Summary
현재 연구는 실시간 세포 분석(RTCA) 시스템을 사용하여 바이러스 감염 중 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)의 변화를 모니터링하는 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
내피 세포는 모든 혈액 및 림프관의 내부 표면을 감싸고 혈액 또는 림프액과 주변 조직 사이의 체액 및 용질 교환을 조절하는 반투과성 장벽을 만듭니다. 바이러스가 내피 장벽을 통과하는 능력은 인체에서 바이러스 확산을 촉진하는 중요한 메커니즘입니다. 많은 바이러스가 감염 시 내피 투과성을 변화시키거나 내피 세포 장벽 파괴를 일으켜 혈관 누출을 일으킬 수 있는 것으로 보고되고 있습니다. 현재 연구는 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)의 지카 바이러스(ZIKV) 감염 중 내피 무결성 및 투과성 변화를 모니터링하기 위해 상용 실시간 세포 분석기를 사용하는 실시간 세포 분석(RTCA) 프로토콜을 설명합니다. ZIKV 감염 전후에 기록된 임피던스 신호를 세포 지수(CI) 값으로 변환하여 분석했습니다. RTCA 프로토콜을 사용하면 바이러스 감염 중 세포 형태학적 변화의 형태로 일시적인 효과를 감지할 수 있습니다. 이 분석은 다른 실험 설정에서 HUVEC의 혈관 무결성 변화를 연구하는 데에도 유용할 수 있습니다.
Introduction
내피 세포(EC)는 모든 혈액 및 림프관의 내부 표면을 둘러싸고 있습니다. 이들은 부착체, 단단한 간극 연접으로 연결되어 혈액 또는 림프와 주변 조직 사이에 반투과성 장벽을 만듭니다 1,2. 온전한 내피 세포-세포 접합부는 거대분자, 용질 및 체액의 수송을 조절하는 데 중요하며, 해당 조직과 기관의 생리적 활동에 매우 중요합니다3. 내피 장벽은 역동적이며 특정 자극에 의해 조절된다4. 내피 장벽 기능의 붕괴 또는 상실은 바이러스 감염을 포함한 많은 질병 5,6,7의 발병기전에서 급성 및 만성 염증에서 질병 병태생리학의 특징이다 8,9,10,11. 플라비바이러스의 경우, 비구조적 단백질인 NS1이 카텝신 L, 시알리다아제, 엔도글리코시다아제 헤파리나아제의 발현 및 활성화 증가로 인해 내피 당칼릭스 유사층의 파괴를 통해 내피 투과성을 변화시킬 수 있음이 밝혀졌다9. 질병 상태에서는 내피 단층의 무결성이 영향을 받고 세포-세포 접합부가 파괴되어 내피 손상 및 기능 장애12를 유발할 수 있으며 결국 여러 장기 시스템에 걸쳐 광범위한 병리학적 징후가 나타날 수 있습니다13,14. EC의 바이러스 감염은 세포 신호 전달 경로 및 세포 유전자 발현 프로파일의 변화를 초래하며, 이는 유체 장벽 기능에 영향을 미치고 EC의 파괴를 유발하며 혈관 누출을 유발할 수 있습니다10,15. EC의 지카 바이러스(ZIKV) 감염은 혈관 투과성의 변화를 유발하고 내피 장벽 기능 장애를 유발하여 혈관 누출을 초래하는 접합 무결성을 방해하는 것으로 밝혀졌습니다10,15. 연구에 따르면 ZIKV는 심각한 선천적 기형과 관련이 있습니다. 그러나 이것이 발생하는 정확한 메커니즘에 대해서는 많이 알려져 있지 않습니다16,17. 따라서 감염 중 내피 장벽 변화를 이해하는 것은 질병 메커니즘을 이해하는 데 매우 중요합니다.
