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Biology

Überwachung von Veränderungen in menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen nach Virusinfektion mittels impedanzbasierter Echtzeit-Zellanalyse

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/64887
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

Summary

Die aktuelle Studie beschreibt ein Protokoll zur Überwachung der Veränderungen in humanen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) während einer Virusinfektion mit Hilfe eines Echtzeit-Zellanalysesystems (RTCA).

Abstract

Endothelzellen kleiden die innere Oberfläche aller Blut- und Lymphgefäße aus und bilden eine semipermeable Barriere, die den Austausch von Flüssigkeit und gelösten Stoffen zwischen Blut oder Lymphe und dem umgebenden Gewebe reguliert. Die Fähigkeit eines Virus, die Endothelbarriere zu überwinden, ist ein wichtiger Mechanismus, der die Ausbreitung des Virus im menschlichen Körper erleichtert. Es wird berichtet, dass viele Viren die endotheliale Permeabilität verändern und/oder während der Infektion eine Störung der Endothelzellbarriere verursachen, was zu Gefäßleckagen führen kann. Die aktuelle Studie beschreibt ein Echtzeit-Zellanalyseprotokoll (RTCA), bei dem ein kommerzieller Echtzeit-Zellanalysator verwendet wird, um die endotheliale Integrität und Permeabilität während einer Infektion der menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) mit dem Zika-Virus (ZIKV) zu überwachen. Die vor und nach der ZIKV-Infektion aufgezeichneten Impedanzsignale wurden in Zellindexwerte (CI) übersetzt und analysiert. Das RTCA-Protokoll ermöglicht den Nachweis von transienten Effekten in Form von zellmorphologischen Veränderungen während einer Virusinfektion. Dieser Assay könnte auch nützlich sein, um Veränderungen in der vaskulären Integrität von HUVECs in anderen Versuchsanordnungen zu untersuchen.

Introduction

Endothelzellen (ECs) kleiden die innere Oberfläche aller Blut- und Lymphgefäße aus. Sie sind durch Adhären, enge Gap Junctions, verbunden, die eine semipermeable Barriere zwischen Blut oder Lymphe und dem umgebenden Gewebe bilden 1,2. Die intakten endothelialen Zell-Zell-Verbindungen sind entscheidend für die Regulierung des Transports von Makromolekülen, gelösten Stoffen und Flüssigkeiten, die für die physiologischen Aktivitäten der entsprechenden Gewebe und Organe entscheidend sind3. Die Endothelbarriere ist dynamisch und wird durch spezifische Stimuli moduliert4. Die Störung oder der Verlust der endothelialen Barrierefunktion ist ein Kennzeichen der Pathophysiologie der Krankheit bei akuten und chronischen Entzündungen in der Pathogenese vieler Krankheiten 5,6,7, einschließlich Virusinfektionen 8,9,10,11. Für Flaviviren wurde festgestellt, dass das Nicht-Strukturprotein NS1 die endotheliale Permeabilität verändern kann, z. B. durch eine Störung der endothelialen Glykokalyx-ähnlichen Schicht als Folge einer erhöhten Expression und Aktivierung von Cathepsin L, Sialidasen und Endoglycosidase-Heparinase9. Im Krankheitszustand ist die Integrität der endothelialen Monoschicht beeinträchtigt und die Zell-Zell-Verbindungen sind gestört, was zu endothelialen Verletzungen und Funktionsstörungen führen kann12 und schließlich zu weit verbreiteten pathologischen Manifestationen in mehreren Organsystemen13,14. Eine Virusinfektion von ECs führt zu Veränderungen der zellulären Signalwege und des zellulären Genexpressionsprofils, die die Flüssigkeitsbarrierefunktionen beeinträchtigen, eine Störung der ECs verursachen und Gefäßleckagen induzieren können10,15. Es wurde festgestellt, dass eine Infektion von ECs mit dem Zika-Virus (ZIKV) die Integrität der Verbindung stört, was zu Veränderungen der Gefäßpermeabilität führt und zu einer Dysfunktion der endothelialen Barriere führt, was zu Gefäßleckagen führt10,15. Studien haben gezeigt, dass das ZIKV mit schweren Geburtsfehlern in Verbindung gebracht wird; Über den genauen Mechanismus, durch den dies geschieht, ist jedoch nicht viel bekannt16,17. Das Verständnis der Veränderungen der endothelialen Barriere während einer Infektion ist daher entscheidend, um den Krankheitsmechanismus zu verstehen.

ECs werden derzeit als wichtiges experimentelles in vitro vaskuläres Modellsystem für verschiedene physiologische und pathologische Prozesse verwendet 18,19,20,21. Humane Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) wurden in großem Umfang als primäres, nicht immortalisiertes Zellsystem verwendet, um das vaskuläre Endothel und die Gefäßbiologie in vitro zu untersuchen 22,23,24,25. HUVECs wurden erstmals in den frühen 1970er Jahren für die In-vitro-Kultur aus der Nabelvene der menschlichen Nabelschnur isoliert26. HUVECs haben eine kopfsteinpflasterartige Morphologie, die sich im Labor leicht vermehren lässt. Aufgrund der Scherspannung nach längerer Verharrung im konfluenten Zustand wird eine Dehnung der Zellform beobachtet. HUVECs können durch das Vorhandensein von Weibel- und Palade-Körperchen (WPB), pinozytären Vesikel, kleinen Mengen von Fibrillen in der Nähe des Zellkerns, Mitochondrien mit röhrenförmigen Formen, die selten Verästelungen zeigen, einem ellipsoiden Kern mit einem feinkörnigen Muster aus kondensiertem Chromatin und ein bis drei Nukleolen in jedem Kern charakterisiertwerden 27. Obwohl HUVECs zahlreiche morphologische Merkmale aufweisen, kann die Identifizierung von HUVECs nicht allein durch optische Untersuchung erreicht werden. Assays, wie z. B. die Immunfluoreszenzfärbung von vaskulärem endothelialem (VE)-Cadherin, werden häufig zur Überwachung der vaskulären Integrität in HUVECs verwendet 28,29,30,31.

