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प्रतिबाधा-आधारित वास्तविक समय सेल विश्लेषण का उपयोग करके वायरल संक्रमण पर मानव गर्भनाल नस एंडोथेलियल कोशिकाओं में परिवर्तन की निगरानी

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/64887
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

Summary

वर्तमान अध्ययन एक वास्तविक समय सेल विश्लेषण (आरटीसीए) प्रणाली का उपयोग करके वायरल संक्रमण के दौरान मानव गर्भनाल शिरा एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचयूवीईसी) में परिवर्तन की निगरानी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।

Abstract

एंडोथेलियल कोशिकाएं सभी रक्त और लसीका वाहिकाओं की आंतरिक सतह को पंक्तिबद्ध करती हैं, जिससे रक्त या लसीका और उनके आसपास के ऊतकों के बीच तरल पदार्थ और विलेय विनिमय को विनियमित करने वाला एक अर्ध-पारगम्य अवरोध बनता है। एंडोथेलियल बाधा को पार करने के लिए वायरस की क्षमता एक महत्वपूर्ण तंत्र है जो मानव शरीर में वायरस के प्रसार की सुविधा प्रदान करता है। कई वायरस संक्रमण के दौरान एंडोथेलियल पारगम्यता को बदलने और/या एंडोथेलियल सेल बैरियर व्यवधान का कारण बनते हैं, जो संवहनी रिसाव का कारण बनता है। वर्तमान अध्ययन एक वास्तविक समय सेल विश्लेषण (आरटीसीए) प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, मानव गर्भनाल शिरा एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचयूवीईसी) के जीका वायरस (जेडआईकेवी) संक्रमण के दौरान एंडोथेलियल अखंडता और पारगम्यता परिवर्तनों की निगरानी के लिए एक वाणिज्यिक वास्तविक समय सेल विश्लेषक का उपयोग करता है। ZIKV संक्रमण से पहले और बाद में दर्ज किए गए प्रतिबाधा संकेतों का सेल इंडेक्स (CI) मूल्यों में अनुवाद किया गया और उनका विश्लेषण किया गया। आरटीसीए प्रोटोकॉल एक वायरल संक्रमण के दौरान सेल रूपात्मक परिवर्तनों के रूप में क्षणिक प्रभावों का पता लगाने की अनुमति देता है। यह परख अन्य प्रयोगात्मक सेटअपों में एचयूवीईसी की संवहनी अखंडता में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए भी उपयोगी हो सकता है।

Introduction

एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईसी) सभी रक्त और लसीका वाहिकाओं की आंतरिक सतह को पंक्तिबद्ध करती हैं। वे पालन, तंग अंतराल जंक्शनों से जुड़े हुए हैं, रक्त या लसीका और आसपास के ऊतकों 1,2 के बीच एक अर्ध-पारगम्य अवरोध पैदा करते हैं। बरकरार एंडोथेलियल सेल-सेल जंक्शन मैक्रोमोलेक्यूल्स, विलेय और तरल पदार्थ के परिवहन को विनियमित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, जो संबंधित ऊतकों और अंगों की शारीरिक गतिविधियों के लिए महत्वपूर्ण हैं3. एंडोथेलियल बाधा गतिशील है और विशिष्ट उत्तेजनाओं द्वारा संशोधित है4. एंडोथेलियल बाधा समारोह का विघटन या नुकसान वायरल संक्रमण 8,9,10,11 सहित कई बीमारियों के रोगजनन में तीव्र और पुरानी सूजन में रोग पैथोफिज़ियोलॉजी की एक बानगी है 5,6,7. फ्लेविविरस के लिए, यह पाया गया कि गैर-संरचनात्मक प्रोटीन एनएस 1 एंडोथेलियल पारगम्यता को बदल सकता है, उदाहरण के लिए, कैथेप्सिन एल, सियालिडेस, और एंडोग्लाइकोसिडेस हेपरिनेस9 की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति और सक्रियण के परिणामस्वरूप एंडोथेलियल ग्लाइकोकैलिक्स जैसी परत के विघटन के माध्यम से। रोग की स्थिति में, एंडोथेलियल मोनोलेयर की अखंडता प्रभावित होती है, और सेल-सेल जंक्शनों को बाधित किया जाता है, जिससे एंडोथेलियल चोट और शिथिलता12 हो सकती है और अंततः कई अंग प्रणालियों में व्यापक रोग संबंधी अभिव्यक्तियाँ 13,14 हो सकती हैं। ईसी के वायरल संक्रमण के परिणामस्वरूप सेल सिग्नलिंग रास्ते और सेलुलर जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल में परिवर्तन होता है, जो द्रव बाधा कार्यों को प्रभावित कर सकता है, ईसी के व्यवधान का कारण बन सकता है, और संवहनी रिसाव 10,15 को प्रेरित कर सकता है। ईसी के जीका वायरस (ZIKV) संक्रमण को संवहनी पारगम्यता में परिवर्तन का कारण बनता है और एंडोथेलियल बाधा शिथिलता का कारण बनता है, जिसके परिणामस्वरूप संवहनी रिसाव10,15 को बाधित करने के लिए पाया गया है। अध्ययनों से पता चला है कि ZIKV गंभीर जन्म दोषों से जुड़ा हुआ है; हालांकि, बहुत कुछ सटीक तंत्र जिसके द्वारा यह16,17 होता है के बारे में ज्ञात नहीं है. एक संक्रमण के दौरान एंडोथेलियल बाधा परिवर्तनों को समझना इसलिए रोग तंत्र को समझना महत्वपूर्ण है।

