Summary
En este artículo se explica cómo utilizar el aprendizaje automático supervisado por simulación para analizar la morfología de las mitocondrias en imágenes de microscopía de fluorescencia de células fijas.
Abstract
El análisis cuantitativo de orgánulos subcelulares como las mitocondrias en imágenes de microscopía de fluorescencia celular es una tarea exigente debido a los desafíos inherentes en la segmentación de estas estructuras pequeñas y morfológicamente diversas. En este artículo, demostramos el uso de una canalización de segmentación y análisis asistida por aprendizaje automático para la cuantificación de la morfología mitocondrial en imágenes de microscopía de fluorescencia de células fijas. La herramienta de segmentación basada en aprendizaje profundo se entrena en imágenes simuladas y elimina el requisito de anotaciones de verdad básica para el aprendizaje profundo supervisado. Demostramos la utilidad de esta herramienta en imágenes de microscopía de fluorescencia de cardiomioblastos fijos con una expresión estable de marcadores mitocondriales fluorescentes y empleamos condiciones específicas de cultivo celular para inducir cambios en la morfología mitocondrial.
Introduction
En este artículo, demostramos la utilidad de una herramienta de aprendizaje automático basada en la física para la segmentación subcelular1 en imágenes de microscopía de fluorescencia de cardiomioblastos fijos que expresan marcadores de mitocondrias fluorescentes.
Las mitocondrias son los principales orgánulos productores de energía en las células de mamíferos. Específicamente, las mitocondrias son orgánulos altamente dinámicos y a menudo se encuentran en redes que cambian constantemente en longitud y ramificación. La forma de las mitocondrias afecta su función, y las células pueden cambiar rápidamente su morfología mitocondrial para adaptarse a un cambio en el medio ambiente2. Para comprender este fenómeno, la clasificación morfológica de las mitocondrias como puntos, bastones o redes es altamente informativa3.
La segmentación de las mitocondrias es crucial para el análisis de la morfología mitocondrial en las células. Los métodos actuales para segmentar y analizar imágenes de microscopía de fluorescencia de las mitocondrias se basan en la segmentación manual o en enfoques convencionales de procesamiento de imágenes. Los enfoques basados en umbrales como Otsu4 son menos precisos debido a los altos niveles de ruido en las imágenes de microscopía. Por lo general, las imágenes para el análisis morfológico de las mitocondrias presentan un gran número de mitocondrias, lo que hace que la segmentación manual sea tediosa. Los enfoques matemáticos como MorphoLibJ5 y los enfoques de aprendizaje automático semisupervisados como Weka6 son muy exigentes y requieren conocimientos expertos. Una revisión de las técnicas de análisis de imágenes para las mitocondrias7 mostró que las técnicas basadas en el aprendizaje profundo pueden ser útiles para la tarea. De hecho, la segmentación de imágenes en imágenes de la vida cotidiana para aplicaciones como la conducción autónoma se ha revolucionado con el uso de modelos basados en el aprendizaje profundo.
El aprendizaje profundo es un subconjunto del aprendizaje automático que proporciona algoritmos que aprenden de grandes cantidades de datos. Los algoritmos de aprendizaje profundo supervisados aprenden las relaciones de grandes conjuntos de imágenes que están anotadas con sus etiquetas de verdad básica (GT). Los desafíos en el uso del aprendizaje profundo supervisado para segmentar las mitocondrias en imágenes de microscopía de fluorescencia son dobles. En primer lugar, el aprendizaje profundo supervisado requiere un gran conjunto de datos de imágenes de entrenamiento y, en el caso de la microscopía de fluorescencia, proporcionar este gran conjunto de datos sería una tarea extensa en comparación con cuando se utilizan imágenes tradicionales basadas en cámaras más fácilmente disponibles. En segundo lugar, las imágenes de microscopía de fluorescencia requieren anotaciones GT de los objetos de interés en las imágenes de entrenamiento, lo cual es una tarea tediosa que requiere un conocimiento experto. Esta tarea puede tomar fácilmente horas o días del tiempo del experto para una sola imagen de células con estructuras subcelulares marcadas con fluorescencia. Además, las variaciones entre los anotadores plantean un problema. Para eliminar la necesidad de anotación manual y poder aprovechar el rendimiento superior de las técnicas de aprendizaje profundo, se utilizó aquí un modelo de segmentación basado en el aprendizaje profundo que se entrenó en imágenes simuladas. Los simuladores basados en la física proporcionan una forma de imitar y controlar el proceso de formación de imágenes en un microscopio, lo que permite la creación de imágenes de formas conocidas. Utilizando un simulador basado en la física, se creó un gran conjunto de datos de imágenes de microscopía de fluorescencia simuladas de mitocondrias para este propósito.