Diese Studie beschreibt das Echtzeit-Zellanalyseprotokoll (RTCA) der Infektion von HUVECs. Das RTCA-System verwendet spezielle goldbeschichtete Platten mit Mikroelektroden, die eine leitfähige Oberfläche für die Zellbefestigung bieten. Wenn sich die Zellen an die Mikroelektrodenoberfläche anheften, bildet sich eine Barriere, die den Elektronenfluss durch die Mikroelektroden behindert. Die Messung der von Mikroelektroden erzeugten Impedanz kann verwendet werden, um Informationen über einige zelluläre Prozesse zu gewinnen, einschließlich Zellanhaftungen, Proliferation und Migration32. Bei dem vorgestellten Assay handelt es sich um einen impedanzbasierten zellulären Assay, der in Verbindung mit einem Echtzeit-Zellanalysator eine kontinuierliche Messung der Proliferation lebender Zellen, morphologischer Veränderungen (z. B. Zellschrumpfung) und der Zelladhäsionsqualität auf nichtinvasive und markierungsfreie Weise ermöglicht. In dieser Studie wird der Echtzeit-Zellanalysator verwendet, um die endotheliale Integrität und morphologische Veränderungen von HUVECs während der ZIKV-Infektion zu überwachen. Kurz gesagt, das Gerät misst den Elektronenfluss, der in speziellen Gold-Mikroelektroden-beschichteten Mikrotiterplatten in Gegenwart eines Nährmediums (elektrisch leitfähige Lösung) übertragen wird. Zelladhärenz oder Änderungen der Zellzahl und -morphologie stören den Elektronenfluss und verursachen Impedanzschwankungen, die vom Gerät erfasst werden können (ergänzende Abbildung 1). Die Differenz zwischen HUVEC-Wachstum, -Proliferation und -Adhärenz vor und nach der ZIKV-Infektion wird in Echtzeit durch ein elektrisches Impedanzsignal aufgezeichnet und dann in den Zellindex (CI) übersetzt. Der CI-Wert aus der Vorinfektion wird als Ausgangswert für die Normalisierung des CI-Werts verwendet. Die Veränderungen der CI-Werte spiegeln zellmorphologische Veränderungen oder den Verlust der Zelladhärenz bei der Infektionwider 33. Die Studienergebnisse zeigen, dass das RTCA-Protokoll den Nachweis von transienten Effekten oder zellmorphologischen Veränderungen während der Virusinfektion im Vergleich zu einem Endpunkt-Assay, wie z.B. der Immunfluoreszenzfärbung von VE-Cadherin, ermöglicht. Die RTCA-Methode könnte nützlich sein, um die Veränderungen der vaskulären Integrität von HUVEC bei einer Infektion mit anderen Viren zu analysieren.

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Protocol

1. Vorbereitung der Zellen

  1. Vorbereitung von HUVECs
    1. Züchten Sie 7,5 x 105 HUVEC-Zellen/ml in einer 75 cm2 (beschichtet mit 20 μg/ml Kollagen Typ 1) Zellkulturflasche, die 12 ml Endothelzellmedium (ECM) enthält, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS), 0,01 % Endothelzellwachstumsergänzung (EKG), die Wachstumsfaktoren, Hormone und Proteine enthält, die für die Kultur von HUVECs erforderlich sind. und 0,01% Penicillin-Streptomycin (P/S). Inkubieren Sie die Zellen in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 (Abbildung 1).