EC는 현재 다양한 생리학적 및 병리학적 과정을 위한 중요한 실험적 체외 혈관 모델 시스템으로 사용되고있다 18,19,20,21. 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)는 체외 22,23,24,25에서 혈관 내피 및 혈관 생물학을 연구하기 위한 일차적이고 불멸화되지 않은 세포 시스템으로 광범위하게 사용되었습니다. HUVEC은 1970년대 초에 인간 탯줄의 탯줄 정맥(umbilical vein)으로부터 시험관 내 배양을 위해 처음으로 분리되었다(26). HUVEC은 실험실에서 쉽게 증식할 수 있는 조약돌과 같은 형태를 가지고 있습니다. 합류 상태에서 장기간 유지된 후의 전단 응력으로 인해 세포 모양의 신장이 관찰됩니다. HUVEC은 Weibel 및 Palade body (WPB), pinocytic vesicles, 핵 근처에 위치한 소량의 fibril, 파급 효과를 거의 나타내지 않는 관 모양의 미토콘드리아, 응축 된 염색질의 미세한 과립 패턴을 갖는 타원체 핵 및 각 핵에 존재하는 1 내지 3 개의 핵올리의 존재로 특징 지을 수 있습니다27. HUVEC은 다양한 형태학적 특성을 보이지만, 광학 검사만으로는 HUVEC을 식별할 수 없습니다. 혈관 내피(VE)-cadherin의 면역형광 염색과 같은 분석은 일반적으로 HUVEC 28,29,30,31의 혈관 무결성 모니터링에 사용됩니다.
이 연구는 HUVEC 감염의 실시간 세포 분석(RTCA) 프로토콜에 대해 설명합니다. RTCA 시스템은 셀 부착을 위한 전도성 표면을 제공하는 미세 전극을 포함하는 특수 금 코팅 플레이트를 사용합니다. 전지가 미세전극 표면에 부착되면 미세전극을 통한 전자 흐름을 방해하는 장벽이 형성됩니다. 미세전극에 의해 생성된 임피던스의 측정은 세포 부착, 증식 및 이동을 포함하는 일부 세포 과정에 대한 정보를 획득하는데 사용될 수 있다32. 보고된 분석은 실시간 세포 분석기와 결합된 임피던스 기반 세포 분석으로, 비침습적이고 표지가 없는 방식으로 살아있는 세포 증식, 형태 변화(예: 세포 축소) 및 세포 부착 품질을 지속적으로 측정합니다. 이 연구에서는 실시간 세포 분석기를 사용하여 ZIKV 감염 중 HUVEC의 내피 무결성 및 형태학적 변화를 모니터링합니다. 간단히 말해서, 이 기기는 배양 배지(전기 전도성 용액)가 있는 상태에서 특수 금미세전극 코팅 마이크로타이터 플레이트에서 전달되는 전자 흐름을 측정합니다. 세포 부착 또는 세포 수 및 형태의 변화는 전자 흐름을 방해하고 기기로 캡처할 수 있는 임피던스 변동을 유발합니다(보충 그림 1). ZIKV 감염 전후의 HUVEC 성장, 증식, 부착 간의 차이는 전기 임피던스 신호에 의해 실시간으로 기록된 후 세포 지수(CI) 값으로 변환됩니다. 감염 전의 CI 값은 CI 값 정규화의 기준으로 사용됩니다. CI 값의 변화는 감염 시 세포 형태학적 변화 또는 세포 부착 손실을 반영한다33. 연구 결과는 RTCA 프로토콜이 VE-cadherin의 면역 형광 염색과 같은 종말점 분석과 비교하여 바이러스 감염 중 일시적인 효과 또는 세포 형태 학적 변화를 감지 할 수 있음을 보여줍니다. RTCA 분석법은 다른 바이러스에 의한 감염 시 HUVEC 혈관 무결성 변화를 분석하는 데 유용할 수 있습니다.
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Protocol
1. 세포 준비
- HUVEC의 준비
- HUVEC의 배양에 필요한 성장 인자, 호르몬 및 단백질을 함유한 10% 소 태아 혈청(FBS), 0.01% 내피 세포 성장 보충제(ECGS)가 보충된 12mL의 내피 세포 배지(ECM)를 함유한 75cm2(20μg/mL 콜라겐 유형 1로 코팅됨) 세포 배양 플라스크에 7.5 x 105 HUVEC 세포/mL를 성장시킵니다. 및 0.01% 페니실린-스트렙토마이신(P/S). 5%CO2를 사용하여 37°C의 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 배양합니다(그림 1).
2. RTCA 실험 설정
- RTCA에서 실행되는 저항기 검증
- 바탕 화면에서 RTCA 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭하여 응용 프로그램을 시작합니다. 로그인 창이 나타나면 사용자 이름과 비밀번호를 입력하여 로그인합니다.
- A96 웰이 안쪽을 향하도록 1웰 RTCA 저항 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 있는 RTCA 스테이션에 놓습니다.