La simulación comienza con la generación de geometría utilizando curvas paramétricas para la generación de formas. Los emisores se colocan aleatoriamente en la superficie de la forma de manera uniformemente distribuida de tal manera que la densidad coincida con los valores experimentales. Una función de dispersión de puntos 3D (PSF) del microscopio se calcula utilizando una aproximación computacionalmente eficiente8 del modelo9 de Gibson-Lanni. Para hacer coincidir estrechamente las imágenes simuladas con las imágenes experimentales, tanto la corriente oscura como el ruido de disparo se emulan para lograr el realismo fotográfico. El GT físico se genera en forma de mapa binario. El código para generar el conjunto de datos y entrenar el modelo de simulación está disponible10, y el paso para crear este conjunto de datos simulado se describe en la figura 1.
Mostramos la utilidad de la segmentación basada en el aprendizaje profundo entrenada completamente en un conjunto de datos simulado mediante el análisis de imágenes de microscopía confocal de cardiomioblastos fijos. Estos cardiomioblastos expresaron un marcador fluorescente en la membrana externa mitocondrial, lo que permitió la visualización de las mitocondrias en las imágenes de microscopía de fluorescencia. Antes de realizar el experimento dado como ejemplo aquí, las células fueron privadas de glucosa y adaptadas a la galactosa durante 7 días en cultivo. La sustitución de la glucosa en los medios de crecimiento por galactosa obliga a las células en cultivo a volverse más oxidativas y, por lo tanto, dependientes de sus mitocondrias para la producción de energía11,12. Además, esto hace que las células sean más sensibles al daño mitocondrial. Los cambios en la morfología mitocondrial pueden ser inducidos experimentalmente mediante la adición de un agente de desacoplamiento mitocondrial como cianuro de carbonilo m-clorofenil hidrazona (CCCP) al medio de cultivo celular13. La CCCP conduce a una pérdida del potencial de la membrana mitocondrial (ΔΨm) y, por lo tanto, resulta en cambios en las mitocondrias de una morfología más tubular (en forma de bastón) a una morfología más globular (en forma de punto)14. Además, las mitocondrias tienden a hincharse durante el tratamiento con PCCC15. Mostramos la distribución morfológica de los cambios mitocondriales cuando los cardiomioblastos adaptados a la galactosa fueron tratados con el desacoplador mitocondrial CCCP. Las segmentaciones de aprendizaje profundo de las mitocondrias nos permitieron clasificarlas como puntos, bastones o redes. Luego derivamos métricas cuantitativas para evaluar la longitud de las ramas y la abundancia de los diferentes fenotipos mitocondriales. Los pasos del análisis se describen en la Figura 2, y los detalles del cultivo celular, las imágenes, la creación de conjuntos de datos para la segmentación basada en el aprendizaje profundo, así como el análisis cuantitativo de las mitocondrias, se dan a continuación.
Protocol
NOTA: Las secciones 1-4 pueden omitirse si se trabaja con imágenes de microscopía existentes de mitocondrias con condiciones experimentales conocidas.
1. Cultivo celular
- Cultive las células H9c2 en DMEM sin glucosa suplementada con 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 10 mM de galactosa, 10% de FBS, 1% de estreptomicina/penicilina y 1 μg/ml de puromicina. Permita que las células se adapten a la galactosa durante al menos 7 días en cultivo antes de los experimentos.
NOTA: Las células H9c2 utilizadas aquí han sido modificadas genéticamente para expresar mitocondrias fluorescentes y también han adquirido un gen de resistencia a la puromicina. La adición de este antibiótico asegura el crecimiento de células con el gen de resistencia y, por lo tanto, mitocondrias fluorescentes. - Sembrar las células H9c2 para el experimento cuando la confluencia celular alcance aproximadamente el 80% (matraz de cultivo T75, evaluado por microscopía de campo claro). Precaliente el medio y la tripsina a 37 °C durante al menos 15 minutos antes de continuar.
NOTA: Es posible realizar el experimento en paralelo con dos o más condiciones diferentes de cultivo celular. La confluencia de células H9c2 no debe estar por encima del 80% para evitar la pérdida de células mioblásticas. Al 100% de confluencia, las células forman miotubos y comienzan a diferenciarse. - Prepárese para sembrar las células, operando en una campana de flujo laminar estéril, colocando un cubreobjetos de vidrio # 1.5 para cada condición experimental en un pozo de una placa de 12 pocillos. Etiquete cada condición y los detalles experimentales en la placa de 12 pocillos.
- Mover el matraz de cultivo celular de la incubadora a la superficie de trabajo de la campana. Aspirar el medio con un sistema de aspiración o pipeta electrónica, y luego lavar dos veces con 5 ml de PBS (temperatura ambiente).
- Mueva la tripsina precalentada a la superficie de trabajo y aspire el lavado final de PBS; a continuación, añadir la tripsina precalentada para desprender las células (1 ml para un matraz de cultivo T75). Volver a colocar el matraz de cultivo en la incubadora durante 2-3 min a 37°C.
- Mueva el medio precalentado a la superficie de trabajo hacia el final de la incubación. Verifique que las células se hayan desprendido con un microscopio de campo claro.
- Si no se han desprendido todas las células, aplique varios golpecitos cuidadosos pero firmes en el lado del matraz para separar las células restantes.