2. Aufbau des RTCA-Experiments

  1. Widerstandsverifizierung auf RTCA
    1. Doppelklicken Sie auf das Symbol der RTCA-Software auf dem Desktop, um die Anwendung zu starten. Ein Anmeldefenster wird angezeigt, geben Sie den Benutzernamen und das Passwort ein, um sich anzumelden.
    2. Platzieren Sie eine 96-Well-RTCA-Widerstandsplatte mit der A1-Vertiefung nach innen in die RTCA-Station im Zellkultur-Inkubator.
    3. Geben Sie auf der Registerkarte "Exp Notes " der RTCA-Software den Namen des Experiments, die SN des Geräts und den Gerätetyp (QC-Platte) ein.
    4. Markieren Sie auf der Registerkarte "Layout " unter der Registerkarte "Zelle " der RTCA-Software alle Wells und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die markierten Wells, um sicherzustellen, dass alle Wells aktiviert (ausgegraut) sind.
    5. Klicken Sie auf der Registerkarte Zeitplan der RTCA-Software auf Step_1. Geben Sie Sweeps: 10 und Intervall: 30 s ein. Klicken Sie auf Übernehmen. Klicken Sie in der oberen linken Ecke der Software auf Start/Fortfahren , um den Verifizierungslauf zu starten.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Anschluss der Wells an die RTCA-Station in Ordnung ist, indem Sie "Plate Scanned. Verbindungen OK" am Ende der Seite.
  2. Widerstandsverifizierungslauf zur Datenanalyse
    1. Überprüfen Sie auf der Registerkarte Zellenindex die Daten nach Abschluss der Ausführung. Alle CI-Werte sollten kleiner als 0,063 sein.
    2. Überprüfen Sie im unteren Teil der Registerkarte Zellenindex die Rohdaten des Scans. Die Rohscandaten sollten wiederholte Wertemuster von 40,0 ± 2,0 (Zeilen A und H), 67,5 ± 2,5 (Zeilen B und G), 93,6 ± 2,9 (Zeilen C und F) und 117,6 ± 3,2 (Zeilen D und E) aufweisen.
    3. Um den Überprüfungslauf zu beenden, klicken Sie auf Platte > Trennplatte. Die 96-Well-RTCA-Widerstandsplatte kann nun aus der RTCA-Station entfernt werden.
  3. Einholung von Hintergrundinformationen zu RTCA
    1. Waschen Sie die mit Kollagen Typ 1 beschichtete spezielle Gold-Mikroelektrodenplatte (beschichtet mit 20 μg/ml Kollagen Typ 1) mit 60 μl/well Hank's ausgewogener Salzlösung (HBSS; mit Natriumbicarbonat, ohne Calciumchlorid und Magnesiumsulfat) 2x.
    2. Verwerfen Sie das verbleibende HBSS und fügen Sie 50 μl/Well ECM hinzu. Platzieren Sie die spezielle Gold-Mikroelektrodenplatte, die die EZM enthält, mit der A1-Vertiefung nach innen in die RTCA-Station im Zellkultur-Inkubator.
    3. Geben Sie auf der Registerkarte "Exp Notes " der RTCA-Software den Namen des Experiments, die Geräte-SN und den Gerätetyp (96-Well-Format) ein.
    4. Markieren Sie auf der Registerkarte "Layout " unter der Registerkarte "Zelle " der RTCA-Software die Wells, die verwendet werden sollen, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die markierten Wells, um sicherzustellen, dass alle Wells aktiviert (ausgegraut) sind.
    5. Klicken Sie auf der Registerkarte "Zeitplan " der RTCA-Software auf Step_1 und dann auf "Start/Fortfahren " in der oberen linken Ecke der Software, um eine Hintergrundanzeige zu erhalten.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Anschluss der Vertiefungen korrekt ist, indem Sie "Plate Scanned. Verbindungen OK" am Ende der Seite.
    6. Sobald die Hintergrundmessung erfolgt ist, ist die spezielle Gold-Mikroelektroden-Platte nun bereit für die Zellaussaat und kann von der RTCA-Station entfernt werden.
  4. HUVEC-Präparation in der spezialisierten Gold-Mikroelektroden-Platte
    1. Säen Sie die HUVECs in die spezielle Gold-Mikroelektroden-Platte mit 50 μl/Well konditioniertem Medium, 1 x 104 Zellen/Well (konditioniertes Medium: ECM ergänzt mit 10 % FBS, 0,01 % EKGs und 0,01 % P/S). Legen Sie die Platte mit der Vertiefung A1 nach innen zurück in die RTCA-Station, um sie über Nacht in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 zu inkubieren.
      HINWEIS: Die Zellsuspension wurde mit einem Verdünnungsfaktor von zwei mit einem Hämozytometer gezählt.
    2. Klicken Sie auf der Registerkarte Zeitplan in der oberen linken Ecke auf Schritt hinzufügen . Klicken Sie auf Step_2 und ändern Sie die Sweeps: 601 und Intervall: 2 Minuten. Klicken Sie auf Übernehmen. Klicken Sie auf Step_2 und klicken Sie auf Start/Weiter in der oberen linken Ecke der Software.
    3. Nach 20 Stunden Inkubation und wenn die CI-Werte auf der Registerkarte "Well Graph " ein Plateau zeigen, ist die Platte bereit für die Infektion. Klicken Sie auf der Registerkarte "Zeitplan " der RTCA-Software auf "Schritt abbrechen".
    4. Die spezielle Gold-Mikroelektroden-Platte kann nun für die nächsten Schritte aus der RTCA-Station entfernt werden.

3. Virusinfektion bei HUVECs

  1. Verdünnung des Virus
    1. Die ZIKV-Stammkultur wird bei -80 °C gehalten. Für diese Studie wird der in den kryogenen Fläschchen aufbewahrte Virusvorrat entfernt und der ZIKV-Stamm mit serumfreier ECM in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen verdünnt, um eine Vielzahl von Infektionen (MOIs) von 0,1 und 1 zu erreichen.
      HINWEIS: Der ZIKV-Stamm wurde zuvor durch die Vermehrung in Vero-Zellen und die Ernte des ZIKV-Überstandes34 hergestellt.
  2. Infektion der Zellmonoschicht
    1. Entfernen und entsorgen Sie das konditionierte Medium (ECM ergänzt mit 10 % FBS, 0,01 % EKGS und 0,01 % P/S) aus jeder Vertiefung. Spülen Sie jede Vertiefung 2x mit 60 μl HBSS aus. Setzen Sie das HBSS mit Hilfe der Seite der Vertiefung ein; Schießen Sie nicht auf die Zellmonoschicht.
    2. Von der höchsten bis zur niedrigsten Verdünnung 40 μl jeder verdünnten Virusprobe in serumfreier ECM in die Vertiefung geben. Verdreifachen Sie die Vertiefung für jede Verdünnung und halten Sie sechs Vertiefungen ohne Infektion (Negativkontrolle und Positivkontrolle Thrombin). Schießen Sie nicht auf die Zellmonoschicht; Geben Sie stattdessen das verdünnte Virus mit Hilfe der Seite der Vertiefung hinzu. Verwenden Sie für jedes Einführen eine frische Pipettenspitze.
      HINWEIS: Thrombin wurde als Positivkontrolle gewählt, da es die endotheliale Permeabilität von HUVECs schnell erhöhen kann.
    3. Die Platte wird in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 5 %CO2 inkubiert, um eine Virusadsorption zu ermöglichen. Schwenken Sie die Platte 5x alle 15 Minuten, um die Adsorption des Virus in der gesamten Zellmonoschicht zu ermöglichen.
  3. Zugabe des Overlay-Zellkulturmediums
    1. Nach 1 Stunde Inkubation wird die Virussuspension von der niedrigsten zur höchsten Konzentration entfernt und verworfen.
    2. Waschen Sie die infizierten Zellen 2x mit 60 μl HBSS. Überlagern Sie die Bohrung mit ECM, ergänzt mit 2 % FBS. Für die Positivkontrollvertiefungen wird das Thrombin auf 20 U/ml mit ECM verdünnt, das mit 2 % FBS ergänzt wurde, und die Vertiefungen mit thrombinhaltigem ECM-Medium überlagert. Schießen Sie nicht auf die Zellmonoschicht; Fügen Sie stattdessen Overlay-Medien mit Hilfe der Seite des Wells hinzu.
  4. Einsetzen der infizierten spezialisierten Gold-Mikroelektroden-Platte zurück in die RTCA-Station
    1. Klicken Sie auf der Registerkarte Zeitplan in der oberen linken Ecke auf Schritt hinzufügen . Klicken Sie auf Step_3 und ändern Sie die Sweeps: 3.601 und Intervall: 2 min. Klicken Sie auf Übernehmen.
    2. Klicken Sie im angezeigten Popup-Fenster auf OK . Legen Sie die infizierte spezialisierte Gold-Mikroelektroden-Platte mit der A1-Vertiefung nach innen in die RTCA-Station im Zellkultur-Inkubator.
    3. Klicken Sie auf Step_3 und klicken Sie auf Start/Weiter in der oberen linken Ecke der Software.