ईसीएस वर्तमान में विभिन्न शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं 18,19,20,21के लिए इन विट्रो संवहनी मॉडल प्रणाली में एक महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक के रूप में उपयोग किया जाता है। मानव गर्भनाल शिरा एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचयूवीईसी) का उपयोग इन विट्रो22,23,24,25में संवहनी एंडोथेलियम और संवहनी जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए प्राथमिक, गैर-अमर सेल प्रणाली के रूप में बड़े पैमाने पर किया गया है। HUVECs पहली बार मानव गर्भनाल26 की गर्भनाल की गर्भनाल से 1970 के दशक में इन विट्रो संस्कृति में के लिए अलग किया गया था. एचयूवीईसी में एक कोबलस्टोन जैसी आकृति विज्ञान होता है जिसे आसानी से प्रयोगशाला में प्रसार करने के लिए बनाया जाता है। संगम अवस्था में लंबे समय तक बनाए रखने के बाद अपरूपण तनाव के कारण, कोशिका आकार का बढ़ाव मनाया जाता है। एचयूवीईसी को वीबेल और पलाडे निकायों (डब्ल्यूपीबी), पिनोसाइटिक पुटिकाओं की उपस्थिति, नाभिक के पास स्थित फाइब्रिल की थोड़ी मात्रा, ट्यूबलर आकृतियों के साथ माइटोकॉन्ड्रिया की उपस्थिति की विशेषता हो सकती है जो शायद ही कभी असर दिखाते हैं, संघनित क्रोमैटिन के ठीक दानेदार पैटर्न के साथ एक दीर्घवृत्त नाभिक, और प्रत्येक नाभिक27 में मौजूद एक से तीन न्यूक्लियोली. हालांकि एचयूवीईसी कई रूपात्मक विशेषताओं को दिखाते हैं, एचयूवीईसी की पहचान अकेले ऑप्टिक परीक्षा द्वारा प्राप्त नहीं की जा सकती है। परख, जैसे संवहनी एंडोथेलियल (वीई) -कैडरिन के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना, आमतौर पर एचयूवीईसी 28,29,30,31में संवहनी अखंडता की निगरानी के लिए उपयोग किया जाता है।

यह अध्ययन एचयूवीईसी के संक्रमण के वास्तविक समय सेल विश्लेषण (आरटीसीए) प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। आरटीसीए प्रणाली माइक्रोइलेक्ट्रोड युक्त विशेष सोने-लेपित प्लेटों का उपयोग करती है जो सेल लगाव के लिए एक प्रवाहकीय सतह प्रदान करती हैं। जब कोशिकाएं माइक्रोइलेक्ट्रोड सतह से जुड़ती हैं, तो एक अवरोध जो माइक्रोइलेक्ट्रोड के माध्यम से इलेक्ट्रॉन प्रवाह को बाधित करता है, बनता है। माइक्रोइलेक्ट्रोड द्वारा उत्पन्न प्रतिबाधा का मापन सेल संलग्नक, प्रसार और प्रवास32 सहित कुछ सेलुलर प्रक्रियाओं पर जानकारी प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। रिपोर्ट परख एक प्रतिबाधा आधारित सेलुलर परख है कि, एक वास्तविक समय सेल विश्लेषक के साथ मिलकर, एक noninvasive और लेबल मुक्त तरीके से जीवित सेल प्रसार, आकृति विज्ञान परिवर्तन (जैसे सेल सिकुड़ना) और सेल लगाव की गुणवत्ता के निरंतर माप प्रदान करता है. इस अध्ययन में, रीयल-टाइम सेल विश्लेषक का उपयोग ZIKV संक्रमण के दौरान HUVECs की एंडोथेलियल अखंडता और रूपात्मक परिवर्तनों की निगरानी के लिए किया जाता है। संक्षेप में, उपकरण एक संस्कृति माध्यम (विद्युत प्रवाहकीय समाधान) की उपस्थिति में विशेष सोने-माइक्रोइलेक्ट्रोड-लेपित माइक्रोटिटर प्लेटों में प्रेषित इलेक्ट्रॉन प्रवाह को मापता है। सेल पालन या सेल संख्या और आकृति विज्ञान में परिवर्तन इलेक्ट्रॉन प्रवाह को परेशान और प्रतिबाधा विविधताओं का कारण बनता है जिसे उपकरण (पूरक चित्रा 1) द्वारा कब्जा किया जा सकता है। ZIKV संक्रमण से पहले और बाद में HUVEC विकास, प्रसार और पालन के बीच का अंतर वास्तविक समय में एक विद्युत प्रतिबाधा संकेत द्वारा दर्ज किया जाता है और फिर सेल इंडेक्स (CI) मान में अनुवादित किया जाता है। पूर्व-संक्रमण से सीआई मान का उपयोग सीआई मूल्य सामान्यीकरण के लिए आधार रेखा के रूप में किया जाता है। सीआई मूल्यों में परिवर्तन संक्रमण33 पर सेलुलर रूपात्मक परिवर्तन या सेल पालन हानि को दर्शाते हैं। अध्ययन के परिणाम बताते हैं कि आरटीसीए प्रोटोकॉल एक समापन बिंदु परख की तुलना में वायरल संक्रमण के दौरान क्षणिक प्रभाव या सेल रूपात्मक परिवर्तनों का पता लगाने की अनुमति देता है, जैसे कि वीई-कैडरिन का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधलापन। RTCA विधि अन्य वायरस द्वारा संक्रमण पर HUVEC संवहनी अखंडता परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी हो सकता है.