- Devolver el matraz de cultivo a la superficie de trabajo. Añadir 4 ml de medio de cultivo celular al matraz de cultivo con una pipeta electrónica para detener la acción de la tripsina. Cuando se añada el medio de cultivo al matraz, utilice la pipeta para dispersar repetidamente el medio por la superficie para separar y reunir las células en una suspensión celular.
- Pipetear la suspensión celular (5 ml) del matraz a un tubo de 15 ml.
- Centrifugar las celdas a 200 x g durante 5 min. Abra el tubo en la campana, retire el sobrenadante por aspiración y vuelva a suspender el pellet celular suavemente en 5 ml de medios de cultivo celular.
- Evalúe el número de células analizando un pequeño volumen de la suspensión celular en un contador de células automatizado. Tenga en cuenta el número de células vivas por mililitro de medios de cultivo.
- Mover el volumen deseado (por ejemplo, 150 μL por pocillo) de la suspensión celular, calculado para una densidad de siembra de aproximadamente 2 x 104 células/cm2, a un tubo centrífugo de 15 ml premarcado. Agregue el medio de cultivo celular precalentado al tubo de centrífuga de 15 ml a un volumen precalculado basado en el número de pocillos. Para placas de 12 pocillos, use un volumen total de 1 ml para cada pocillo.
- Asegúrese de que la suspensión de celda diluida se mezcle correctamente pipeteando el contenido del tubo de centrífuga hacia arriba y hacia abajo varias veces antes de dispensar el volumen apropiado a cada pocillo. Una vez que la suspensión celular se dispensa en el pozo, agite la placa de una manera cuidadosamente controlada en cada dirección para distribuir mejor las células a través de los pocillos. Colocar la placa de 12 pocillos en la incubadora a 37°C hasta el día siguiente.
- Revise las células con un microscopio de campo claro para evaluar el crecimiento. Si las células han logrado un crecimiento suficiente hasta aproximadamente el 80% de confluencia, continúe con los siguientes pasos; De lo contrario, repita la evaluación diariamente hasta que se alcance un crecimiento suficiente.
2. Procedimiento experimental
- Calcular las cantidades necesarias de los materiales para el experimento de acuerdo con las concentraciones de la solución madre. Descongele los materiales congelados (solución madre CCCP de 30 mM) a 37 °C y ajuste el medio de cultivo celular para precalentarlos a 37 °C.
- Una vez descongelada, crear una solución de trabajo de CCCP de 10 μM diluyendo la solución madre (1:3.000) en medio de cultivo celular.
NOTA: No pipetear volúmenes inferiores a 1 μL. - Comience los tratamientos experimentales una vez que todos los materiales necesarios estén preparados y precalentados. Aspirar el medio de cultivo celular de los pocillos de la placa de 12 pocillos y luego aplicar rápidamente el medio fresco precalentado a los pocillos de control y el medio precalentado con solución CCCP de 10 μM a los pocillos de condición de prueba.
- Incubar la placa de 12 pocillos en la incubadora de células a 37 °C durante 2 h. Durante el período de incubación, prepare la solución de fijación.
- Para la preparación de la solución de fijación, use paraformaldehído (PFA) al 4% prefabricado para diluir la solución madre de glutaraldehído (GA) al 25% (GA) al 0,2% (1:125). Ajuste la solución para precalentar a 37 °C. Para una placa de 12 pocillos, 500 μL es suficiente por pocillo.
PRECAUCIÓN: PFA y GA son sustancias químicas tóxicas. Trabaje en una campana química con equipo de protección. Consulte sus respectivas SDS para obtener más detalles. - Cuando finalice el período de incubación, retire la placa de 12 pocillos de la incubadora y colóquela en la superficie de trabajo.
NOTA: El trabajo ya no requiere un ambiente estéril. - Aspirar el medio de cultivo celular de los pocillos y aplicar la solución de fijación precalentada. Devolver la placa de 12 pocillos a la incubadora a 37 °C durante 20 min.
- Aspirar la solución de fijación al completar la incubación y lavar cada pocillo dos veces con PBS a temperatura ambiente. Es posible pausar el experimento en esta etapa del protocolo y continuar más tarde.
- Si el experimento está en pausa, agregue 1 ml de PBS por pocillo, selle la placa de 12 pocillos con una película de plástico (parapelícula) y guárdela a 4 ° C.
3. Tinción y montaje de las celdas en los cubreobjetos
- Descongele el material DAPI (tinción nuclear) y gire hacia abajo en una mini centrífuga antes de abrir. Prepare la solución de tinción DAPI diluyendo el stock de DAPI en PBS (1:1.000).
- Aspire el PBS de la placa de 12 pocillos y aplique 1 ml de solución de tinción DAPI en cada pocillo. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 5 min.
- Aspire la solución de tinción DAPI. Lave dos veces con 2 ml de PBS por pocillo.
- Prepare portaobjetos de microscopio de vidrio esmerilado (portaobjetos de vidrio) lavándolos en etanol al 70%, seguido de tres lavados en PBS. Seque cuidadosamente los portaobjetos con toallas de papel sin pelusa y diríjalos hacia la luz para verificar si hay signos de polvo o grasa.
