brukes til avbildning. For dette eksperimentet ble EGFP- og DAPI-kanalforhåndsinnstillingene valgt.
- Juster hver kanalintensitet fra de opprinnelige innstillingene ved å bruke intensitetshistogrammet som en veiledning for optimalisert signalstyrke. Imaging kan nå begynne.
- For bildebehandling, bruk programvarens mulighet til å få bildeposisjonene plassert i en matrise, og sentrer matrisen midt i dekselet med 12 totale posisjoner som skal avbildes. Kontroller at hver posisjon i matrisen inneholder celler. Hvis det ikke er noen celler, juster posisjonen til et område med celler.
- Juster fokuset på hver posisjon i matrisen ved hjelp av mikroskopprogramvarens autofokus, og følg dette med en manuell finjustering for å sikre at så mange mitokondrier som mulig er i fokus.
MERK: EGFP-kanalen brukes til disse manuelle justeringene. - Skaff bildene ved hjelp av denne metoden for hver omslagsglide. Lagre bildefilene, og fortsett til trinnene for morfologisk analyse.
5. Generering av simulerte treningsdata
- Last ned koden10, og pakk ut innholdet. Følg instruksjonene i README.md for å konfigurere det nødvendige miljøet.
- Naviger til mappen "src", som er hjemmemappen for dette prosjektet. De nummererte mappene inne inneholder koder som er spesifikke for forskjellige trinn for bruk av verktøyet.
MERK: Bruk kommandoen "cd <>" for å navigere til eventuelle undermapper av koden. For å kjøre en python-fil, bruk kommandoen "python < >.py ". Presentasjonen kalt "Tutorial.pptx" inneholder et komplett sett med instruksjoner for bruk av segmenteringsmodellen. - Lag en kopi eller bruk mappen "2. Mitokondrier Simulation Airy", og gi den nytt navn (Airy brukes her da det er PSF-funksjonen nærmest et konfokalmikroskop, som ble brukt som gjeldende mikroskop). Gå inn i mappen som heter "simulator".
MERK: Denne mappen inneholder alle filene relatert til simuleringen av treningsdataene. Det er tre sett med parametere som skal settes for simuleringen. - Først for simulatoren i batchkonfigurasjonsfilen "simulator / batch / bxx.csv", angi parametrene for omtrent prøven, inkludert antall mitokondrier, diameterområdet og lengden på strukturene, rekkevidden av z-aksen som strukturen viser, og tettheten av fluoroforene.
- Deretter angir du parametrene relatert til det optiske systemet.
- Dette settet inkluderer typen mikroskop (som bestemmer hvilken PSF-modell som er valgt), den numeriske blenderåpningen (NA), forstørrelsen (M), pikselstørrelsen (i μm), utslippsbølgelengden til fluoroforene og bakgrunnsstøyparameteren, etc.
- Angi de optiske parametrene for N.A., forstørrelsen og minimumsbølgelengden til datasettet i filen "simulator/microscPSFmod.py".
- Angi ønsket verdi for pikselstørrelsen, og sett emisjonsbølgelengden til datasettet som en parameter til "process_matrix_all_z" -funksjonen i filen "simulator / generate_batch_parallel.py".
- Angi de tre siste parametrene til funksjonen "save_physics_gt" i filen "simulator / generate_batch_parallel.py". Parametrene er pikselstørrelse (i nm), størrelsen på utgangsbildet og max_xy.
- Angi det tredje settet med parametere angående utdatadatasettet, for eksempel størrelsen på utgangsbildene, antall fliser i hvert bilde og antall totale bilder, i filen "simulator / generate_batch_parallel.py".
- Kjør filen "simulator/generate_batch_parallel.py" for å starte simuleringen.
- Hvis du vil ha bildet i endelig størrelse, lager du en kopi av mappen med navnet "5. Dataforberedelse og opplæring/dataforberedelse" i hjemmemappen, og naviger inn i den.
MERK: Hvert bilde av det syntetiske datasettet dannes ved å lage en montasje av fire simulerte bilder på 128 piksler x 128 piksler, noe som gir en endelig bildestørrelse på 256 piksler x 256 piksler. Denne første genererer mange individuelle fliser (rundt 12.000) for både mikroskopbildene (i "output" -mappen) og bakken sannhet segmenteringer (i "output / physics_gt" -mappen).- Angi parametrene for batchnummeret, antall bilder per batch og støyområdet i "data_generator.py".