- RTCA 소프트웨어의 Exp Notes 탭에서 실험 이름, 장치 SN 및 장치 유형(QC 플레이트)을 입력합니다.
- RTCA 소프트웨어의 셀 탭 아래에 있는 레이아웃 탭에서 모든 웰을 강조 표시하고 강조 표시된 웰을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 모든 웰이 켜져 있는지 확인합니다(회색으로 표시).
- RTCA 소프트웨어의 Schedule(일정 ) 탭에서 Step_1 클릭합니다. 스윕: 10 및 간격: 30초를 입력합니다. 적용을 클릭합니다. 소프트웨어의 왼쪽 상단 모서리에 있는 시작/계속 을 클릭하여 확인 실행을 시작합니다.
알림: "플레이트 스캔"을 관찰하여 웰과 RTCA 스테이션의 연결이 정상인지 확인하십시오. 연결 확인"이 페이지 하단에 있습니다.
- 데이터 분석을 위한 저항기 검증 실행
- 셀 인덱스 탭에서 실행 완료 시 데이터를 확인합니다. 모든 CI 값은 0.063보다 작아야 합니다.
- Cell Index 탭의 하단에서 원시 스캔 데이터를 확인합니다. 원시 스캔 데이터는 40.0 ± 2.0(A 및 H 행), 67.5 ± 2.5(B 및 G 행), 93.6 ± 2.9(C 및 F 행), 117.6 ± 3.2(D 및 E 행)의 반복되는 값 패턴을 나타내야 합니다.
- 확인 실행을 중지하려면 플레이트 > 릴리스 플레이트를 클릭합니다. 이제 96웰 RTCA 저항 플레이트를 RTCA 스테이션에서 제거할 준비가 되었습니다.
- RTCA에 대한 배경 지식 얻기
- 콜라겐 유형 1 코팅 특수 금-미세 전극 플레이트(20μg/mL 콜라겐 유형 1로 코팅됨)를 Hank의 균형 염 용액(HBSS, 중탄산나트륨 포함, 염화칼슘 및 황산마그네슘 제외) 60μL/웰로 2배 세척합니다.
- 나머지 HBSS를 버리고 50μL/웰의 ECM을 추가합니다. A1 웰이 안쪽을 향하도록 ECM이 포함된 특수 금-미세전극 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 있는 RTCA 스테이션에 놓습니다.
- RTCA 소프트웨어의 Exp Notes 탭에서 실험 이름, 장치 SN 및 장치 유형(96-well 형식)을 입력합니다.
- RTCA 소프트웨어의 셀 탭 아래에 있는 레이아웃 탭에서 사용할 웰을 강조 표시하고 강조 표시된 웰을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 모든 웰이 켜져 있는지 확인합니다(회색으로 표시).
- RTCA 소프트웨어의 일정 탭에서 Step_1를 클릭하고 소프트웨어의 왼쪽 상단 모서리에 있는 시작/계속 을 클릭하여 배경 판독값을 얻습니다.
알림: "Plate Scanned"를 관찰하여 웰의 연결이 올바른지 확인하십시오. 연결 확인"이 페이지 하단에 있습니다. - 배경 판독값이 얻어지면 특수 금-미세전극 플레이트는 이제 세포 파종 준비가 완료되고 RTCA 스테이션에서 제거할 준비가 된 것입니다.
- 특수 금-미세전극 플레이트의 HUVEC 준비
- 50μL/웰의 컨디셔닝된 배지, 1 x 104 세포/웰(컨디셔닝된 배지: 10% FBS, 0.01% ECGS 및 0.01% P/S로 보충된 ECM)로 특수 금-미세전극 플레이트에 HUVEC를 시드합니다. 37 % CO2의 37 ° C에서 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양하기 위해 A1 웰이 안쪽을 향하도록 플레이트를 RTCA 스테이션에 다시 놓습니다.
참고: 세포 계수는 혈구계를 사용하여 희석 인자 2로 세포 현탁액에 대해 수행되었습니다. - Schedule( 일정 ) 탭의 왼쪽 상단 모서리에 있는 Add a Step(단계 추가 )을 클릭합니다. Step_2 클릭하고 Sweeps: 601 및 Interval: 2 min을 변경합니다. 적용을 클릭합니다. Step_2 클릭하고 소프트웨어의 왼쪽 상단 모서리에 있는 시작/계속 을 클릭합니다.