4. Datenanalyse und Datenexport

  1. Hinzufügung von experimentellen Informationen zu jeder Bohrung
    1. Klicken Sie auf der Registerkarte Layout auf die Registerkarte Zelle (Abbildung 2A). Um die Zielzelleninformationen einzugeben und den Well-Typ für jede Well-Position zu bestimmen, markieren Sie die Well-Markierung und geben Sie den Namen, die Nummer und die Farbe der Zielzelle am unteren Rand der Software ein. Klicken Sie auf Übernehmen (Abbildung 2B).
    2. Um den Well-Typ für jedes Well auf der Registerkarte "Zelle " auszuwählen und zu bestimmen, markieren Sie das Well, wählen Sie den Well-Typ (Probe, Positivkontrolle oder Negativkontrolle) aus und klicken Sie auf Festlegen.
    3. Klicken Sie auf der Registerkarte "Layout " auf die Registerkarte "Behandlung " (Abbildung 2C). Um Behandlungsinformationen einzugeben, markieren Sie die Vertiefung und geben Sie den Behandlungsnamen, die Konzentration der Behandlung, die Einheit und die Farbe ein. Klicken Sie auf Übernehmen (Abbildung 2D).
    4. Um den Well-Typ für jedes Well auf der Registerkarte Behandlung auszuwählen und zu bestimmen, markieren Sie das Well, wählen Sie den Well-Typ (Probe, Positivkontrolle oder Negativkontrolle) aus, und klicken Sie auf Festlegen.
      HINWEIS: Für jede Auswahl können mehrere Wells gleichzeitig hervorgehoben werden.
  2. Normalisierung des CI-Wertes
    1. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die rechte Seite der Registerkarte Datenanalyse, und wählen Sie im Dropdown-Feld Y-Achse die Option Normalisierter Zellenindex aus (Abbildung 3A). Wählen Sie im Abschnitt X-Achse unten die normalisierte Zeit als den letzten gemessenen Zeitpunkt aus, an dem die spezialisierte Gold-Mikroelektroden-Platte wegen Infektion entfernt wurde (Abbildung 3B).
      HINWEIS: Der von der Software durchgeführte Normalisierungsprozess beseitigt den größten Teil der Variabilität aufgrund der Unterschiede bei der Aussaat und Bindung von Bohrlöchern, solange der gewählte Normalisierungspunkt vor der Zugabe des Virus und/oder der Behandlung liegt. Daher sollte der optimale Zeitpunkt für die Normalisierung der letzte Zeitpunkt vor der Virus- und/oder Behandlungszugabe sein. Der Zeitpunkt für die Normalisierung kann auf der Registerkarte Zeitplan unter Step_2 überprüft werden. Die angegebene Gesamtzeit ist der Zeitpunkt für die Normalisierung (Abbildung 3C).
  3. Darstellen der erhaltenen Daten mit RTCA-Software
    1. Wählen Sie auf der Registerkarte Datenanalyse die Wells aus, die dem Diagramm hinzugefügt werden sollen, indem Sie die Wells markieren und auf << Hinzufügen klicken. Der normalisierte Zellenindex für das Zeitdiagramm kann nun kopiert und exportiert werden. Stellen Sie sicher, dass Sie das Kontrollkästchen Durchschnitt aktivieren.
  4. Exportieren von Daten mit RTCA-Software
    1. Klicken Sie in der oberen linken Ecke der RTCA-Software auf Plate > Export Experiment Info.... Aktivieren Sie das Kontrollkästchen, um die zu exportierenden Daten auszuwählen. Klicken Sie auf OK.
      HINWEIS: Rohdaten (CI-Rohwerte) können exportiert werden, wenn Zellenindex > Alle aktiviert ist.
    2. Wählen Sie den Ordner aus, in dem die Exportdatei gespeichert werden soll. Klicken Sie auf SPEICHERN. Es erscheint ein Pop-up-Fenster, das den Export von experimentellen Informationen anzeigt. Sobald der Export abgeschlossen ist, wird ein weiteres Fenster angezeigt, in dem die exportierten Experimentinformationen angezeigt werden.