NOTA: Se requieren guantes para este paso. - Etiquete las diapositivas de vidrio con los detalles experimentales. Transfiera el medio de montaje a un tubo de microcentrífuga y gire hacia abajo en una mini centrífuga.
- Prepárese para montar los cubreobjetos organizando el espacio de trabajo. Mantenga lista una placa de 12 pocillos con cubreobjetos, portaobjetos de vidrio etiquetados, medio de montaje, una pipeta, puntas de pipeta de 10 μL, toallas de papel sin pelusa y pinzas.
- Aplique 10 μL de medio de montaje (vidrio ProLong) a un portaobjetos de vidrio preparado para montar un cubreobjetos.
- Recoja el cubreobjetos de la placa de 12 pocillos con unas pinzas y aplique la humedad del cubreobjetos tocando brevemente el borde y la parte posterior del cubreobjetos con la toalla de papel sin pelusa preparada. Baje suavemente el cubreobjetos hacia abajo sobre la gota del medio de montaje.
- Repita los dos pasos anteriores para cada cubreobjetos. Coloque las gotas medianas de montaje para permitir entre uno y cuatro cubreobjetos por portaobjetos de vidrio.
- Asegúrese de que las guías de vidrio estén sobre una superficie plana para evitar que los cubreobjetos montados se muevan. Coloque las guías de vidrio en un lugar oscuro a temperatura ambiente durante la noche para permitir que el medio de montaje se asiente. Las muestras ya están listas para la obtención de imágenes. El experimento puede pausarse en esta etapa del protocolo y continuar más tarde.
- Si el experimento se detiene en esta etapa, después de haber permitido que las muestras se fijen durante la noche a temperatura ambiente, cúbralas con papel de aluminio para protegerlas de la luz y guárdelas a 4 ° C.
4. Microscopía e imagen
- Cubra las muestras con papel de aluminio para el transporte (si aún no lo ha hecho).
- Al llegar a la instalación de microscopía, use H2O de doble destilación con papel de filtro de microscopio para limpiar los residuos de PBS de los cubreobjetos de los portaobjetos de vidrio. Verifique que no haya manchas en los cubreobjetos sosteniendo las diapositivas de vidrio hacia una luz brillante.
- Siga el procedimiento de inicio para el microscopio. Seleccione el objetivo apropiado (Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil M27), y añada el medio de inmersión.
- Coloque la muestra en el portamuestras. Dentro del software del microscopio, use la pestaña "Localizar" para activar la iluminación de fluorescencia EGFP y, usando los oculares, ajuste manualmente el nivel z para enfocar la muestra. Apague la iluminación de fluorescencia al encontrar el foco.
- Cambie a la pestaña "Adquirir" dentro del software del microscopio. Utilice la "Configuración inteligente" para seleccionar los canales de fluorescencia que se utilizarán para la obtención de imágenes. Para este experimento, se seleccionaron los ajustes preestablecidos de canal EGFP y DAPI.
- Ajuste la intensidad de cada canal desde la configuración inicial utilizando el histograma de intensidad como guía para optimizar la intensidad de la señal. Las imágenes ahora pueden comenzar.
- Para obtener imágenes, utilice la opción del software para colocar las posiciones de imagen en una matriz y centrar la matriz en el centro del cubreobjetos con 12 posiciones totales para obtener imágenes. Compruebe que cada posición de la matriz contiene celdas. Si no hay celdas, ajuste la posición a un área con celdas.
- Ajuste el enfoque de cada posición en la matriz utilizando el enfoque automático del software del microscopio, y siga esto con un ajuste fino manual para garantizar que tantas mitocondrias como sea posible estén enfocadas.
NOTA: El canal EGFP se utiliza para estos ajustes manuales. - Obtenga las imágenes utilizando este método para cada cubreobjetos. Guarde los archivos de imagen y continúe con los pasos para el análisis morfológico.
5. Generación de datos de entrenamiento simulados
- Descargue el código10 y descomprima el contenido. Siga las instrucciones de README.md para configurar el entorno requerido.
- Navegue a la carpeta llamada "src", que es la carpeta de inicio de este proyecto. Las carpetas numeradas en el interior contienen códigos que son específicos de los diferentes pasos del uso de la herramienta.
Nota : utilice el comando "cd <>" para navegar a cualquier subcarpeta del código. Para ejecutar cualquier archivo python, use el comando "python < >.py ". La presentación denominada "Tutorial.pptx" contiene un conjunto completo de instrucciones para utilizar el modelo de segmentación. - Haga una copia o use la carpeta "2. Mitochondria Simulation Airy", y cámbiele el nombre (Airy se usa aquí ya que es la función PSF más cercana a un microscopio confocal, que se usó como el microscopio actual). Vaya a la carpeta llamada "simulador".
NOTA: Esta carpeta contiene todos los archivos relacionados con la simulación de los datos de entrenamiento. Hay tres conjuntos de parámetros que se establecerán para la simulación. - Primero, para el simulador en el archivo de configuración por lotes "simulador / lote / bxx.csv", establezca los parámetros para aproximadamente la muestra, incluido el número de mitocondrias, el rango de diámetros y las longitudes de las estructuras, el rango del eje z que exhibe la estructura y la densidad de los fluoróforos.