- 20시간 배양 후 웰 그래프 탭의 CI 값이 안정기를 보이면 플레이트가 감염될 준비가 된 것입니다. RTCA 소프트웨어의 Schedule(일정 ) 탭에서 Abort Step(단계 중단)을 클릭합니다.
- 특수 금 미세 전극 플레이트는 이제 후속 단계를 위해 RTCA 스테이션에서 제거할 준비가 되었습니다.
- 50μL/웰의 컨디셔닝된 배지, 1 x 104 세포/웰(컨디셔닝된 배지: 10% FBS, 0.01% ECGS 및 0.01% P/S로 보충된 ECM)로 특수 금-미세전극 플레이트에 HUVEC를 시드합니다. 37 % CO2의 37 ° C에서 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양하기 위해 A1 웰이 안쪽을 향하도록 플레이트를 RTCA 스테이션에 다시 놓습니다.
3. HUVEC의 바이러스 감염
- 바이러스 희석
- ZIKV 스톡 배양은 -80 °C로 유지됩니다. 이 연구에서는 극저온 바이알에 보관된 바이러스 스톡을 제거하고 1.5mL 원심분리 튜브에 무혈청 ECM으로 ZIKV 스톡을 희석하여 0.1 및 1의 감염 다중성(MOI)을 달성합니다.
참고: ZIKV 스톡은 이전에 Vero 세포에서 증식을 수행하고 ZIKV 상층액(34)을 수확하여 제조하였다.
- ZIKV 스톡 배양은 -80 °C로 유지됩니다. 이 연구에서는 극저온 바이알에 보관된 바이러스 스톡을 제거하고 1.5mL 원심분리 튜브에 무혈청 ECM으로 ZIKV 스톡을 희석하여 0.1 및 1의 감염 다중성(MOI)을 달성합니다.
- 세포 단층의 감염
- 각 웰에서 컨디셔닝된 배지(10% FBS, 0.01% ECGS 및 0.01% P/S로 보충된 ECM)를 제거하고 폐기합니다. 각각 60μL의 HBSS 2x로 잘 헹굽니다. 우물 측면을 사용하여 HBSS를 삽입하십시오. 세포 단층을 쏘지 마십시오.
- 가장 높은 희석액에서 가장 낮은 희석액으로 작업하여 무혈청 ECM에서 희석된 각 바이러스 샘플 40μL를 웰에 추가합니다. 각 희석에 대해 웰을 세 배로 늘리고 감염 없이 6개의 웰을 유지합니다(음성 대조군 및 양성 대조군 트롬빈). 세포 단층을 쏘지 마십시오. 대신 우물 옆면을 사용하여 희석된 바이러스를 추가합니다. 삽입할 때마다 새 피펫 팁을 사용하십시오.
참고: 트롬빈은 HUVEC의 내피 투과성을 빠르게 증가시킬 수 있으므로 양성 대조군으로 선택되었습니다. - 바이러스 흡착을 허용하기 위해 5 % CO2 인 37 °C의 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다. 플레이트를 15분마다 5번 헹구어 세포 단층 전체에 바이러스가 흡착되도록 합니다.
- 오버레이 세포 배양 배지 추가
- 배양 1시간 후 바이러스 현탁액을 제거하고 가장 낮은 농도에서 가장 높은 농도로 폐기합니다.
- 감염된 세포를 60μL의 HBSS 2x로 세척합니다. 2% FBS가 보충된 ECM으로 우물을 오버레이합니다. 양성 대조군 웰의 경우 2% FBS가 보충된 ECM으로 트롬빈을 20U/mL로 희석하고 웰을 트롬빈 함유 ECM 배지로 오버레이합니다. 세포 단층을 쏘지 마십시오. 대신 우물 측면을 사용하여 오버레이 미디어를 추가하십시오.
- 감염된 특수 금미세전극판을 RTCA 스테이션에 다시 배치
- Schedule( 일정 ) 탭의 왼쪽 상단 모서리에 있는 Add a Step(단계 추가 )을 클릭합니다. Step_3 클릭하고 스윕: 3,601 및 간격: 2분을 변경합니다. 적용을 클릭합니다.
- 표시되는 팝업 창에서 확인을 클릭합니다. A1 웰이 안쪽을 향하도록 감염된 특수 금-미세전극 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 있는 RTCA 스테이션에 놓습니다.