- Kjør filen "data_generator.py" for å lage montasjebildene.
- Kopier mappene som heter "bilde" og "segment" til "5. Mappen Dataforberedelse og opplæring/datatrain/train" fra mappen "5. Dataforberedelse og opplæring/dataforberedelse/data".
6. Dyp læringsbasert segmentering
- Lær opp segmenteringsmodellen på de simulerte bildene på følgende måte:
- For å trene segmenteringsmodellen for et nytt mikroskop, naviger til "5. Mappen Dataforberedelse og opplæring/opplæring", og angi parametrene for batchstørrelsen, ryggradsmodellen for segmenteringen, antall epoker og læringshastigheten for opplæring i filen "train_UNet.py".
- Kjør "train_UNet.py" for å starte treningen. Opplæringsprosessen viser beregningen for ytelsen til segmenteringen på det simulerte valideringssettet.
MERK: Etter at opplæringen er fullført, lagres modellen som "best_model.h5" i "5. Mappen Dataforberedelse og opplæring/opplæring".
- Test modellen på ekte mikroskopbilder som er delt til en størrelse som er ønskelig for den trente modellen gjennom følgende trinn.
- Naviger til "6. Klargjør testdata", og kopier ". png" format filer av dataene i mappen "png".
- Kjør filen "split_1024_256.py" for å dele bildene til en størrelse som er ønskelig for den trente modellen. Dette skaper 256 piksler x 256 pikselstørrelser av bildene i "data" -mappen.
- Kopier den opprettede "data" -mappen til "7. Test Segmentering"-mappen.
- Naviger til mappen "7. Test Segmentation", og angi navnet på den lagrede modellen som skal brukes.
- For å segmentere avlingene, kjør filen "segment.py". De segmenterte bildene lagres i "output" -mappen.
7. Morfologisk analyse: Analyse av mitokondriell morfologi av de to datagruppene, "Glukose" og "CCCP"
- Ordne dataene som skal analyseres (en mappe for hvert bilde, med hver mappe som inneholder de segmenterte utgangsavlingene til ett bilde).
- Last ned og plasser tilleggsfilen "make_montage.py" i mappen "7. Test segmentering".
- Kjør filen "make_montage.py" for å sy den segmenterte utgangen tilbake til den opprinnelige størrelsen på bildet.
- Opprett en ny mappe med navnet "9. Morfologisk analyse " inne i "src" -mappen.
- Installer Skan16 - og Seaborn Python-pakkene i miljøet ved hjelp av kommandoen "pip install seaborn[stats] skan".
MERK: Segmenteringsmaskene er skeletonized ved hjelp av biblioteket kalt Skan for å muliggjøre analyse av topologien til hver enkelt mitokondrion. - Plasser tilleggsfilen " analyze_mitochondria.py " i mappen "9. Morfologisk analyse".
- Ordne bildene av forskjellige grupper av eksperimentet i forskjellige mapper i mappen "7. Test segmentering".
- Angi parametrene for "pikselstørrelse" og "inngangsbane" i filen " analyze_mitochondria.py".
- Kjør filen " analyze_mitochondria.py" for å kjøre koden for å skeletonize og lage plott av analysen.
Representative Results
Resultatene fra dyplæringssegmenteringene av mitokondrier i konfokale bilder av faste kardiomyoblaster som uttrykker fluorescerende mitokondriermarkører, viser nytten av denne metoden. Denne metoden er kompatibel med andre celletyper og mikroskopisystemer, og krever bare omskoling.
Galaktosetilpassede H9c2 kardiomyoblaster med fluorescerende mitokondrier ble behandlet med eller uten CCCP i 2 timer. Cellene ble deretter fikset, farget med et nukleært fargestoff og montert på glassglass for fluorescensmikroskopianalyse. Et konfokalt mikroskop ble brukt til å skaffe bilder av både kontroll- og CCCP-behandlede celler. Vi utførte vår analyse på 12 konfokale bilder, med ca. 60 celler per tilstand. Den morfologiske tilstanden til mitokondriene i hvert bilde ble deretter bestemt og kvantifisert. Segmenteringsmaskene hentet fra den trente modellen ble skjelettisert for å muliggjøre analyse av topologien til hver enkelt mitokondrion for dette eksperimentet. Grenlengden til de enkelte mitokondriene ble brukt som parameter for klassifisering. De enkelte mitokondriene ble klassifisert i morfologiske klasser ved følgende regel. Spesielt ble ethvert mitokondrielt skjelett med en lengde mindre enn 1,500 nm ansett som en prikk, og de lengre mitokondriene ble videre kategorisert i nettverk eller stang. Hvis det var minst ett kryss der to eller flere grener krysset hverandre, ble dette definert som et nettverk; Ellers ble mitokondrion klassifisert som en stang. Et eksempelbilde med mitokondrielle skjeletter merket med morfologiklassene er vist i figur 3.