- A continuación, establezca los parámetros relacionados con el sistema óptico.
- Este conjunto incluye el tipo de microscopio (que determina qué modelo de PSF se selecciona), la apertura numérica (N.A.), el aumento (M), el tamaño de píxel (en μm), la longitud de onda de emisión de los fluoróforos y el parámetro de ruido de fondo, etc.
- Establezca los parámetros ópticos de N.A., el aumento y la longitud de onda mínima del conjunto de datos en el archivo "simulador/microscPSFmod.py".
- Establezca el valor deseado para el tamaño de píxel y establezca la longitud de onda de emisión del conjunto de datos como parámetro para la función "process_matrix_all_z" en el archivo "simulador / generate_batch_parallel.py".
- Establezca los últimos tres parámetros de la función "save_physics_gt" en el archivo "simulador / generate_batch_parallel.py". Los parámetros son el tamaño de píxel (en nm), el tamaño de la imagen de salida y max_xy.
- Establezca el tercer conjunto de parámetros con respecto al conjunto de datos de salida, como el tamaño de las imágenes de salida, el número de mosaicos en cada imagen y el número de imágenes totales, en el archivo "simulador / generate_batch_parallel.py".
- Ejecute el archivo "simulador/generate_batch_parallel.py" para iniciar la simulación.
- Para obtener la imagen de tamaño final, haga una copia de la carpeta denominada "5. Preparación de datos y Capacitación / preparación de datos" en la carpeta de inicio, y navegue hasta ella.
NOTA: Cada imagen del conjunto de datos sintéticos se forma creando un montaje de cuatro imágenes simuladas de 128 píxeles x 128 píxeles, lo que da un tamaño de imagen final de 256 píxeles x 256 píxeles. Esto primero genera muchas teselas individuales (alrededor de 12,000) tanto para las imágenes del microscopio (en la carpeta "salida") como para las segmentaciones de la verdad del suelo (en la carpeta "salida / physics_gt").- Establezca los parámetros del número de lote, el número de imágenes por lote y el rango de ruido en "data_generator.py".
- Ejecute el archivo "data_generator.py" para crear las imágenes de montaje.
- Copie las carpetas llamadas "imagen" y "segmento" en el "5. Preparación de datos y formación/datatrain/train" de la carpeta "5. Preparación y formación de datos/preparación de datos/datos".
6. Segmentación basada en el aprendizaje profundo
- Entrene el modelo de segmentación en las imágenes simuladas de la siguiente manera:
- Para entrenar el modelo de segmentación para un nuevo microscopio, navegue hasta el "5. Preparación de datos y entrenamiento/entrenamiento", y establezca los parámetros del tamaño del lote, el modelo de columna vertebral para la segmentación, el número de épocas y la tasa de aprendizaje para la capacitación en el archivo "train_UNet.py".
- Ejecute "train_UNet.py" para iniciar el entrenamiento. El proceso de entrenamiento muestra la métrica para el rendimiento de la segmentación en el conjunto de validación simulado.
NOTA: Una vez completado el entrenamiento, el modelo se guarda como "best_model.h5" en el "5. Preparación de datos y formación/formación".
- Pruebe el modelo en imágenes de microscopio reales que se dividen a un tamaño que sea deseable para el modelo entrenado a través de los siguientes pasos.
- Vaya a "6. Prepare los datos de prueba" y copie el archivo ". PNG" formatea los archivos de los datos en la carpeta "PNG".
- Ejecute el archivo "split_1024_256.py" para dividir las imágenes a un tamaño que sea deseable para el modelo entrenado. Esto crea recortes de tamaño de 256 píxeles x 256 píxeles de las imágenes en la carpeta "datos".
- Copie la carpeta "data" creada en el "7. Segmentación de pruebas".
- Navegue a la carpeta "7. Segmentación de prueba" y establezca el nombre del modelo guardado que se utilizará.
- Para segmentar los cultivos, ejecute el archivo "segment.py". Las imágenes segmentadas se guardan en la carpeta "salida".
7. Análisis morfológico: Análisis de la morfología mitocondrial de los dos grupos de datos, "Glucosa" y "CCCP"
- Organice los datos a analizar (una carpeta para cada imagen, con cada carpeta que contiene los recortes de salida segmentados de una imagen).
- Descargue y coloque el archivo complementario llamado "make_montage.py" en la carpeta llamada "7. Segmentación de pruebas".
- Ejecute el archivo "make_montage.py" para volver a unir la salida segmentada al tamaño original de la imagen.
- Cree una nueva carpeta denominada "9. Análisis Morfológico" dentro de la carpeta "src".
- Instale los paquetes Skan16 y Seaborn Python en el entorno utilizando el comando "pip install seaborn[stats] skan".