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Representative Results

Vor der ZIKV-Infektion lag das CI für die HUVEC-Monoschicht, die auf einer speziellen Gold-Mikroelektroden-beschichteten Mikrotiterplatte kultiviert wurde, über 8, was auf starke Adhärenzeigenschaften hindeutet. Platten oder Vertiefungen mit einem CI-Index von weniger als 8 sollten verworfen werden. Die HUVECs wurden dann mit ZIKV bei einem MOI von 0,1 und 1 infiziert, und die Zellimpedanz wurde 7 Tage lang aufgezeichnet. Der KI-Wert der mit ZIKV P6-740 infizierten HUVECs bei einem MOI von 0,1 (hellblaue Linie) begann 15 h nach der Infektion (HPI) im Vergleich zur negativen Infektionskontrolle (braune Linie; Abbildung 4). Bei HUVECs, die mit einer höheren Dosis von ZIKV P6-740 bei einem MOI von 1 (blaue Linie) infiziert wurden, begann der CI-Wert bereits bei 11 HPI zu sinken. Bei 24 HPI gab es einen Rückgang des normalisierten KI-Wertes um 5 % und 7 % (0,949, 0,929), wenn ECs mit ZIKV bei einem MOI von 0,1 bzw. 1 infiziert wurden. Eine 50%ige Reduktion des normalisierten CI-Wertes wurde bei 96 HPI und bei 66,75 HPI bei ZIKV-Infektion bei einem MOI von 0,1 bzw. 1 festgestellt. Der normalisierte CI-Wert erreichte seinen niedrigsten Punkt bei 107 HPI, wo es eine Reduktion von 51 % und 60 % (0,4915, 0,3984) nach einer ZIKV-Infektion bei einem MOI von 0,1 bzw. 1 gab. Der normalisierte KI-Wert zeigte einen Anstieg von 4% und 13% von 107 HPI bis zum Ende des Experiments bei 168 HPI (0,5128; 0,4571). Die schwarze Linie zeigt die Wirkungen von Thrombin, das als Positivkontrolle verwendet wurde, wobei die CI-Werte während des gesamten Experiments niedrig blieben, was die Störung von Tight Junctions nachahmt und eine Gefäßleckage induziert35.

Figure 1
Abbildung 1: Humane Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs). Die Abbildung ist in 40-facher Vergrößerung, um die Konfluenzrate anzuzeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Screenshots der Registerkarte "Zelle" und "Behandlung" auf der Registerkarte "Layout" in der RTCA-Software. (A) Klicken Sie auf der Registerkarte " Layout " auf die Registerkarte "Zelle ". (B) Um Informationen zur Zielzelle einzugeben und den Well-Typ für jede Vertiefung zu bestimmen, markieren Sie die Vertiefung und geben Sie den Namen, die Nummer und die Farbe der Zielzelle am unteren Rand der Software ein. Klicken Sie auf Übernehmen. (C) Klicken Sie auf die Registerkarte Layout unter der Registerkarte Behandlung . (D) Um Behandlungsinformationen einzugeben, markieren Sie die Vertiefung und geben Sie den Behandlungsnamen, die Konzentration der Behandlung, die Einheit und die Farbe ein. Klicken Sie auf Übernehmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Screenshots der Registerkarte "Datenanalyse" in der RTCA-Software für die Normalisierung des Zellindexes. (A) Wählen Sie in der Dropdown-Liste Y-Achse die Option Normalisierter Zellenindex aus. (B) Wählen Sie im Abschnitt X-Achse die Normalisierungszeit aus. (C) Screenshot der Registerkarte "Zeitplan" in der RTCA-Software. Die Normalisierungszeit wird bei der Step_2 Gesamtzeit angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Normalisierter Zellindex im Vergleich zur Zeitdarstellung der Zika-Virus (ZIKV)-Infektion in humanen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs). Die spezielle Gold-Mikroelektroden-Platte wurde mit 20 μg/ml Kollagen Typ 1 beschichtet. Die HUVECs wurden mit einer Dichte von 1,0 x 104 Zellen/Well ausgesät. Zur Infektion wurde ZIKV P6-740 (MOI: 0,1, 1) eingesetzt. Hellblau: ZIKV P6-740 (MOI: 0,1); blau: ZIKV P6-740 (ab Bezug: 1); schwarz: Thrombin als Positivkontrolle (20 U/ml); Braun: Negativer Infektionsschutz. Jeder Datenpunkt stellt den Durchschnitt dar und wurde dreifach analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Schematische Darstellung der Technik, die bei der auf der elektrischen Biosensor-Impedanz basierenden RTCA verwendet wird. Eine Seitenansicht der Well-Platte; Am Boden der Vertiefungen befinden sich vergoldete Minus- und Pluspolen. Wenn das Gerät CI in dem Mikrotopf misst, das Nährmedien enthält, die es ermöglichen, Elektrizität zu leiten, fließt das Elektron vom Minus- zum Minuspol. Wenn es sich um eine leere Steuerung handelt, ist der Elektronenfluss glatt, daher wird keine Impedanz aufgezeichnet. Wenn die Zellen ausgesät sind und sich immer mehr Zellen am Boden des Brunnens anheften, ist die Impedanz im Elektronenfluss vorhanden und wird vom Computer aufgezeichnet. Anhand dieses Impedanzwerts wandelt das Gerät ihn in einen CI-Wert um, der die Anzahl der Zellen angibt, die am Boden der Vertiefung befestigt sind (Adhäsion). Erstellt mit BioRender. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Eine zytozide Virusinfektion in permissiven Zellen ist in der Regel mit erheblichen Veränderungen der Zellmorphologie und Biosynthese verbunden36. Die virusinduzierten zellulären morphologischen Veränderungen, wie Zellschrumpfung, Zellvergrößerung und/oder Synzytienbildung, werden auch als zytopathische Effekte (CPEs) bezeichnet, die für bestimmte Virusinfektionen charakteristisch sind37. In ECs wurde das CPE als die Zerstörung von Zellen und den Zusammenbruch der Tight Junctions zwischen den einzelnen ECs beschrieben, was zum Zusammenbruch der Endothelbarriere führte38,39. CPEs in HUVECs können als einschichtige Zellablösung und Schwimmen aus dem Gewebekulturgefäß beschrieben werden. Die morphologischen Veränderungen der infizierten Zellen, wie z.B. Ablösung und Floating adhärenter Zellen, können mit der RTCA-Methode kontinuierlich nachgewiesen werden. Diese Technik basiert auf der elektrischen Impedanz, die eine Überwachung von Zellen in Echtzeit bis zu alle paar Sekunden ermöglicht. Es ermöglicht die Quantifizierung der Zellproliferation, morphologischer Veränderungen und im Falle von HUVECs kann es verwendet werden, um Veränderungen der endothelialen Integrität und der Zellbarrierefunktion40 nach Stimulation zu überwachen.