Mitokondriell morfologikategorisering i figur 4A viser at det er mulig å oppdage signifikante endringer når CCCP brukes i 2 timer; Dette er tydeligst demonstrert av økningen i prikker for CCCP-behandlede celler.
Den gjennomsnittlige grenlengden i figur 4B er en annen vei for å illustrere påvisbare og signifikante endringer i morfologi. Både stenger og nettverk ble, som forventet, betydelig redusert i forhold til kontroll når cellene ble behandlet med CCCP. Den signifikante økningen i gjennomsnittlige grenlengder av prikker var også forventet gitt hevelsen som mitokondrier gjennomgår når de blir utsatt for CCCP.
Figur 1: Pipeline for simulering av fluorescensmikroskopibilder. Rørledningen inkluderer (i) 3D-geometrigenerering, (ii) emittere og fotokinetikkemulering, (iii) 3D PSF-konvolusjon, (iv) støytilsetning og (v) binarisering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Trinn i maskinlæringsbasert analyse av mitokondriell morfologi . (1) Bildene som skal segmenteres, beskjæres først i størrelser som er akseptable for segmenteringsmodellen. (2) Den dype læringsbaserte segmenteringen brukes på bildeavlingene. (3) De segmenterte utgangsavlingene er sydd tilbake til sin opprinnelige størrelse. (4) De montasjerte segmenteringene er skjelettisert. (6) Morfologisk analyse utføres basert på topologien fra skjelettiseringene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Mitokondrielt skjelett overlagt på segmenteringsutgangen til mikroskopibilder . (A) Segmenteringsutgangen. (B) Det rettlinjede skjelettet (euklidsk avstand mellom start- og sluttpunktene til en gren) er overlagt på toppen av segmenteringsutgangen. Fargekodingen av skjelettet skildrer klassen av mitokondrier. Nettverk er røde, stenger er grønne, og prikker er lilla i fargen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Analyse av mitokondriell morfologi. (A) En oversikt over den relative prosentandelen av forskjellige morfologiske kategorier basert på total mitokondriell lengde. (B) Sammenligning av gjennomsnittlig mitokondriell grenlengde mellom eksperimentelle forhold og mellom morfologiske kategorier. X-aksen viser de morfologiske kategoriseringene, og y-aksen viser mitokondrienes gjennomsnittlige grenlengde i nanometer (nm). Statistisk signifikans i form av p-verdier er vist som * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 og **** p < 0,0001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Feil tilfelle av segmentering. En høy tetthet av mitokondrier er et utfordrende scenario for segmenteringsmodellen. Det fargede skjelettet viser de lengste enkle mitokondriene som er oppdaget i bildet. Ved å gå gjennom lengdemålingene kan disse scenariene oppdages og bearbeides for å forbedre segmenteringsresultatene ved hjelp av den morfologiske operatøren erodere (slanker det oppdagede skjelettet). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Vi diskuterer forholdsregler knyttet til de kritiske trinnene i protokollen i avsnittene om "geometrigenerering" og "simulatorparametere". Avsnittet med tittelen "overføringslæring" diskuterer modifikasjoner for høyere gjennomstrømning når man tilpasser seg flere mikroskoper. Avsnittene om "partikkelanalyse" og "generering av andre subcellulære strukturer" refererer til fremtidige anvendelser av denne metoden. Avsnittet om "forskjellen fra biologisk sannhet" diskuterer de forskjellige årsakene til at simuleringene kan avvike fra reelle data og om disse grunnene påvirker vår anvendelse. Til slutt diskuterer vi et utfordrende scenario for vår metode i avsnittet "tettpakkede strukturer".