- Step_3 클릭하고 소프트웨어의 왼쪽 상단 모서리에 있는 시작/계속을 클릭합니다.
4. 데이터 분석 및 데이터 내보내기
- 각 웰의 실험 정보 추가
- Layout( 레이아웃 ) 탭에서 Cell(셀 ) 탭을 클릭합니다(그림 2A). 대상 셀 정보를 입력하고 각 웰의 웰 유형을 결정하려면 웰을 강조 표시하고 소프트웨어 하단의 대상 셀 이름, 번호 및 색상을 입력합니다. Apply(적용 )를 클릭합니다(그림 2B).
- 셀 탭에서 각 웰의 웰 유형을 선택하고 결정하려면 웰을 강조 표시하고 웰 유형(샘플, 양성 대조군 또는 음성 대조군)을 선택한 다음 설정을 클릭합니다.
- Layout( 레이아웃 ) 탭에서 Treatment(처리 ) 탭을 클릭합니다(그림 2C). 처리 정보를 입력하려면 웰을 강조 표시하고 처리 이름, 처리 농도, 단위 및 색상을 입력합니다. 적용(Apply )을 클릭합니다(그림 2D).
- 처리 탭에서 각 웰의 웰 유형을 선택하고 결정하려면 웰을 강조 표시하고 웰 유형(샘플, 양성 대조군 또는 음성 대조군)을 선택한 다음 설정을 클릭합니다.
참고: 각 선택에 대해 여러 웰을 동시에 강조 표시할 수 있습니다.
- CI 값의 정규화
- Data analysis(데이터 분석) 탭의 오른쪽을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Y Axis(Y축) 드롭다운 상자에서 Normalized Cell Index(정규화된 셀 인덱스)를 선택합니다(그림 3A). 하단의 X축 섹션에서 감염을 위해 특수 금미세전극판을 제거한 마지막 측정 시점으로 정규화된 시간을 선택합니다(그림 3B).
참고: 소프트웨어에 의해 수행되는 정규화 프로세스는 선택한 정규화 지점이 바이러스 및/또는 치료법을 추가하기 전인 한 웰 시드 및 부착의 차이로 인한 대부분의 변동성을 제거합니다. 따라서 최적의 정규화 시점은 바이러스 및/또는 치료제 추가 전 마지막 시점이어야 합니다. 정규화할 시점은 Step_2 아래의 일정 탭에서 확인할 수 있습니다. 표시된 총 시간은 정규화할 시점입니다(그림 3C).
- Data analysis(데이터 분석) 탭의 오른쪽을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Y Axis(Y축) 드롭다운 상자에서 Normalized Cell Index(정규화된 셀 인덱스)를 선택합니다(그림 3A). 하단의 X축 섹션에서 감염을 위해 특수 금미세전극판을 제거한 마지막 측정 시점으로 정규화된 시간을 선택합니다(그림 3B).
- RTCA 소프트웨어를 사용하여 획득한 데이터 플로팅
- 데이터 분석 탭에서 웰을 강조 표시하고 추가 << 클릭하여 그래프에 추가할 웰을 선택합니다. 이제 시간 그래프에 대한 정규화된 셀 인덱스를 복사하고 내보낼 준비가 되었습니다. 평균 체크박스를 선택해야 합니다.
- RTCA 소프트웨어를 사용하여 데이터 내보내기
- RTCA 소프트웨어의 왼쪽 상단에서 플레이트 > 실험 정보 내보내기...를 클릭합니다. 확인란을 선택하여 내보낼 데이터를 선택합니다. 확인을 클릭합니다.
참고: 원시 데이터(원시 CI 값)는 Cell index > All 을 선택하면 내보낼 수 있습니다. - 내보내기 파일을 저장할 폴더를 선택합니다. 저장을 클릭합니다. 실험 정보 내보내기를 나타내는 팝업 창이 나타납니다. 내보내기가 완료되면 내보낸 실험 정보를 볼 준비가 되었음을 나타내는 다른 창이 나타납니다.
- RTCA 소프트웨어의 왼쪽 상단에서 플레이트 > 실험 정보 내보내기...를 클릭합니다. 확인란을 선택하여 내보낼 데이터를 선택합니다. 확인을 클릭합니다.