NOTA: Las máscaras de segmentación están esqueletizadas utilizando la biblioteca llamada Skan para permitir el análisis de la topología de cada mitocondria individual. - Coloque el archivo complementario " analyze_mitochondria.py " en la carpeta "9. Análisis Morfológico".
- Organice las imágenes de diferentes grupos del experimento en diferentes carpetas dentro de la carpeta "7. Segmentación de pruebas".
- Establezca los parámetros de "tamaño de píxel" y "ruta de entrada" en el archivo "analyze_mitochondria.py".
- Ejecute el archivo " analyze_mitochondria.py" para ejecutar el código para esqueletizar y crear gráficos del análisis.
Representative Results
Los resultados de las segmentaciones de aprendizaje profundo de las mitocondrias en imágenes confocales de cardiomioblastos fijos que expresan marcadores de mitocondrias fluorescentes muestran la utilidad de este método. Este método es compatible con otros tipos de células y sistemas de microscopía, requiriendo solo reentrenamiento.
Los cardiomioblastos H9c2 adaptados a galactosa con mitocondrias fluorescentes se trataron con o sin PCCC durante 2 h. Luego, las células se fijaron, se tiñeron con un tinte nuclear y se montaron en portaobjetos de vidrio para el análisis de microscopía de fluorescencia. Se utilizó un microscopio confocal para adquirir imágenes tanto de las células de control como de las tratadas con CCCP. Realizamos nuestro análisis en 12 imágenes confocales, con aproximadamente 60 células por condición. Luego se determinó y cuantificó el estado morfológico de las mitocondrias en cada imagen. Las máscaras de segmentación obtenidas del modelo entrenado se esqueletizaron para permitir el análisis de la topología de cada mitocondria individual para este experimento. La longitud de la rama de las mitocondrias individuales se utilizó como parámetro para la clasificación. Las mitocondrias individuales se clasificaron en clases morfológicas por la siguiente regla. Específicamente, cualquier esqueleto mitocondrial con una longitud inferior a 1.500 nm se consideraba un punto, y las mitocondrias más largas se clasificaron en red o bastón. Si había al menos un cruce donde se cruzaban dos o más ramas, esto se definía como una red; De lo contrario, la mitocondria se clasificó como una varilla. En la Figura 3 se muestra un ejemplo de imagen con los esqueletos mitocondriales etiquetados con las clases de morfología.
La categorización morfológica mitocondrial en la Figura 4A muestra que es posible detectar cambios significativos cuando se aplica CCCP durante 2 h; esto se demuestra más claramente por el aumento de puntos para las células tratadas con CCCP.
La longitud media de la rama en la Figura 4B es otra vía para ilustrar cambios detectables y significativos en la morfología. Tanto los bastones como las redes se redujeron, como se esperaba, significativamente en relación con el control cuando las células se trataron con CCCP. También se esperaba un aumento significativo en la longitud media de las ramas de los puntos dada la hinchazón que sufren las mitocondrias cuando se exponen a CCCP.
Figura 1: Pipeline para la simulación de imágenes de microscopía de fluorescencia. La tubería incluye (i) generación de geometría 3D, (ii) emulación de emisores y fotocinética, (iii) convolución 3D PSF, (iv) adición de ruido y (v) binarización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Pasos del análisis basado en el aprendizaje automático de la morfología mitocondrial . (1) Las imágenes a segmentar se recortan primero en tamaños aceptables para el modelo de segmentación. (2) La segmentación basada en el aprendizaje profundo se aplica a los cultivos de imágenes. (3) Los cultivos de producción segmentados se cosen a su tamaño original. (4) Las segmentaciones montadas están esqueletizadas. (6) El análisis morfológico se realiza en base a la topología de las esqueletizaciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Esqueleto mitocondrial superpuesto en la salida de segmentación de imágenes de microscopía . (A) La salida de segmentación. (B) El esqueleto en línea recta (distancia euclidiana entre los puntos inicial y final de una rama) se superpone sobre la salida de segmentación. El código de colores del esqueleto representa la clase de mitocondrias. Las redes son rojas, las varillas son verdes y los puntos son de color púrpura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis de la morfología mitocondrial. (A) Una visión general del porcentaje relativo de diferentes categorías morfológicas basadas en la longitud mitocondrial total. (B) Comparación de la longitud media de la rama mitocondrial entre las condiciones experimentales y entre las categorías morfológicas. El eje x muestra las categorizaciones morfológicas, y el eje y muestra la longitud media de la rama mitocondrial en nanómetros (nm). La significación estadística en forma de valores p se muestra como * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 y **** p < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Caso de fallo de segmentación. Una alta densidad de mitocondrias es un escenario desafiante para el modelo de segmentación. El esqueleto coloreado muestra las mitocondrias individuales más largas detectadas en la imagen. Al pasar por las mediciones de longitud, estos escenarios se pueden detectar y trabajar para mejorar los resultados de segmentación utilizando el operador morfológico erode (adelgaza el esqueleto detectado). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Discutimos las precauciones relacionadas con los pasos críticos en el protocolo en los párrafos sobre "generación de geometría" y "parámetros del simulador". El párrafo titulado "aprendizaje por transferencia" analiza las modificaciones para un mayor rendimiento al adaptarse a múltiples microscopios. Los párrafos sobre "análisis de partículas" y "generación de otras estructuras subcelulares" se refieren a futuras aplicaciones de este método. El párrafo sobre la "diferencia de la verdad biológica" discute las diferentes razones por las cuales las simulaciones podrían diferir de los datos reales y si estas razones afectan nuestra aplicación. Finalmente, discutimos un escenario desafiante para nuestro método en el párrafo "estructuras densamente empaquetadas".