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Protocol

1. सेल की तैयारी

  1. एचयूवीईसी की तैयारी
    1. 75 सेमी2 में 7.5 x 105 एचयूवीईसी कोशिकाओं/एमएल को बढ़ाएं (20 माइक्रोग्राम/एमएल कोलेजन प्रकार 1 के साथ लेपित) सेल कल्चर फ्लास्क जिसमें एंडोथेलियल सेल माध्यम (ईसीएम) के 12 एमएल होते हैं, जो 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 0.01% एंडोथेलियल सेल ग्रोथ सप्लीमेंट (ईसीजीएस) के साथ पूरक होते हैं जिसमें एचयूवीईसी की संस्कृति के लिए आवश्यक वृद्धि कारक, हार्मोन और प्रोटीन होते हैं, और 0.01% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / 5% सीओ2 (चित्रा 1) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते हैं।

2. RTCA प्रयोगको सेटअप

  1. रोकनेवाला सत्यापन RTCA पर चलता है
    1. एप्लिकेशन लॉन्च करने के लिए डेस्कटॉप में RTCA सॉफ़्टवेयर आइकन पर डबल-क्लिक करें। एक लॉगिन विंडो दिखाई देगी, लॉगिन करने के लिए उपयोगकर्ता नाम और पासवर्ड टाइप करें।
    2. सेल कल्चर इनक्यूबेटर में स्थित आरटीसीए स्टेशन में आवक का सामना करना पड़ A1 अच्छी तरह से के साथ एक 96 अच्छी तरह से RTCA रोकनेवाला प्लेट रखें.
    3. RTCA सॉफ़्टवेयर के Exp नोट्स टैब में, प्रयोग का नाम, डिवाइस SN और डिवाइस प्रकार (QC प्लेट) टाइप करें।
    4. RTCA सॉफ्टवेयर के सेल टैब के तहत लेआउट टैब में, सभी कुओं को हाइलाइट करें और हाइलाइट किए गए कुओं पर राइट-क्लिक करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सभी कुएं चालू हैं (धूसर हो गए)।
    5. RTCA सॉफ़्टवेयर के शेड्यूल टैब में, Step_1 क्लिक करें. स्वीप दर्ज करें: 10, और अंतराल: 30 एस। लागू करें पर क्लिक करें. सत्यापन रन शुरू करने के लिए सॉफ़्टवेयर के ऊपरी बाएँ कोने में प्रारंभ/जारी रखें पर क्लिक करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि आरटीसीए स्टेशन के लिए कुओं का कनेक्शन "प्लेट स्कैन किया गया" देखकर ठीक है। कनेक्शन ठीक है" पृष्ठ के निचले भाग में।
  2. रोकनेवाला सत्यापन डेटा विश्लेषण के लिए चलता है
    1. सेल इंडेक्स टैब में, रन पूरा होने पर डेटा की जांच करें। सभी CI मान 0.063 से कम होने चाहिए.
    2. सेल इंडेक्स टैब के निचले हिस्से में, कच्चे स्कैन डेटा की जांच करें। कच्चे स्कैन डेटा को 40.0 ± 2.0 (पंक्तियाँ A और H), 67.5 ± 2.5 (पंक्तियाँ B और G), 93.6 ± 2.9 (पंक्तियाँ C और F), और 117.6 ± 3.2 (पंक्तियाँ D और E) के दोहराए गए मान पैटर्न प्रदर्शित करने चाहिए।
    3. सत्यापन चलाने को रोकने के लिए, प्लेट > रिलीज़ प्लेट पर क्लिक करें। 96-वेल RTCA रेझिस्टर प्लेट अब RTCA स्टेशन से हटाने के लिए तैयार है।
  3. RTCA वर पृष्ठभाग वाचन मिळणे
    1. कोलेजन प्रकार 1-लेपित विशेष सोने-माइक्रोइलेक्ट्रोड प्लेट (20 माइक्रोग्राम / एमएल कोलेजन प्रकार 1 के साथ लेपित) को हांक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस; सोडियम बाइकार्बोनेट के साथ, कैल्शियम क्लोराइड और मैग्नीशियम सल्फेट के बिना) 2x के 60 माइक्रोन / कुएं के साथ धोएं।
    2. शेष HBSS त्यागें और ईसीएम के 50 μL/कुएं जोड़ें. सेल कल्चर इनक्यूबेटर में स्थित आरटीसीए स्टेशन में आवक का सामना करना पड़ A1 अच्छी तरह से के साथ ईसीएम युक्त विशेष सोने microelectrode प्लेट रखें.
    3. RTCA सॉफ़्टवेयर के Exp नोट्स टैब में, प्रयोग का नाम, डिवाइस SN और डिवाइस प्रकार (96-वेल प्रारूप) टाइप करें।
    4. RTCA सॉफ्टवेयर के सेल टैब के तहत लेआउट टैब में, उपयोग किया जाएगा कि कुओं पर प्रकाश डाला और सभी कुओं पर राइट क्लिक करें सुनिश्चित करें कि सभी कुओं पर कर रहे हैं (धूसर बाहर) पर प्रकाश डाला प्रकाश डाला.
    5. RTCA सॉफ़्टवेयर के शेड्यूल टैब में, Step_1 क्लिक करें, और पृष्ठभूमि रीडिंग प्राप्त करने के लिए सॉफ़्टवेयर के ऊपरी बाएँ कोने में प्रारंभ/जारी रखें पर क्लिक करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि कुओं का कनेक्शन "प्लेट स्कैन किया गया" देखकर सही है। कनेक्शन ठीक है" पृष्ठ के निचले भाग में।
    6. एक बार पृष्ठभूमि पढ़ने प्राप्त हो जाने के बाद, विशेष गोल्ड-माइक्रोइलेक्ट्रोड प्लेट अब सेल सीडिंग के लिए तैयार है और आरटीसीए स्टेशन से हटाने के लिए तैयार है।
  4. विशेष गोल्ड-माइक्रोइलेक्ट्रोड प्लेट में HUVEC तैयारी
    1. विशेष गोल्ड-माइक्रोइलेक्ट्रोड प्लेट में HUVECs को 50 μL/अच्छी तरह से वातानुकूलित माध्यम के साथ, 1 x 104 कोशिकाओं/अच्छी तरह से (वातानुकूलित माध्यम: ECM 10% FBS, 0.01% ECGS, और 0.01% P/S के साथ पूरक)। प्लेट को आरटीसीए स्टेशन में वापस रखें, जिसमें ए 1 अच्छी तरह से रात भर इनक्यूबेशन के लिए आवक का सामना करना पड़ रहा है, सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर है।
      नोट: एक सेल गिनती एक hemocytometer का उपयोग कर दो के एक कमजोर पड़ने कारक के साथ सेल निलंबन पर प्रदर्शन किया गया था.
    2. शेड्यूल टैब में, ऊपरी बाएँ कोने में कोई चरण जोड़ें पर क्लिक करें. Step_2 पर क्लिक करें और स्वीप बदलें: 601, और अंतराल: 2 मिनट। लागू करें पर क्लिक करें। Step_2 पर क्लिक करें और सॉफ्टवेयर के ऊपरी बाएँ कोने में प्रारंभ/जारी रखें पर क्लिक करें।
    3. इनक्यूबेशन के 20 घंटे के बाद और जब वेल ग्राफ टैब में सीआई मान एक पठार दिखाते हैं, तो प्लेट संक्रमण के लिए तैयार होती है। इसमेंशेड्यूल RTCA सॉफ़्टवेयर के टैब में, क्लिक करेंनिरस्त चरण.
    4. विशेष गोल्ड-माइक्रोइलेक्ट्रोड प्लेट अब बाद के चरणों के लिए आरटीसीए स्टेशन से हटाने के लिए तैयार है।