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Representative Results
ZIKV 감염 전, 특수 금미세전극 코팅 마이크로타이터 플레이트에서 배양한 HUVEC 단층에 대해 기록된 CI는 8 이상이었으며, 이는 강력한 부착 특성을 시사합니다. CI 지수가 8 미만인 플레이트 또는 웰은 폐기해야 합니다. 그런 다음 HUVEC을 0.1 및 1의 MOI에서 ZIKV에 감염시키고 세포 임피던스를 7일 동안 기록했습니다. MOI 0.1(연한 파란색 선)에서 ZIKV P6-740에 감염된 HUVEC의 CI 값은 감염 후 15시간(HPI)에 떨어지기 시작했으며, 음성 감염 대조군(갈색 선; 그림 4). MOI 1(파란색 선)에서 고용량의 ZIKV P6-740에 감염된 HUVEC의 경우, CI 값은 11 HPI부터 떨어지기 시작했습니다. 24 HPI에서 EC가 각각 0.1 및 1의 MOI에서 ZIKV에 감염되었을 때 정규화된 CI 값(0.949, 0.929)이 5% 및 7% 감소했습니다. 정규화된 CI 값의 50% 감소는 각각 0.1 및 1의 MOI에서 ZIKV 감염 시 96 HPI 및 66.75 HPI에서 기록되었습니다. 정규화된 CI 값은 107 HPI에서 가장 낮은 지점에 도달했으며, 0.1 및 1의 MOI에서 ZIKV 감염 시 각각 51% 및 60%(0.4915, 0.3984)의 감소가 있었습니다. 정규화된 CI 값은 107 HPI부터 168 HPI(0.5128, 0.4571)에서 실험이 끝날 때까지 4% 및 13% 증가하는 것으로 나타났습니다. 검은색 선은 양성 대조군으로 사용된 트롬빈의 효과를 보여주며, CI 값은 실험 내내 낮게 유지되어 단단한 접합부의 파괴를 모방하고 혈관 누출을 유도했습니다35.
그림 1: 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC). 이 수치는 밀도 비율을 보기 위해 40배 확대한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: RTCA 소프트웨어의 레이아웃 탭 아래에 있는 셀 및 처리 탭의 스크린샷. (A) 레이아웃 탭에서 셀 탭을 클릭합니다. (B) 대상 셀 정보를 입력하고 각 웰의 웰 유형을 결정하려면 웰을 강조 표시하고 소프트웨어 하단에 대상 셀 이름, 번호 및 색상을 입력합니다. 적용을 클릭합니다. (C) Treatment 탭 아래의 Layout 탭을 클릭합니다. (D) 처리 정보를 입력하려면 Well을 강조 표시하고 처리 이름, 처리 농도, 단위 및 색상을 입력합니다. 적용을 클릭합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 셀 인덱스 정규화를 위한 RTCA 소프트웨어의 데이터 분석 탭 스크린샷. (A) 에서 Y 축 드롭 다운 상자에서 정규화 된 셀 인덱스. (B) X 축 섹션에서 정규화 시간을 선택합니다. (C) RTCA 소프트웨어의 일정 탭 스크린샷. 정규화 시간은 Step_2 총 시간에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)에서 지카 바이러스(ZIKV) 감염의 정규화된 세포 지수 대 시간 플롯. 특수 금-미세전극 플레이트를 20μg/mL 콜라겐 유형 1로 코팅했습니다. HUVEC은 1.0 x 104 cells/well의 밀도로 파종되었습니다. ZIKV P6-740 (MOI: 0.1, 1)을 감염에 사용하였다. 하늘색: ZIKV P6-740 (MOI: 0.1); 파란색: ZIKV P6-740 (MOI: 1); 흑색: 양성 대조군으로서의 트롬빈(20U/mL); 갈색: 부정적인 감염 통제. 각 데이터 포인트는 평균을 나타내며 세 배로 분석되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 전기 바이오 센서 임피던스 기반 RTCA에 사용되는 기술에 대한 개략도. 웰 플레이트의 측면도; 우물 바닥에는 금도금 된 음극 및 양극 단자가 있습니다. 기기가 전기를 전도할 수 있는 배양 배지가 포함된 마이크로웰에서 CI를 측정하면 전자가 음극에서 양극 단자로 흐릅니다. 블랭크 컨트롤일 때 전자 흐름이 매끄럽기 때문에 임피던스가 기록되지 않습니다. 세포가 파종되고 점점 더 많은 세포가 우물 바닥에 부착됨에 따라 전자 흐름의 임피던스가 존재하고 컴퓨터에 의해 기록됩니다. 이 임피던스 값을 사용하여 기기는 이를 CI 값으로 변환하여 웰 바닥에 부착된 셀 수(접착력)를 나타냅니다. BioRender로 제작. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