Generering av geometri
For å generere 3D-geometrien til mitokondrier, fungerer en enkel 2D-struktur opprettet fra b-spline-kurver som skjeletter bra for opprettelsen av det syntetiske datasettet. Disse syntetiske formene etterligner nøye formene av mitokondrier observert i 2D-cellekulturer. Men når det gjelder 3D-vev som hjertevev, er formen og arrangementet av mitokondrier ganske forskjellige. I slike tilfeller kan ytelsen til segmenteringsmodellen forbedres ved å legge til direksjonalitet i de simulerte bildene.
Simulator parametere
Forsiktighet bør utvises når du stiller inn parametrene til simulatoren for å sikre at de samsvarer med dataene som skal kjøres slutningen på, da unnlatelse av å gjøre dette kan føre til lavere ytelse ved segmentering. En slik parameter er signal-til-støy-forholdet (SNR) -området. Området for SNR for dataene som skal testes, bør samsvare med verdiene i det simulerte datasettet. I tillegg skal PSF-en som brukes, samsvare med måltestdataene. Modelltrente bilder fra en konfokal PSF bør for eksempel ikke brukes til å teste bilder fra et epifluorescerende mikroskop. En annen parameter å være oppmerksom på er bruken av ekstra forstørrelse i testdataene. Hvis ytterligere forstørrelse har blitt brukt i testdataene, bør simulatoren også stilles inn på riktig måte.
Overfør læring
Overføringslæring er fenomenet å utnytte en lært modell trent på en oppgave for bruk i en annen oppgave. Dette fenomenet gjelder også for vårt problem i forhold til ulike typer mikroskopdata. Vektene til segmenteringsmodellen (utstyrt med kildekoden) som er opplært på en type mikroskopidata, kan brukes til å initialisere en segmenteringsmodell som skal brukes på en annen type optiske mikroskopdata. Dette gjør at vi kan trene på en betydelig mindre delmengde av treningsdatasettet (3000 bilder sammenlignet med 10.000), og dermed redusere beregningskostnadene ved simulering.
Partikkelanalyse
Partikkelanalyse kan også utføres på de segmenterte maskene. Dette kan gi informasjon om området og krumningen, etc., av de enkelte mitokondriene. Denne informasjonen kan også tjene som beregninger for kvantitativ sammenligning av mitokondrier (ikke brukt til dette eksperimentet). For eksempel definerer vi for tiden prikkmorfologien ved hjelp av en terskel basert på lengden på mitokondriene. Det kan være nyttig, i noen tilfeller, å innlemme elliptisitet for bedre å skille små stanglignende mitokondrier fra puncta eller prikklignende mitokondrier. Alternativt, hvis visse biologiske forhold fører til at mitokondriene krøller seg sammen, kan krumningskvantifisering være av interesse for å analysere mitokondriell populasjon.
Generering av andre subcellulære strukturer
Den fysikkbaserte segmenteringen av subcellulære strukturer er demonstrert for mitokondrier og vesikler1. Selv om vesikler utviser varierende former, er størrelsene mindre, og de ser ut som enkle kuler når de observeres gjennom et fluorescensmikroskop. Derfor simuleres geometrien av vesikler ved bruk av sfæriske strukturer med et passende diameterområde. Dette innebærer en endring i funksjonen genererer geometrien (sylindere i tilfelle mitokondrier og kuler i tilfelle vesikler) av strukturer og respektive parametere (trinn 5.4 i protokolldelen). Geometrisk har endoplasmatisk retikulum og mikrotubuli også blitt simulert som rørformede strukturer17. Modellering av endoplasmatisk retikulum med en diameter på 150 nm og mikrotubuli med en gjennomsnittlig ytre diameter på 25 nm og et indre hulrør på 15 nm i diameter gir tilnærminger av formene til disse strukturene. En annen parameter som vil variere for hver av disse subcellulære strukturer er fluorofortettheten. Dette beregnes ut fra fordelingen av biomolekylet som fluorforene binder seg til og sannsynligheten for binding.