3. एचयूवीईसी में वायरल संक्रमण

  1. वायरस कमजोर पड़ने
    1. ZIKV स्टॉक कल्चर को -80 °C पर रखा जाता है। इस अध्ययन के लिए, क्रायोजेनिक शीशियों में रखे वायरस स्टॉक को हटा दें और 0.1 और 1 के संक्रमण (एमओआई) की बहुलता प्राप्त करने के लिए 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में सीरम मुक्त ईसीएम के साथ जेडआईकेवी स्टॉक को पतला करें।
      नोट: ZIKV स्टॉक पहले वेरो कोशिकाओं में प्रसार प्रदर्शन और ZIKV सतह पर तैरनेवाला34 की कटाई करके तैयार किया गया था।
  2. सेल मोनोलेयर का संक्रमण
    1. प्रत्येक कुएं से वातानुकूलित माध्यम (10% FBS, 0.01% ECGS, और 0.01% P/S के साथ पूरक ECM) निकालें और त्यागें। HBSS 2x के 60 माइक्रोन के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से कुल्ला। कुएं के किनारे की सहायता से एचबीएसएस डालें; सेल मोनोलेयर को शूट न करें।
    2. उच्चतम से सबसे कम कमजोर पड़ने से काम करते हुए, सीरम मुक्त ईसीएम में प्रत्येक पतला वायरस नमूने के 40 माइक्रोन को कुएं में जोड़ें। प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए अच्छी तरह से तीन गुना और संक्रमण के बिना छह कुओं को बनाए रखने (नकारात्मक नियंत्रण और सकारात्मक नियंत्रण थ्रोम्बिन). सेल मोनोलेयर को शूट न करें; इसके बजाय, कुएं के किनारे की सहायता से पतला वायरस जोड़ें। प्रत्येक सम्मिलन के लिए एक ताजा पिपेट टिप का उपयोग करें।
      नोट: थ्रोम्बिन को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में चुना गया था क्योंकि यह एचयूवीईसी की एंडोथेलियल पारगम्यता को तेजी से बढ़ा सकता है।
    3. वायरस सोखना की अनुमति देने के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में प्लेट को इनक्यूबेट करें। सेल मोनोलेयर में वायरस सोखना की अनुमति देने के लिए हर 15 मिनट में प्लेट को 5x घुमाएं।
  3. ओवरले सेल संस्कृति माध्यम का जोड़
    1. इनक्यूबेशन के 1 घंटे के बाद, निकालें और उच्चतम करने के लिए सबसे कम एकाग्रता से वायरस निलंबन त्यागें.
    2. एचबीएसएस 2x के 60 माइक्रोन के साथ संक्रमित कोशिकाओं को धोएं। 2% FBS के साथ पूरक ECM के साथ अच्छी तरह से ओवरले. सकारात्मक नियंत्रण कुओं के लिए, 2% एफबीएस के साथ पूरक ईसीएम के साथ थ्रोम्बिन को 20 यू/एमएल तक पतला करें, और थ्रोम्बिन युक्त ईसीएम माध्यम के साथ कुओं को ओवरले करें। सेल मोनोलेयर को शूट न करें; इसके बजाय, कुएं के किनारे की सहायता से ओवरले मीडिया जोड़ें।
  4. आरटीसीए स्टेशन में संक्रमित विशेष गोल्ड-माइक्रोइलेक्ट्रोड प्लेट का प्लेसमेंट
    1. शेड्यूल टैब में, ऊपरी बाएँ कोने में कोई चरण जोड़ें पर क्लिक करें. Step_3 पर क्लिक करें और स्वीप बदलें: 3,601 और अंतराल: 2 मिनट। लागू करें पर क्लिक करें।
    2. दिखाई देने वाली पॉप-अप विंडो में ठीक क्लिक करें। सेल कल्चर इनक्यूबेटर में स्थित आरटीसीए स्टेशन में A1 अच्छी तरह से आवक का सामना करना पड़ के साथ संक्रमित विशेष सोने microelectrode प्लेट रखें.
    3. Step_3 पर क्लिक करें और सॉफ्टवेयर के ऊपरी बाएँ कोने में प्रारंभ/जारी रखें पर क्लिक करें।