Generación de geometría
Para generar la geometría 3D de las mitocondrias, una estructura 2D simple creada a partir de curvas b-spline como esqueletos funciona bien para la creación del conjunto de datos sintéticos. Estas formas sintéticas emulan de cerca las formas de las mitocondrias observadas en cultivos celulares 2D. Sin embargo, en el caso del tejido 3D, como el tejido cardíaco, la forma y la disposición de las mitocondrias son bastante diferentes. En tales casos, el rendimiento del modelo de segmentación puede mejorar con la adición de direccionalidad en las imágenes simuladas.
Parámetros del simulador
Se debe tener precaución al establecer los parámetros del simulador para asegurarse de que coincidan con los de los datos en los que se ejecutará la inferencia, ya que de lo contrario esto puede conducir a un menor rendimiento en la segmentación. Uno de estos parámetros es el rango de relación señal-ruido (SNR). El rango de SNR de los datos que se van a probar debe coincidir con los valores del conjunto de datos simulado. Además, la PSF utilizada debe coincidir con la de los datos de prueba de destino. Por ejemplo, las imágenes entrenadas por modelos de una PSF confocal no deben usarse para probar imágenes de un microscopio epifluorescente. Otro parámetro a tener en cuenta es el uso de aumento adicional en los datos de prueba. Si se ha utilizado un aumento adicional en los datos de prueba, el simulador también debe configurarse adecuadamente.
Aprendizaje por transferencia
El aprendizaje por transferencia es el fenómeno de aprovechar un modelo aprendido entrenado en una tarea para su uso en otra tarea. Este fenómeno también es aplicable a nuestro problema en relación con diferentes tipos de datos de microscopio. Los pesos del modelo de segmentación (proporcionado con el código fuente) que se entrena en un tipo de datos de microscopía se pueden utilizar para inicializar un modelo de segmentación que se utilizará en otro tipo de datos de microscopio óptico. Esto nos permite entrenar en un subconjunto significativamente más pequeño del conjunto de datos de entrenamiento (3.000 imágenes en comparación con 10.000), reduciendo así los costos computacionales de la simulación.
Análisis de partículas
El análisis de partículas también se puede realizar en las máscaras segmentadas. Esto puede proporcionar información sobre el área y la curvatura, etc., de las mitocondrias individuales. Esta información también puede servir como métricas para la comparación cuantitativa de las mitocondrias (no utilizadas para este experimento). Por ejemplo, en la actualidad, definimos la morfología del punto utilizando un umbral basado en la longitud de las mitocondrias. Puede ser útil, en algunos casos, incorporar la elipticidad para separar mejor las mitocondrias pequeñas en forma de bastón de las mitocondrias puntuales o en forma de punto. Alternativamente, si ciertas condiciones biológicas hacen que las mitocondrias se enrosquen, entonces la cuantificación de la curvatura puede ser de interés para analizar la población mitocondrial.
Generación de otras estructuras subcelulares
La segmentación basada en la física de las estructuras subcelulares ha sido demostrada para mitocondrias y vesículas1. Aunque las vesículas exhiben diferentes formas, sus tamaños son más pequeños y aparecen como esferas simples cuando se observan a través de un microscopio de fluorescencia. Por lo tanto, la geometría de las vesículas se simula utilizando estructuras esféricas de un rango de diámetro apropiado. Esto implica un cambio en la función genera la geometría (cilindros en el caso de las mitocondrias y esferas en el caso de las vesículas) de las estructuras y los parámetros respectivos (paso 5.4 en la sección de protocolo). Geométricamente, el retículo endoplásmico y los microtúbulos también han sido simulados como estructuras tubulares17. El modelado del retículo endoplásmico con un diámetro de 150 nm y microtúbulos con un diámetro exterior promedio de 25 nm y un tubo hueco interno de 15 nm de diámetro proporciona aproximaciones de las formas de estas estructuras. Otro parámetro que variará para cada una de estas estructuras subcelulares es la densidad del fluoróforo. Esto se calcula en función de la distribución de la biomolécula a la que se unen los fluoróforos y la probabilidad de unión.