관대한 세포에서의 세포제 바이러스 감염은 일반적으로 세포 형태 및 생합성의 상당한 변화와 관련이 있다36. 세포 수축, 세포 확대 및/또는 세포융합 형성과 같은 바이러스에 의한 세포 형태학적 변화는 세포병증 효과(cytopathic effect, CPE)라고도 하며, 특정 바이러스 감염에 특징적이다37. EC에서, CPE는 세포의 파괴 및 각 EC 사이의 단단한 접합부의 파괴로 설명되었으며, 따라서 내피 장벽(38,39)의 파괴를 유발했다. HUVEC의 CPE는 단층 세포 분리 및 조직 배양 용기에서 떠다니는 것으로 설명할 수 있습니다. 부착 세포의 분리 및 부유와 같은 감염된 세포 형태학적 변화는 RTCA 방법을 사용하여 지속적으로 검출할 수 있습니다. 이 기술은 최대 몇 초마다 실시간으로 셀을 모니터링할 수 있는 전기 임피던스를 기반으로 합니다. 이를 통해 세포 증식, 형태학적 변화를 정량화할 수 있으며, HUVEC의 경우 자극 시 내피 무결성 및 세포 장벽 기능(40)의 변화를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.
이 연구에서 중요한 단계는 96웰 저항판을 사용하는 실험 설정입니다. 이는 분석기의 모든 연결부가 플레이트에 잘 연결되도록 하기 위한 것입니다. RTCA에서, 측정된 임피던스 값은 세포 수의 차이를 구별하기 위해 CI 값으로 변환됩니다., 접착도, 세포 형태, 및 세포 생존율41. RTCA 분석기에 의해 기록된 임피던스의 감소는 CI 값의 감소로 해석되며, 세포 수의 감소, 접착 정도가 약해지고, 세포 형태학의 상당한 변화를 시사한다(42). 따라서 RTCA 실험에 사용할 세포주와 최적의 세포 수의 적합성을 테스트하는 것도 중요합니다. RTCA 시스템을 사용하여 셀에 대한 테스트를 실행하기 전에 원하는 CI 지수를 달성할 수 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 또한 RTCA 시스템이 선택된 세포 유형의 세포 성장 및 세포 사멸 프로파일을 모니터링하는 데 적합한지 여부를 결정하는 데 도움이 됩니다. 본 연구에서는 HUVEC이 0.1 및 1의 MOI에서 ZIKV P6-740에 감염되었을 때 CI 값의 급격한 감소가 관찰되었습니다. CI 값의 급격한 하락은 감염 후 HUVEC 세포 형태학적 변화가 발생했음을 시사하며, 이로 인해 단단한 접합부와 EC 혈관 무결성이 중단되었습니다.
종래, 시험관 내 세포의 바이러스 감염에 의해 유발되는 CPE는 감염된 세포의 현미경 관찰에 기초하여 추정된다. 추가적으로, 플라크 분석법과 같은 일부 다른 분석법은 CPE의 시각화(예컨대, 세포 분리)를 허용하고, CPE의 범위를 측정하는데 사용된다(42). 그러나 이러한 방법은 세포 형태학적 변화(종말점 분석)의 개별 시점에 대한 정보만 제공한다는 점에서 한계가 있습니다. 면역형광 염색과 같은 다른 분석법은 형태학적 변화를 시각화하기 위해 형광단으로 표지된 특이적 항체의 조합에 의존한다43. 면역형광 분석은 주어진 조직 또는 세포 유형에서 많은 성분을 시각화할 수 있는 광범위한 기능을 가지고 있지만, 이 기술은 바이러스 감염 중 실시간 모니터링 및 검출을 허용하지 않습니다. 대조적으로, RTCA 시스템은 바이러스 감염 중 실시간 세포 형태학적 변화를 기록하여 종말점 분석에서 놓칠 수 있는 일시적인 혈관 누출과 같은 일시적인 효과를 포착할 수 있습니다. 예를 들어, 종말점 분석은 60 HPI, 80 HPI 및 100 HPI의 데이터 및 형태학적 변화를 감지하지 못합니다. RTCA 외에도 경상피 전기 저항(TEER) 측정은 세포 간 상호 작용을 모니터링하는 데 일반적으로 사용되는 또 다른 방법입니다., 세포 단층 전체의 전기 저항이 측정되는 곳. 그러나 TEER은 살아있는 세포 활동을 모니터링하기 위해 시간이 지남에 따라 여러 번 반복된 측정이 필요하며 한 번에 더 적은 수의 샘플 또는 웰에서 수행되는 경우가 많습니다. 결과적으로, TEER은 전형적으로 RTCA에 비해 처리량이 낮으며, 이는 최대 96개의 웰을 동시에 실행할 수 있다(44).