4. डेटा विश्लेषण और निर्यात डेटा

  1. प्रत्येक कुएं की प्रयोगात्मक जानकारी का जोड़
    1. लेआउट टैब में, सेल टैब (चित्र 2A) पर क्लिक करें। लक्ष्य सेल जानकारी दर्ज करें और प्रत्येक अच्छी तरह से के लिए अच्छी तरह से प्रकार निर्धारित करने के लिए, अच्छी तरह से हाइलाइट करें और सॉफ्टवेयर के तल पर लक्ष्य सेल नाम, संख्या और रंग में टाइप करें। लागू करें (चित्रा 2 बी) पर क्लिक करें।
    2. कक्ष टैब में प्रत्येक कुएँ के लिए अच्छी तरह से प्रकार का चयन करने और निर्धारित करने के लिए, कुएँ को हाइलाइट करें, अच्छी तरह से प्रकार (नमूना, सकारात्मक नियंत्रण, या नकारात्मक नियंत्रण) का चयन करें, और सेट करें क्लिक करें.
    3. लेआउट टैब में, उपचार टैब (चित्रा 2C) पर क्लिक करें. उपचार की जानकारी दर्ज करने के लिए, कुएं को हाइलाइट करें और उपचार के नाम, उपचार की एकाग्रता, इकाई और रंग टाइप करें। लागू करें (चित्रा 2 डी) पर क्लिक करें।
    4. उपचार टैब पर प्रत्येक कुएं के लिए अच्छी तरह से प्रकार का चयन करने और निर्धारित करने के लिए, अच्छी तरह से हाइलाइट करें, अच्छी तरह से प्रकार (नमूना, सकारात्मक नियंत्रण, या नकारात्मक नियंत्रण) का चयन करें, और सेट क्लिक करें।
      नोट: प्रत्येक चयन के लिए, एक ही समय में कई कुओं को हाइलाइट किया जा सकता है।
  2. सीआई मूल्य का सामान्यीकरण
    1. डेटा विश्लेषण टैब के दाईं ओर राइट-क्लिक करें और वाई अक्ष ड्रॉप-डाउन बॉक्स (चित्रा 3 ए) से सामान्यीकृत सेल इंडेक्स का चयन करें। तल पर एक्स अक्ष अनुभाग में, अंतिम मापा समय बिंदु के रूप में सामान्यीकृत समय का चयन करें जहां संक्रमण के लिए विशेष गोल्ड-माइक्रोइलेक्ट्रोड प्लेट को हटा दिया गया था (चित्र 3बी)।
      नोट: सॉफ्टवेयर द्वारा किए गए सामान्यीकरण प्रक्रिया अच्छी तरह से बोने और लगाव में अंतर के कारण अधिकांश परिवर्तनशीलता को हटा देती है, जब तक कि चुना गया सामान्यीकरण बिंदु वायरस और/या उपचार के अलावा से पहले है। इसलिए, इष्टतम सामान्यीकरण समय बिंदु वायरस और/या उपचार के अतिरिक्त होने से पहले अंतिम समय बिंदु होना चाहिए। सामान्यीकरण के लिए समय बिंदु को Step_2 के तहत शेड्यूल टैब में चेक किया जा सकता है। कुल समय संकेत सामान्य(चित्रा 3C) के लिए समय बिंदु है.
  3. RTCA सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके प्राप्त डेटा प्लॉटिंग करना
    1. डेटा विश्लेषण टैब में, कुओं को हाइलाइट करके और जोड़ें पर क्लिक करके ग्राफ में जोड़े जाने वाले कुओं << चयन करें। समय ग्राफ के खिलाफ सामान्यीकृत सेल इंडेक्स अब कॉपी और निर्यात करने के लिए तैयार है। Average चेकबॉक्स पर सही का निशान लगाना सुनिश्चित करें.
  4. RTCA सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा निर्यात करना
    1. RTCA सॉफ़्टवेयर के ऊपरी बाएँ कोने में, प्लेट > निर्यात प्रयोग जानकारी पर क्लिक करें.... निर्यात किए जाने वाले डेटा का चयन करने के लिए बॉक्स को चेक करें. ओके पर क्लिक करें।
      नोट: कच्चे डेटा (कच्चे सीआई मान) निर्यात किया जा सकता है जब सेल इंडेक्स > सभी टिक किया जाता है।
    2. निर्यात फ़ाइल को सहेजने के लिए फ़ोल्डर का चयन करें। सेव करें पर क्लिक करें. एक पॉप-अप विंडो प्रयोगात्मक जानकारी के निर्यात का संकेत देगी। एक बार निर्यात किया जाता है, एक और विंडो निर्यात प्रयोग जानकारी को इंगित करने के लिए तैयार है दिखाई देगा.

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Representative Results

ZIKV संक्रमण से पहले, एक विशेष सोने-माइक्रोइलेक्ट्रोड लेपित माइक्रोटिटर प्लेट पर सुसंस्कृत HUVEC मोनोलेयर के लिए दर्ज CI 8 से ऊपर था, जो मजबूत पालन गुणों का सुझाव देता है। 8 से कम सीआई इंडेक्स वाले प्लेट्स या कुओं को त्याग दिया जाना चाहिए। HUVECs तब 0.1 और 1 के MOI पर ZIKV से संक्रमित थे, और सेल प्रतिबाधा 7 दिनों के लिए दर्ज की गई थी। नकारात्मक संक्रमण नियंत्रण (ब्राउन लाइन; चित्रा 4)। 6 (नीली रेखा) के एमओआई पर ZIKV P740-1 की उच्च खुराक से संक्रमित HUVECs के लिए, CI मान 11 HPI पर जल्दी ही गिरना शुरू हो गया। 24 एचपीआई पर, सामान्यीकृत सीआई मूल्य (5, 7, 0.949) में 0.949% और 0.929% की गिरावट आई जब ईसी क्रमशः 0.1 और 1 के एमओआई पर जेडआईकेवी से संक्रमित थे। सामान्यीकृत सीआई मूल्य में 50% की कमी क्रमशः 96 एचपीआई और 66.75 एचपीआई पर जेडआईकेवी संक्रमण पर 0.1 और 1 एचपीआई दर्ज की गई थी। सामान्यीकृत सीआई मूल्य 107 एचपीआई पर अपने निम्नतम बिंदु पर पहुंच गया, जहां क्रमशः 0.1 और 1 के एमओआई पर जेडआईकेवी संक्रमण पर 51% और 60% 0.4915, 0.3984 की कमी आई थी। सामान्यीकृत सीआई मूल्य में 107 एचपीआई से 168 एचपीआई (0.5128, 0.4571) पर प्रयोग के अंत तक 4% और 13% की वृद्धि पाई गई। काली रेखा एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल थ्रोम्बिन के प्रभाव को दर्शाता है, जहां सीआई मान पूरे प्रयोग में कम रहे, तंग जंक्शनों के विघटन की नकल करते हुए, और प्रेरित संवहनी रिसाव35.