In dieser Studie ist der kritische Schritt der Versuchsaufbau, bei dem die 96-Well-Widerstandsplatte verwendet wird. Damit soll sichergestellt werden, dass alle Anschlüsse des Analysators gut mit der Platte verbunden sind. Bei RTCA wird der gemessene Impedanzwert in einen CI-Wert umgerechnet, um die Unterschiede in der Zellzahl, dem Adhäsionsgrad, der Zellmorphologie und der Zelllebensfähigkeit zu differenzieren41. Der Abfall der aufgezeichneten Impedanz durch den RTCA-Analysator, der sich in einem Abfall des CI-Wertes niederschlägt, deutet auf eine reduzierte Zellzahl, einen schwächeren Adhäsionsgrad und erhebliche Veränderungen in der Zellmorphologie hin42. Daher ist es auch wichtig, die Eignung der Zelllinien und der optimalen Zellzahlen für das RTCA-Experiment zu testen. Es ist wichtig festzustellen, ob der gewünschte CI-Index erreicht werden kann, bevor die Tests an den Zellen mit dem RTCA-System durchgeführt werden. Darüber hinaus hilft dies auch bei der Bestimmung, ob das RTCA-System geeignet ist, das Zellwachstum und die Zelltodprofile ausgewählter Zelltypen zu überwachen. In unserer Studie wurde ein starker Abfall der CI-Werte beobachtet, wenn HUVECs mit ZIKV P6-740 bei einem MOI von 0,1 und 1 infiziert wurden. Der steile Abfall des CI-Wertes deutet darauf hin, dass nach der Infektion zelluläre morphologische Veränderungen von HUVEC auftraten, die zu einer Störung der Tight Junctions und der Integrität der EC-Gefäße führten.

Konventionell werden CPEs, die durch die Virusinfektion von Zellen in vitro verursacht werden, auf der Grundlage mikroskopischer Beobachtungen der infizierten Zellen geschätzt. Darüber hinaus ermöglichen einige andere Assays, wie z. B. der Plaque-Assay, die Visualisierung von CPEs (wie z. B. Zellablösung) und werden verwendet, um die Ausdehnung der CPEs42 zu messen. Diese Methoden haben jedoch Einschränkungen, da sie nur Informationen über diskrete Zeitpunkte der zellulären morphologischen Veränderungen liefern (Endpunkt-Assays). Andere Assays, wie z. B. die Immunfluoreszenzfärbung, beruhen auf Kombinationen spezifischer Antikörper, die mit einem Fluorophor markiert sind, um die morphologischen Veränderungen sichtbar zu machen43. Obwohl der Immunfluoreszenz-Assay über eine breite Leistungsfähigkeit verfügt, die die Visualisierung vieler Komponenten in einem bestimmten Gewebe oder Zelltyp ermöglicht, ermöglicht diese Technik keine Echtzeitüberwachung und -erkennung während einer Virusinfektion. Im Gegensatz dazu zeichnet das RTCA-System die zellmorphologischen Veränderungen während der Virusinfektion in Echtzeit auf und ermöglicht so die Erfassung vorübergehender Effekte, wie z. B. vorübergehender vaskulärer Leckagen, die von Endpunkt-Assays übersehen werden könnten. Zum Beispiel würden Endpunkt-Assays die Daten und morphologischen Veränderungen nicht schon bei 60 HPI, 80 HPI und 100 HPI erkennen. Neben RTCA ist die Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) eine weitere häufig verwendete Methode zur Überwachung von Zell-zu-Zell-Interaktionen, bei der der elektrische Widerstand über die Zellmonoschicht gemessen wird. Der TEER erfordert jedoch mehrere wiederholte Messungen im Laufe der Zeit, um die Aktivitäten lebender Zellen zu überwachen, und wird oft an einer kleineren Anzahl von Proben oder Wells gleichzeitig durchgeführt. Infolgedessen hat TEER in der Regel einen geringeren Durchsatz im Vergleich zu RTCA, das bis zu 96 Bohrlöcher gleichzeitig betreiben kann44.

Trotz seiner Vorteile weist das RTCA-System mehrere Einschränkungen auf. Die Haupteinschränkung des RTCA-Systems sind die kostspieligen Geräte und Verbrauchsmaterialien. Die speziellen Gold-Mikroelektroden-Platten, die vom RTCA-System verwendet werden, sind relativ teuer, zum einmaligen Gebrauch und zum Wegwerfen45. Darüber hinaus können die zellmorphologischen Veränderungen weder auf einem Rekorder (Kamera) abgebildet und aufgezeichnet werden, noch kann der Assay die Akkumulation des Virusantigens oder Veränderungen des Zelloberflächenproteins, wie z. B. VE-Cadherin in HUVECs46, erfassen. Infolgedessen kann das RTCA die zellmorphologischen Veränderungen nicht visualisieren, die zusätzliche nützliche Informationen zur Aufklärung der Krankheitspathogenese liefern würden. Während des Assays oder der Etablierung des Modells wäre eine zusätzliche Färbeüberprüfung, wie z. B. die VE-Cadherin-Färbung für HUVECs, nützlich, um die erhaltenen Messungen zu validieren. Darüber hinaus ist das RTCA-System auf adhärente Zelllinien beschränkt, da es die Anlagerung von Zellen am Boden der Vertiefungen erfordert, damit die Impedanz aufgezeichnet werden kann. Daher kann der berichtete Assay nicht für nicht-adhärente Zelllinien46 verwendet werden.