Diferencia con la verdad del terreno biológico
Los datos simulados utilizados para el entrenamiento supervisado por simulación del modelo de aprendizaje profundo difieren de los datos reales en muchos aspectos. (i) La ausencia de etiquetado no específico en los datos simulados difiere de los datos reales, ya que a menudo hay fluoróforos que flotan libremente en los datos reales. Esto provoca un valor de fondo promedio más alto en la imagen real. Esta diferencia se mitiga haciendo coincidir la SNR y estableciendo el valor de fondo de tal manera que coincida con los valores reales observados. (ii) El movimiento de las estructuras subcelulares y la fotocinética son dos fuentes de dinámica en el sistema. Las estructuras móviles en las células vivas (que se mueven en el rango de unos pocos milisegundos) causan desenfoque de movimiento. El tiempo de exposición se reduce durante la adquisición de datos reales para evitar el efecto borroso. Por otro lado, no simulamos timelapse y asumimos estructuras inmóviles; Esta suposición es válida cuando el tiempo de exposición en los datos reales es pequeño. Sin embargo, esta suposición puede producir un error en la salida si el tiempo de exposición de los datos reales es lo suficientemente grande como para introducir desenfoque de movimiento. La fotocinética, por otro lado, es del orden de nanosegundos a microsegundos y puede omitirse en la simulación, ya que los tiempos de exposición habituales de los experimentos son lo suficientemente largos (del orden de milisegundos) para promediar los efectos de la fotocinética. (iii) El ruido en las imágenes de microscopio tiene diferentes fuentes, y estas fuentes tienen diferentes funciones de densidad de probabilidad. En lugar de modelar estas fuentes individuales de ruido, lo aproximamos como un ruido gaussiano sobre un fondo constante. Esta diferencia no altera significativamente la distribución de datos para las condiciones de baja relación señal-fondo (en el rango de 2-4) y cuando se trata de la macro densidad de fluoróforos1. (iv) Los artefactos en las imágenes pueden surgir de aberraciones, derivas y borrones sistemáticos. Asumimos que el microscopio está bien alineado y que las regiones elegidas para el análisis en los datos reales carecen de estos artefactos. También existe la posibilidad de modelar algunos de estos artefactos en el PSF18,19,20.
Estructuras densamente empaquetadas
Las dificultades de no poder diferenciar las varillas superpuestas de las redes es un problema persistente en la segmentación de los datos de microscopía 2D. Un escenario extremadamente desafiante se presenta en la Figura 5, donde las mitocondrias están densamente empaquetadas, lo que conduce a resultados subóptimos en el modelo de segmentación y el siguiente análisis. A pesar de este desafío, el uso de operadores morfológicos en tales situaciones para adelgazar la esqueletización puede ayudar a romper estas redes excesivamente conectadas al tiempo que permite detectar cambios significativos en todas las categorías de morfología mitocondrial. Además, el uso de un microscopio confocal en lugar de un microscopio de campo amplio para obtener imágenes es un método para mitigar parcialmente este problema al eliminar la luz desenfocada. Además, en el futuro, sería útil realizar una segmentación 3D para diferenciar las mitocondrias que se cruzan (es decir, forman físicamente una red) de las mitocondrias en forma de bastón cuyas proyecciones en un solo plano se superponen entre sí.
La segmentación de aprendizaje profundo es una herramienta prometedora que ofrece ampliar las capacidades de análisis de los usuarios de microscopía, abriendo así la posibilidad de análisis automatizado de datos complejos y grandes conjuntos de datos cuantitativos, que anteriormente habrían sido inmanejables.
Disclosures
Los autores declaran que no hay conflictos de intereses relacionados con este artículo.
Acknowledgments
Los autores reconocen la discusión con Arif Ahmed Sekh. Zambarlal Bhujabal es reconocido por ayudar a construir las células H9c2 estables. Reconocemos la siguiente financiación: subvención inicial del ERC n.º 804233 (a K.A.), subvención del Proyecto de Investigador para la Renovación Científica n.º 325741 (a D.K.P.), subvención n.º HNF1449-19 de la Autoridad Regional de Salud del Norte de Noruega (Å.B.B.), y el proyecto de financiación temática de UiT VirtualStain con ID de proyecto Cristin 2061348 (D.K.P., Å.B.B., K.A. y A.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate | FALCON | 353043 | |
| Aqueous Glutaraldehyde EM Grade 25% | Electron Microscopy Sciences | 16200 | |
| Axio Vert.A1 | Zeiss | Brightfield microscope | |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| Computer | n/a | n/a | Must be running Linux/Windows Operating System having an NVIDIA GPU with at least 4GB of memory |
| Coverslips | VWR | 631-0150 | |
| DAPI (stain) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| DMEM | gibco | 11966-025 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Glass Slides (frosted edge) | epredia | AA00000112E01MNZ10 | |
| H9c2 mCherry-EGFP-OMP25 | In-house stable cell line derived from purchased cell line | ||
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51033557 | |
| LSM 800 | Zeiss | Confocal Microscope | |
| Mounting Media (Glass) | Thermo Fisher Scientific | P36980 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Thermo Fisher Scientific | J19943-K2 | |
| Plan-Apochromat 63x oil (M27) objective with an NA of 1.4 | Zeiss | 420782-9900-000 | |
| Sterile laminar flow hood | Labogene | SCANLAF MARS | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Vacusafe aspiration system | VACUUBRAND | 20727400 | |
| ZEN 2.6 | Zeiss |
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