Figure 1
चित्रा 1: मानव गर्भनाल शिरा एंडोथेलियल कोशिकाएं (एचयूवीईसी)। संगम की दर को देखने के लिए आंकड़ा 40x आवर्धन में है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: RTCA सॉफ़्टवेयर पर लेआउट टैब के अंतर्गत सेल और उपचार टैब के स्क्रीनशॉट। (ए) लेआउट टैब में, सेल टैब पर क्लिक करें। (बी) लक्ष्य सेल जानकारी दर्ज करने और प्रत्येक अच्छी तरह से के लिए अच्छी तरह से प्रकार निर्धारित करने के लिए, अच्छी तरह से हाइलाइट करें और सॉफ्टवेयर के तल पर लक्ष्य सेल का नाम, संख्या और रंग टाइप करें। लागू करें पर क्लिक करें. (सी) उपचार टैब के तहत लेआउट टैब पर क्लिक करें। (डी) उपचार की जानकारी दर्ज करने के लिए, अच्छी तरह से हाइलाइट करें और उपचार के नाम, उपचार की एकाग्रता, इकाई और रंग में टाइप करें। लागू करें पर क्लिक करें. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सेल इंडेक्स सामान्यीकरण के लिए आरटीसीए सॉफ्टवेयर में डेटा विश्लेषण टैब के स्क्रीनशॉट। (A) Y अक्ष ड्रॉप-डाउन बॉक्स में, सामान्यीकृत सेल अनुक्रमणिकाका का चयन करें. (B) X अक्ष अनुभाग में, सामान्यीकरण समय का चयन करें। (C) RTCA सॉफ़्टवेयर में शेड्यूल टैब का स्क्रीनशॉट। सामान्यीकरण समय Step_2 कुल समय पर इंगित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: मानव गर्भनाल शिरा एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचयूवीईसी) में जीका वायरस (जेडआईकेवी) संक्रमण के सामान्यीकृत सेल इंडेक्स बनाम समय प्लॉट। विशेष गोल्ड-माइक्रोइलेक्ट्रोड प्लेट को 20 μg/mL कोलेजन टाइप 1 के साथ लेपित किया गया था। एचयूवीईसी को 1.0 x 104 कोशिकाओं/कुएं के घनत्व पर वरीयता दी गई थी। ZIKV P6-740 (MOI: 0.1, 1) का उपयोग संक्रमण के लिए किया गया था। हल्का नीला: ZIKV P6-740 (MOI: 0.1); नीला: ZIKV P6-740 (MOI: 1); काला: सकारात्मक नियंत्रण के रूप में थ्रोम्बिन (20 यू / ब्राउन: नकारात्मक संक्रमण नियंत्रण। प्रत्येक डेटा बिंदु औसत को दर्शाता है और तीन प्रतियों में विश्लेषण किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 1: विद्युत बायोसेंसर प्रतिबाधा आधारित आरटीसीए में प्रयुक्त तकनीक पर योजनाबद्ध ड्राइंग। अच्छी तरह से प्लेट का एक साइड व्यू; कुओं के तल पर सोना चढ़ाया नकारात्मक और सकारात्मक टर्मिनल हैं। जैसा कि उपकरण माइक्रोवेल में सीआई को मापता है जिसमें संस्कृति मीडिया होता है जो बिजली का संचालन करने की अनुमति देता है, इलेक्ट्रॉन नकारात्मक से सकारात्मक टर्मिनल तक बहता है। जब यह एक रिक्त नियंत्रण होता है, तो इलेक्ट्रॉन प्रवाह सुचारू होता है, इसलिए कोई प्रतिबाधा दर्ज नहीं की जाती है। जब कोशिकाओं को वरीयता दी जाती है, और जैसे-जैसे अधिक से अधिक कोशिकाएं कुएं के नीचे से जुड़ती हैं, इलेक्ट्रॉन प्रवाह में प्रतिबाधा मौजूद होती है और कंप्यूटर द्वारा दर्ज की जाती है। इस प्रतिबाधा मूल्य का उपयोग करते हुए, उपकरण इसे सीआई मान में परिवर्तित करता है, जो कुएं के नीचे (आसंजन) से जुड़ी कोशिकाओं की संख्या को दर्शाता है। BioRender के साथ बनाया गया। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