Zusammenfassend haben wir ein Echtzeit-Zellanalyseprotokoll unter Verwendung des RTCA-Instruments zur Überwachung von Veränderungen in Endothelzellen nach ZIKV-Infektion im 96-Well-Format beschrieben. Diese Methode bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Endpunkt-Assays, da sie einen nicht-invasiven und nicht markierungsintensiven Ansatz zur kontinuierlichen Überwachung zellulärer morphologischer Veränderungen in Echtzeit ermöglicht. Dieser Assay kann auch verwendet werden, um Veränderungen der vaskulären Integrität anderer Zelllinien in verschiedenen Versuchsaufbauten zu analysieren.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde vom malaysischen Ministerium für Hochschulbildung im Rahmen des Programms Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) (MO002-2019) und im Rahmen des Long-Term Research Grant Scheme (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Nest 615601
37 °C incubator with 5% CO2 Sanyo MCO-18AIC
75 cm2 tissue culture flask  Corning 430725U
Antibiotic solution penicillin-streptomycin (P/S) Sciencell 0503
Biological safety cabinet, Class II Holten HB2448
Collagen Type 1 SIgma-Aldrich C3867
Endothelial cell growth supplement (ECGS) Sciencell 1052
Endothelial cell medium (ECM) Sciencell 1001
E-plate 96 Agilent Technologies, Inc. 05232368001
Fetal bovine serum (FBS) Sciencell 0025
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma-Aldrich H9394
Hemocytometer Laboroptik LTD Neubauer improved
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) Sciencell 8000
Inverted microscope ZEISS TELAVAL 31
Latitude 3520 Laptop Dell  -
Multichannel micropipette (10 - 100 µL) Eppendorf 3125000036
Multichannel micropipette (30 - 300 µL) Eppendorf 3125000052
Reagent reservior Tarsons T38-524090
RTCA resistor plate 96 Agilent Technologies, Inc. 05232350001
RTCA Software Pro (Version 2.6.1) Agilent Technologies, Inc. 5454433001
Single channel pipettes (10 - 100 µL) Eppendorf 3123000047
Single channel pipettes (100 - 1000 µL) Eppendorf 3123000063
Single channel pipettes (20 - 200 µL) Eppendorf 3123000055
xCELLigence Real-time cell analyzer SP (Model: W380) Agilent Technologies, Inc. 00380601030 https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232