이러한 장점에도 불구하고 RTCA 시스템에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. RTCA 시스템의 주요 한계는 고가의 장비와 소모품입니다. RTCA 시스템에 의해 사용되는 특수 금-미세전극 플레이트는 상대적으로 비싸고, 일회용이며, 일회용이다45. 또한, 세포 형태학적 변화는 레코더(카메라)에서 이미지화하고 캡처할 수 없으며, 분석은 바이러스 항원의 축적 또는 HUVECs46의 VE-cadherin과 같은 세포 표면 단백질의 변화를 포착할 수 없습니다. 결과적으로, RTCA는 질병 발병 기전을 밝히기 위해 추가적인 유용한 정보를 제공할 수 있는 세포 형태학적 변화를 시각화할 수 없습니다. 분석 또는 모델 설정 중에 HUVEC에 대한 VE-cadherin 염색과 같은 추가 염색 검증은 얻은 측정값을 검증하는 데 유용합니다. 또한 RTCA 시스템은 임피던스를 기록하기 위해 웰 바닥에 세포를 부착해야 하기 때문에 부착 세포주로 제한됩니다. 그러므로, 보고된 분석은 비부착성 세포주(46)에 대해 사용될 수 없다.
결론적으로, RTCA 기기를 사용하여 ZIKV 감염 시 내피 세포의 변화를 96-well 형식으로 모니터링하는 실시간 세포 분석 프로토콜을 설명했습니다. 이 방법은 세포 형태학적 변화를 실시간으로 지속적으로 모니터링하기 위한 비침습적 및 비표지 집약적 접근 방식을 허용한다는 점에서 기존 종말점 분석에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 이 분석은 또한 다른 실험 설정에서 다른 세포주의 혈관 무결성 변화를 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 서로 상충되는 이해관계가 없다고 선언한다.
Acknowledgments
이 연구는 HICoE(Higher Institution Centre of Excellence) 프로그램(MO002-2019)에 따라 말레이시아 고등교육부의 지원을 받았으며 장기 연구 보조금 제도(LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018)에 따라 자금을 지원받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Nest | 615601 | |
| 37 °C incubator with 5% CO2 | Sanyo | MCO-18AIC | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning | 430725U | |
| Antibiotic solution penicillin-streptomycin (P/S) | Sciencell | 0503 | |
| Biological safety cabinet, Class II | Holten | HB2448 | |
| Collagen Type 1 | SIgma-Aldrich | C3867 | |
| Endothelial cell growth supplement (ECGS) | Sciencell | 1052 | |
| Endothelial cell medium (ECM) | Sciencell | 1001 | |
| E-plate 96 | Agilent Technologies, Inc. | 05232368001 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sciencell | 0025 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | H9394 | |
| Hemocytometer | Laboroptik LTD | Neubauer improved | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) | Sciencell | 8000 | |
| Inverted microscope | ZEISS | TELAVAL 31 | |
| Latitude 3520 Laptop | Dell | - | |
| Multichannel micropipette (10 - 100 µL) | Eppendorf | 3125000036 | |
| Multichannel micropipette (30 - 300 µL) | Eppendorf | 3125000052 | |
| Reagent reservior | Tarsons | T38-524090 | |
| RTCA resistor plate 96 | Agilent Technologies, Inc. | 05232350001 | |
| RTCA Software Pro (Version 2.6.1) | Agilent Technologies, Inc. | 5454433001 | |
| Single channel pipettes (10 - 100 µL) | Eppendorf | 3123000047 | |
| Single channel pipettes (100 - 1000 µL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Single channel pipettes (20 - 200 µL) | Eppendorf | 3123000055 | |
| xCELLigence Real-time cell analyzer SP (Model: W380) | Agilent Technologies, Inc. | 00380601030 | https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232 |
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