अनुमेय कोशिकाओं में साइटोसाइडल वायरल संक्रमण आमतौर पर सेल आकृति विज्ञान और जैवसंश्लेषण36 में पर्याप्त परिवर्तन से जुड़ा होता है। वायरस प्रेरित सेलुलर रूपात्मक परिवर्तन, जैसे सेल सिकुड़ना, सेल इज़ाफ़ा, और / या सिंकिटिया गठन, को साइटोपैथिक प्रभाव (सीपीई) के रूप में भी जाना जाता है, जो कुछ वायरलसंक्रमणों की विशेषता है। ईसी में, सीपीई को कोशिकाओं के विनाश और प्रत्येक ईसी के बीच तंग जंक्शनों के टूटने के रूप में वर्णित किया गया था, इसलिए एंडोथेलियल बाधा38,39 के टूटने का कारण बनता है। एचयूवीईसी में सीपीई को मोनोलेयर सेल डिटैचमेंट और टिशू कल्चर पोत से तैरने के रूप में वर्णित किया जा सकता है। संक्रमित सेल रूपात्मक परिवर्तन, जैसे कि टुकड़ी और पक्षपाती कोशिकाओं के फ्लोटिंग, आरटीसीए विधि का उपयोग करके लगातार पता लगाया जा सकता है। यह तकनीक विद्युत प्रतिबाधा पर आधारित है, जो हर कुछ सेकंड तक वास्तविक समय में कोशिकाओं की निगरानी की अनुमति देती है। यह सेल प्रसार, रूपात्मक परिवर्तनों की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है, और एचयूवीईसी के मामले में, इसका उपयोग उत्तेजना पर एंडोथेलियल अखंडता और सेल बाधा फ़ंक्शन40 में परिवर्तन की निगरानी के लिए किया जा सकता है।

इस अध्ययन में, महत्वपूर्ण कदम प्रयोग की स्थापना है, जहां 96 अच्छी तरह से रोकनेवाला प्लेट का उपयोग किया जाता है. यह सुनिश्चित करने के लिए है कि विश्लेषक के सभी कनेक्शन प्लेट से अच्छी तरह से जुड़े हुए हैं। आरटीसीए में, मापा प्रतिबाधा मूल्य सेल संख्या, आसंजन डिग्री, सेलुलर आकारिकी, और सेल व्यवहार्यता41 में अंतर अंतर करने के लिए एक सीआई मूल्य के रूप में परिवर्तित किया जाता है. आरटीसीए विश्लेषक द्वारा दर्ज प्रतिबाधा में गिरावट, जो सीआई मूल्य में एक बूंद में अनुवाद करता है, एक कम सेल संख्या, कमजोर आसंजन डिग्री, और सेलुलर आकारिकी42 में पर्याप्त परिवर्तन का सुझाव देता है. इसलिए, आरटीसीए प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले सेल लाइनों और इष्टतम सेल नंबरों की उपयुक्तता का परीक्षण करना भी महत्वपूर्ण है। यह निर्धारित करना महत्वपूर्ण है कि आरटीसीए प्रणाली का उपयोग करके कोशिकाओं पर परीक्षण के निष्पादन से पहले वांछित सीआई सूचकांक प्राप्त किया जा सकता है या नहीं। इसके अतिरिक्त, यह यह निर्धारित करने में भी मदद करता है कि आरटीसीए प्रणाली चयनित सेल प्रकारों के सेल विकास और सेल मृत्यु प्रोफाइल की निगरानी के लिए उपयुक्त है या नहीं। हमारे अध्ययन में, सीआई मूल्यों में भारी गिरावट देखी गई जब एचयूवीईसी 0.1 और 1 के एमओआई पर जेडआईकेवी पी 6-740 से संक्रमित थे। सीआई मूल्य में भारी गिरावट, इसलिए यह सुझाव देते हुए कि एचयूवीईसी सेलुलर रूपात्मक परिवर्तन संक्रमण के बाद हुए, और इससे तंग जंक्शनों और ईसी संवहनी अखंडता में व्यवधान हुआ।

परंपरागत रूप से, इन विट्रो में कोशिकाओं के वायरल संक्रमण के कारण सीपीई का अनुमान संक्रमित कोशिकाओं के सूक्ष्म अवलोकन के आधार पर लगाया जाता है। इसके अतिरिक्त, कुछ अन्य परख, जैसे पट्टिका परख, सीपीई (जैसे सेल डिटैचमेंट) के दृश्य की अनुमति देते हैं और सीपीई42 की सीमा को मापने के लिए उपयोग किए जाते हैं। हालांकि, इन विधियों की सीमाएं हैं कि वे केवल सेलुलर रूपात्मक परिवर्तनों (समापन बिंदु परख) के असतत समय बिंदुओं पर जानकारी प्रदान करते हैं। अन्य परख, जैसे कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना, रूपात्मकपरिवर्तनों की कल्पना करने के लिए फ्लोरोफोर के साथ टैग किए गए विशिष्ट एंटीबॉडी के संयोजन पर भरोसा करते हैं। यद्यपि इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख में एक व्यापक क्षमता है जो किसी भी ऊतक या सेल प्रकार में कई घटकों के दृश्य की अनुमति देती है, यह तकनीक वायरल संक्रमण के दौरान वास्तविक समय की निगरानी और पहचान की अनुमति नहीं देती है। इसके विपरीत, आरटीसीए प्रणाली वायरल संक्रमण के दौरान वास्तविक समय सेल रूपात्मक परिवर्तनों को रिकॉर्ड करती है, जिससे क्षणिक प्रभावों को पकड़ने की अनुमति मिलती है, जैसे कि क्षणिक संवहनी रिसाव, जिसे समापन बिंदु परख द्वारा याद किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एंडपॉइंट परख 60 एचपीआई, 80 एचपीआई और 100 एचपीआई के रूप में डेटा और रूपात्मक परिवर्तनों का पता लगाने में विफल हो जाएगा। आरटीसीए के अलावा, ट्रांस-एपिथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस (टीईईआर) माप सेल-टू-सेल इंटरैक्शन की निगरानी के लिए आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली एक और विधि है, जहां सेल मोनोलेयर में विद्युत प्रतिरोध मापा जाता है। हालांकि, टीईईआर को लाइव सेल गतिविधियों की निगरानी के लिए समय के साथ कई बार-बार माप की आवश्यकता होती है और अक्सर एक समय में कम संख्या में नमूने या कुओं पर प्रदर्शन किया जाता है। नतीजतन, टीईईआर में आमतौर पर आरटीसीए की तुलना में कम थ्रूपुट होता है, जो एक साथ 96 कुओं तक चल सकताहै।