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References

  1. Alberts, B., et al. Cell junctions. Molecular Biology of the Cell. 4th Edition. , Garland Science. (2002).
  2. Pugsley, M. K., Tabrizchi, R. The vascular system: An overview of structure and function. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 44 (2), 333-340 (2000).
  3. Stevens, T., Garcia, J. G., Shasby, D. M., Bhattacharya, J., Malik, A. B. Mechanisms regulating endothelial cell barrier function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 279 (3), L419-L422 (2000).
  4. Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. The Journal of Physiology. 569, 359-366 (2005).
  5. Boueiz, A., Hassoun, P. M. Regulation of endothelial barrier function by reactive oxygen and nitrogen species). Microvascular Research. 77 (1), 26-34 (2009).
  6. Fosse, J. H., Haraldsen, G., Falk, K., Edelmann, R. Endothelial cells in emerging viral infections. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 619690 (2021).
  7. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
  8. Iyer, S., Ferreri, D. M., DeCocco, N. C., Minnear, F. L., Vincent, P. A. VE-cadherin-p120 interaction is required for maintenance of endothelial barrier function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (6), L1143-L1153 (2004).
  9. Puerta-Guardo, H., et al. Flavivirus NS1 triggers tissue-specific vascular endothelial dysfunction reflecting disease tropism. Cell Reports. 26 (6), 1598-1613 (2019).
  10. Rastogi, M., Singh, S. K. Zika virus NS1 affects the junctional integrity of human brain microvascular endothelial cells. Biochimie. 176, 52-61 (2020).
  11. Soe, H. J., et al. High dengue virus load differentially modulates human microvascular endothelial barrier function during early infection. Journal of General Virology. 98 (12), 2993-3007 (2017).
  12. Krouwer, V. J., Hekking, L. H. P., Langelaar-Makkinje, M., Regan-Klapisz, E., Post, J. A. Endothelial cell senescence is associated with disrupted cell-cell junctions and increased monolayer permeability. Vascular Cell. 4 (1), 12 (2012).
  13. Aird, W. C. The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome. Blood. 101 (10), 3765-3777 (2003).
  14. Bryce, C., et al. Pathophysiology of SARS-CoV-2: targeting of endothelial cells renders a complex disease with thrombotic microangiopathy and aberrant immune response. The Mount Sinai COVID-19 autopsy experience. MedRxiv. , (2020).
  15. Khaiboullina, S., et al. Transcriptome profiling reveals pro-inflammatory cytokines and matrix metalloproteinase activation in Zika virus infected human umbilical vein endothelial cells. Frontiers in Pharmacology. 10, 642 (2019).
  16. Cao-Lormeau, V. -M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. The Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
  17. Sarno, M., et al. Zika virus infection and stillbirths: a case of hydrops fetalis, hydranencephaly and fetal demise. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (2), e0004517 (2016).
  18. Dalrymple, N. A., Mackow, E. R. Virus interactions with endothelial cell receptors: implications for viral pathogenesis. Current Opinion in Virology. 7, 134-140 (2014).
  19. Buchanan, C. F., et al. Three-dimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (1), 64-75 (2014).
  20. Daniels, B. P., et al. Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 212 (1), 173-179 (2013).
  21. Vozzi, F., Bianchi, F., Ahluwalia, A., Domenici, C. Hydrostatic pressure and shear stress affect endothelin-1 and nitric oxide release by endothelial cells in bioreactors. Biotechnology Journal. 9 (1), 146-154 (2014).
  22. Gallinat, A., Badimon, L. DJ-1 interacts with the ectopic ATP-synthase in endothelial cells during acute ischemia and reperfusion. Scientific Reports. 12 (1), 12753 (2022).
  23. Jiménez, N., Krouwer, V. J. D., Post, J. A. A new, rapid and reproducible method to obtain high quality endothelium in vitro. Cytotechnology. 65 (1), 1-14 (2013).
  24. Latifi-Navid, H., et al. Network analysis and the impact of Aflibercept on specific mediators of angiogenesis in HUVEC cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (17), 8285-8299 (2021).
  25. Poulet, M., et al. PRL-2 phosphatase is required for vascular morphogenesis and angiogenic signaling. Communications Biology. 3 (1), 603 (2020).
  26. Laurens, N., van Hinsbergh, V. W. Isolation, purification and culture of human micro- and macrovascular endothelial cells. Methods in Endothelial Cell Biology. , Springer. 3-13 (2004).
  27. Haudenschild, C. C., Zahniser, D., Folkman, J., Klagsbrun, M. Human vascular endothelial cells in culture: lack of response to serum growth factors. Experimental Cell Research. 98 (1), 175-183 (1976).
  28. Cenni, E., Perut, F., Baldini, N. In vitro models for the evaluation of angiogenic potential in bone engineering. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (1), 21-30 (2011).
  29. Lau, S., Gossen, M., Lendlein, A., Jung, F. Venous and arterial endothelial cells from human umbilical cords: potential cell sources for cardiovascular research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 978 (2021).
  30. Marquez-Curtis, L. A., Sultani, A. B., McGann, L. E., Elliott, J. A. W. Beyond membrane integrity: Assessing the functionality of human umbilical vein endothelial cells after cryopreservation. Cryobiology. 72 (3), 183-190 (2016).
  31. Park, H. -J., et al. Human umbilical vein endothelial cells and human dermal microvascular endothelial cells offer new insights into the relationship between lipid metabolism and angiogenesis. Stem Cell Reviews. 2 (2), 93-102 (2006).
  32. Dowling, C. M., Herranz Ors, C., Kiely, P. A. Using real-time impedance-based assays to monitor the effects of fibroblast-derived media on the adhesion, proliferation, migration and invasion of colon cancer cells. Bioscience Reports. 34 (4), e00126 (2014).
  33. Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 54 (8), 2120-2127 (2016).
  34. Tan, J. Y., Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar, S., Tan, K. K. Virus propagation and cell-based colorimetric quantification. Journal of Visualized Experiments. , (2023).
  35. Kustermann, S., et al. A real-time impedance-based screening assay for drug-induced vascular leakage. Toxicological Sciences. 138 (2), 333-343 (2014).
  36. Albrecht, T., Fons, M., Boldogh, I., Rabson, A. S. Effects on cells. Medical Microbiology. 4th Edition. , (1996).
  37. Hematian, A., et al. Traditional and modern cell culture in virus diagnosis. Osong Public Health and Research Perspectives. 7 (2), 77-82 (2016).
  38. Friedman, H. M. Infection of endothelial cells by common human viruses. Reviews of Infectious Diseases. 11, S700-S704 (1989).
  39. Friedman, H. M., Macarak, E. J., MacGregor, R. R., Wolfe, J., Kefalides, N. A. Virus infection of endothelial cells. The Journal of Infectious Diseases. 143 (2), 266-273 (1981).
  40. Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Analytical Chemistry. 74 (22), 5748-5753 (2002).
  41. Marlina, S., Shu, M. -H., AbuBakar, S., Zandi, K. Development of a Real-Time Cell Analysing (RTCA) method as a fast and accurate screen for the selection of chikungunya virus replication inhibitors. Parasites & Vectors. 8, 579 (2015).
  42. Liu, S., DeLalio, L. J., Isakson, B. E., Wang, T. T. AXL-mediated productive infection of human endothelial cells by Zika virus. Circulation Research. 119 (11), 1183-1189 (2016).
  43. Souf, S. Recent advances in diagnostic testing for viral infections. Bioscience Horizons: The International Journal of Student Research. 9, (2016).
  44. Sun, M., et al. A dynamic real-time method for monitoring epithelial barrier function in vitro. Analytical Biochemistry. 425 (2), 96-103 (2012).
  45. Stefanowicz-Hajduk, J., Ochocka, J. R. Real-time cell analysis system in cytotoxicity applications: Usefulness and comparison with tetrazolium salt assays. Toxicology Reports. 7, 335-344 (2020).
  46. Kho, D., et al. Application of xCELLigence RTCA biosensor technology for revealing the profile and window of drug responsiveness in real time. Biosensors. 5 (2), 199-222 (2015).

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Biologie Ausgabe 195 Menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen Virusinfektion Impedanzbasiert Echtzeit-Zellanalyse Endothelzellen Barriere Flüssigkeitsaustausch Austausch gelöster Stoffe Virusverbreitung Endothelpermeabilität Störung der Endothelzellbarriere Gefäßleckage Echtzeit-Zellanalysator Zika-Virus (ZIKV)-Infektion Zellindex (CI) Transiente Effekte Zellmorphologische Veränderungen Gefäßintegrität
Überwachung von Veränderungen in menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen nach Virusinfektion mittels impedanzbasierter Echtzeit-Zellanalyse
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Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar, S., Tan, K. K. Monitoring Changes in Human Umbilical Vein Endothelial Cells upon Viral Infection Using Impedance-Based Real-Time Cell Analysis. J. Vis. Exp. (195), e64887, doi:10.3791/64887 (2023).

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