Forskjell fra biologisk grunnsannhet
De simulerte dataene som brukes til simuleringsovervåket opplæring av dyplæringsmodellen, skiller seg fra reelle data på mange måter. (i) Fraværet av ikke-spesifikk merking i de simulerte dataene skiller seg fra reelle data, da det ofte er frittflytende fluoroforer i de virkelige dataene. Dette fører til en høyere gjennomsnittlig bakgrunnsverdi i det virkelige bildet. Denne forskjellen reduseres ved å matche SNR og sette bakgrunnsverdien slik at den samsvarer med de observerte reelle verdiene. (ii) Bevegelsen av subcellulære strukturer og fotokinetikk er to kilder til dynamikk i systemet. Bevegelige strukturer i levende celler (som beveger seg i området noen få millisekunder) forårsaker bevegelsesuskarphet. Eksponeringstiden reduseres under reell datainnsamling for å unngå uskarphetseffekten. På den annen side simulerer vi ikke timelapse og antar ubevegelige strukturer; Denne antagelsen er gyldig når eksponeringstiden i de reelle dataene er liten. Denne antagelsen kan imidlertid gi en feil i utgangen hvis eksponeringstiden til de virkelige dataene er stor nok til å introdusere bevegelsesuskarphet. Fotokinetikk, derimot, er i størrelsesorden nanosekunder til mikrosekunder og kan utelates i simuleringen, siden de vanlige eksponeringstidene for eksperimenter er lange nok (i størrelsesorden millisekunder) til å gjennomsnittlig effekten av fotokinetikk. (iii) Støy i mikroskopbilder har forskjellige kilder, og disse kildene har forskjellige sannsynlighetstetthetsfunksjoner. I stedet for å modellere disse individuelle støykildene, tilnærmer vi det som en gaussisk støy over en konstant bakgrunn. Denne forskjellen endrer ikke datafordelingen vesentlig for forholdene med lavt signal-til-bakgrunnsforhold (i området 2-4) og når det gjelder makrodensiteten til fluoroforer1. (iv) Artefakter i avbildning kan oppstå fra avvik, drift og systematiske uskarpheter. Vi antar at mikroskopet er godt justert og at regionene som er valgt for analyse i de virkelige dataene, er blottet for disse artefaktene. Det er også mulighet for modellering av noen av disse gjenstandene i PSF18,19,20.
Tettpakkede strukturer
Vanskelighetene med ikke å kunne skille overlappende stenger fra nettverk er et vedvarende problem i segmenteringen av 2D-mikroskopidata. Et ekstremt utfordrende scenario er presentert i figur 5, hvor mitokondriene er tett pakket, noe som fører til suboptimale resultater i segmenteringsmodellen og følgende analyse. Til tross for denne utfordringen kan bruk av morfologiske operatorer i slike situasjoner for å slanke skjelettiseringen bidra til å bryte disse altfor tilkoblede nettverkene, samtidig som betydelige endringer i alle mitokondrielle morfologikategorier fortsatt kan oppdages. I tillegg er bruken av et konfokal snarere enn et vidvinkelmikroskop for avbildning en metode for delvis å redusere dette problemet ved å eliminere ufokusert lys. Videre vil det i fremtiden være nyttig å utføre 3D-segmentering for å skille mitokondrier som krysser (dvs. fysisk danner et nettverk) fra stanglignende mitokondrier hvis fremspring i et enkelt plan overlapper hverandre.
Deep-learning segmentering er et lovende verktøy som tilbyr å utvide analysemulighetene til mikroskopibrukere, og dermed åpne muligheten for automatisert analyse av komplekse data og store kvantitative datasett, som tidligere ville vært uhåndterlig.
Disclosures
Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikter knyttet til denne artikkelen.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner diskusjonen med Arif Ahmed Sekh. Zambarlal Bhujabal er anerkjent for å hjelpe til med å konstruere de stabile H9c2-cellene. Vi anerkjenner følgende midler: ERC startbevilgning nr. 804233 (til K.A.), Forskerprosjekt for fornyelse nr. 325741 (til D.K.P.), Helse Nord RHF nr. HNF1449-19 (Å.B.B.), og UiTs tematiske finansieringsprosjekt VirtualStain med Cristin Prosjekt-ID 2061348 (D.K.P., Å.B.B., K.A., og A.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate | FALCON | 353043 | |
| Aqueous Glutaraldehyde EM Grade 25% | Electron Microscopy Sciences | 16200 | |
| Axio Vert.A1 | Zeiss | Brightfield microscope | |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| Computer | n/a | n/a | Must be running Linux/Windows Operating System having an NVIDIA GPU with at least 4GB of memory |
| Coverslips | VWR | 631-0150 | |
| DAPI (stain) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| DMEM | gibco | 11966-025 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Glass Slides (frosted edge) | epredia | AA00000112E01MNZ10 | |
| H9c2 mCherry-EGFP-OMP25 | In-house stable cell line derived from purchased cell line | ||
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51033557 | |
| LSM 800 | Zeiss | Confocal Microscope | |
| Mounting Media (Glass) | Thermo Fisher Scientific | P36980 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Thermo Fisher Scientific | J19943-K2 | |
| Plan-Apochromat 63x oil (M27) objective with an NA of 1.4 | Zeiss | 420782-9900-000 | |
| Sterile laminar flow hood | Labogene | SCANLAF MARS | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Vacusafe aspiration system | VACUUBRAND | 20727400 | |
| ZEN 2.6 | Zeiss |
References
- Sekh, A. A., et al. Physics-based machine learning for subcellular segmentation in living cells. Nature Machine Intelligence. 3, 1071-1080 (2021).