इसके लाभों के बावजूद, RTCA प्रणाली की कई सीमाएँ हैं। आरटीसीए प्रणाली की मुख्य सीमा महंगे उपकरण और उपभोग्य सामग्रियों की है। आरटीसीए प्रणाली द्वारा उपयोग की जाने वाली विशेष गोल्ड-माइक्रोइलेक्ट्रोड प्लेटें अपेक्षाकृत महंगी, एकल-उपयोग और डिस्पोजेबल45 हैं। इसके अतिरिक्त, सेल रूपात्मक परिवर्तनों को एक रिकॉर्डर (कैमरा) पर imaged और कब्जा नहीं किया जा सकता है, न ही परख वायरस एंटीजन के संचय या सेल सतह प्रोटीन में परिवर्तन, जैसे HUVECs46 में VE-cadherin पर कब्जा कर सकते हैं। नतीजतन, आरटीसीए सेल रूपात्मक परिवर्तनों की कल्पना नहीं कर सकता है जो रोग रोगजनन को स्पष्ट करने के लिए अतिरिक्त उपयोगी जानकारी प्रदान करेगा। परख या मॉडल स्थापना के दौरान, अतिरिक्त धुंधला सत्यापन, जैसे एचयूवीईसी के लिए वीई-कैडरिन धुंधला हो जाना, प्राप्त मापों को मान्य करने के लिए उपयोगी होगा। इसके अलावा, आरटीसीए प्रणाली पक्षपाती सेल लाइनों तक सीमित है, क्योंकि इसे दर्ज किए जाने वाले प्रतिबाधा के लिए कुओं के तल पर कोशिकाओं के लगाव की आवश्यकता होती है। इसलिए, रिपोर्ट परख गैर पक्षपाती सेल लाइनों46 के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता.

अंत में, हमने 96-वेल प्रारूप में ZIKV संक्रमण पर एंडोथेलियल कोशिकाओं में परिवर्तन की निगरानी के लिए RTCA उपकरण का उपयोग करके प्रोटोकॉल का विश्लेषण करने वाले एक वास्तविक समय सेल का वर्णन किया है। यह विधि पारंपरिक समापन बिंदु परख पर कई फायदे प्रदान करती है, जिसमें यह वास्तविक समय में सेलुलर रूपात्मक परिवर्तनों की लगातार निगरानी के लिए एक गैर-आक्रामक और गैर-लेबल गहन दृष्टिकोण की अनुमति देता है। इस परख भी विभिन्न प्रयोगात्मक setups में अन्य सेल लाइनों के संवहनी अखंडता परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को उच्च शिक्षा मंत्रालय मलेशिया से उच्च संस्थान उत्कृष्टता केंद्र (HICoE) कार्यक्रम (MO002-2019) के तहत समर्थन मिला और दीर्घकालिक अनुसंधान अनुदान योजना (LRGS MRUN चरण 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) के तहत वित्त पोषण मिला।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Nest 615601
37 °C incubator with 5% CO2 Sanyo MCO-18AIC
75 cm2 tissue culture flask  Corning 430725U
Antibiotic solution penicillin-streptomycin (P/S) Sciencell 0503
Biological safety cabinet, Class II Holten HB2448
Collagen Type 1 SIgma-Aldrich C3867
Endothelial cell growth supplement (ECGS) Sciencell 1052
Endothelial cell medium (ECM) Sciencell 1001
E-plate 96 Agilent Technologies, Inc. 05232368001
Fetal bovine serum (FBS) Sciencell 0025
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma-Aldrich H9394
Hemocytometer Laboroptik LTD Neubauer improved
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) Sciencell 8000
Inverted microscope ZEISS TELAVAL 31
Latitude 3520 Laptop Dell  -
Multichannel micropipette (10 - 100 µL) Eppendorf 3125000036
Multichannel micropipette (30 - 300 µL) Eppendorf 3125000052
Reagent reservior Tarsons T38-524090
RTCA resistor plate 96 Agilent Technologies, Inc. 05232350001
RTCA Software Pro (Version 2.6.1) Agilent Technologies, Inc. 5454433001
Single channel pipettes (10 - 100 µL) Eppendorf 3123000047
Single channel pipettes (100 - 1000 µL) Eppendorf 3123000063
Single channel pipettes (20 - 200 µL) Eppendorf 3123000055
xCELLigence Real-time cell analyzer SP (Model: W380) Agilent Technologies, Inc. 00380601030 https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232

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जीवविज्ञान अंक 195 मानव गर्भनाल नस एंडोथेलियल कोशिकाएं वायरल संक्रमण प्रतिबाधा-आधारित रीयल-टाइम सेल विश्लेषण एंडोथेलियल सेल बैरियर द्रव विनिमय विलेय विनिमय वायरस प्रसार एंडोथेलियल पारगम्यता एंडोथेलियल सेल बैरियर व्यवधान संवहनी रिसाव रीयल-टाइम सेल विश्लेषक जीका वायरस (ZIKV) संक्रमण सेल इंडेक्स (CI) क्षणिक प्रभाव सेल रूपात्मक परिवर्तन संवहनी अखंडता
प्रतिबाधा-आधारित वास्तविक समय सेल विश्लेषण का उपयोग करके वायरल संक्रमण पर मानव गर्भनाल नस एंडोथेलियल कोशिकाओं में परिवर्तन की निगरानी
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