- Pernas, L., Scorrano, L. Mito-morphosis: Mitochondrial fusion, fission, and cristae remodeling as key mediators of cellular function. Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).
- Li, Y., et al. Imaging of macrophage mitochondria dynamics in vivo reveals cellular activation phenotype for diagnosis. Theranostics. 10 (7), 2897-2917 (2020).
- Xu, X., Xu, S., Jin, L., Song, E. Characteristic analysis of Otsu threshold and its applications. Pattern Recognition Letters. 32 (7), 956-961 (2011).
- Legland, D., Arganda-Carreras, I., Schindelin, J. MorphoLibJ: MorphoLibJ v1.2.0. Zenodo. , Available from: https://zenodo.org/record/50694#.Y8qfo3bP23A (2016).
- Arganda-Carreras, I., et al. Trainable_Segmentation: Release v3.1.2. Zenodo. , Available from: https://zenodo.org/record/59290#.Y8qf13bP23A (2016).
- Chu, C. H., Tseng, W. W., Hsu, C. M., Wei, A. C. Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research. Frontiers in Physics. 10, 289 (2022).
- Xue, F., Li, J., Blu, T. Fast and accurate three-dimensional point spread function computation for fluorescence microscopy. Journal of the Optical Society of America A. 34 (6), 1029-1034 (2017).
- Lanni, F., Gibson, S. F. Diffraction by a circular aperture as a model for three-dimensional optical microscopy. Journal of the Optical Society of America A. 6 (9), 1357-1367 (1989).
- Sekh, A. A., et al. Physics based machine learning for sub-cellular segmentation in living cells. Nature Machine Intelligence. 3, 1071-1080 (2021).
- Liu, Y., Song, X. D., Liu, W., Zhang, T. Y., Zuo, J. Glucose deprivation induces mitochondrial dysfunction and oxidative stress in PC12 cell line. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 7 (1), 49-56 (2003).
- Dott, W., Mistry, P., Wright, J., Cain, K., Herbert, K. E. Modulation of mitochondrial bioenergetics in a skeletal muscle cell line model of mitochondrial toxicity. Redox Biology. 2, 224-233 (2014).
- Ishihara, N., Jofuku, A., Eura, Y., Mihara, K. Regulation of mitochondrial morphology by membrane potential, and DRP1-dependent division and FZO1-dependent fusion reaction in mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (4), 891-898 (2003).
- Miyazono, Y., et al. Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner. Scientific Reports. 8, 350 (2018).
- Ganote, C. E., Armstrong, S. C. Effects of CCCP-induced mitochondrial uncoupling and cyclosporin A on cell volume, cell injury and preconditioning protection of isolated rabbit cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 35 (7), 749-759 (2003).
- Nunez-Iglesias, J., Blanch, A. J., Looker, O., Dixon, M. W., Tilley, L. A new Python library to analyse skeleton images confirms malaria parasite remodelling of the red blood cell membrane skeleton. PeerJ. 2018, 4312 (2018).
- Sage, D., et al. Super-resolution fight club: Assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software. Nature Methods. 16, 387-395 (2019).
- Yin, Z., Kanade, T., Chen, M. Understanding the phase contrast optics to restore artifact-free microscopy images for segmentation. Medical Image Analysis. 16 (5), 1047-1062 (2012).
- Malm, P., Brun, A., Bengtsson, E. Simulation of bright-field microscopy images depicting pap-smear specimen. Cytometry. Part A. 87 (3), 212-226 (2015).
- Bifano, T., Ünlü, S., Lu, Y., Goldberg, B. Aberration compensation in aplanatic solid immersion lens microscopy. Optical Express. 21 (23), 28189-28197 (2013).
