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Biology

Monitorando Alterações em Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana após Infecção Viral Usando Análise Celular em Tempo Real Baseada em Impedância

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/64887
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

Summary

O presente estudo descreve um protocolo para monitorar as alterações nas células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) durante a infecção viral usando um sistema de análise celular em tempo real (RTCA).

Abstract

As células endoteliais revestem a superfície interna de todos os vasos sanguíneos e linfáticos, criando uma barreira semipermeável que regula a troca de fluidos e solutos entre o sangue ou a linfa e seus tecidos circundantes. A capacidade de um vírus atravessar a barreira endotelial é um importante mecanismo que facilita a disseminação do vírus no corpo humano. Muitos vírus são relatados para alterar a permeabilidade endotelial e/ou causar ruptura da barreira celular endotelial durante a infecção, o que é capaz de causar extravasamento vascular. O presente estudo descreve um protocolo de análise celular em tempo real (RTCA), usando um analisador celular comercial em tempo real para monitorar a integridade endotelial e as mudanças de permeabilidade durante a infecção pelo vírus Zika (ZIKV) das células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). Os sinais de impedância registrados antes e após a infecção pelo VZIK foram traduzidos para valores de índice celular (IC) e analisados. O protocolo RTCA permite a detecção de efeitos transitórios na forma de alterações morfológicas celulares durante uma infecção viral. Este ensaio também pode ser útil para estudar alterações na integridade vascular de HUVECs em outros arranjos experimentais.

Introduction

As células endoteliais (CE) revestem a superfície interna de todos os vasos sanguíneos e linfáticos. Estão conectados por aderentes, tight gap junctions, criando uma barreira semipermeável entre o sangue ou a linfa e os tecidos circundantes 1,2. As junções célula-célula endotelial intactas são críticas para regular o transporte de macromoléculas, solutos e fluidos, cruciais para as atividades fisiológicas dos tecidos e órgãoscorrespondentes3. A barreira endotelial é dinâmica e modulada por estímulosespecíficos4. A ruptura ou perda da função da barreira endotelial é uma característica da fisiopatologia da doença na inflamação aguda e crônica na patogênese de muitasdoenças5,6,7, incluindo a infecção viral8,9,10,11. Para os flavivírus, verificou-se que a proteína não estrutural NS1 pode alterar a permeabilidade endotelial, por exemplo, via ruptura da camada glicocálice endotelial-símile, como resultado do aumento da expressão e ativação da catepsina L, sialidases e endoglicosidase heparinase9. No estado de doença, a integridade da monocamada endotelial é afetada e as junções célula-célula são rompidas, o que pode levar à lesão e disfunção endotelial12 e, eventualmente, manifestações patológicas disseminadas em múltiplos sistemas orgânicos13,14. A infecção viral das CE resulta em alterações nas vias de sinalização celular e no perfil de expressão gênica celular, que podem afetar as funções de barreira de fluidos, causar ruptura das CE e induzir extravasamento vascular 10,15. Descobriu-se que a infecção das CE pelo vírus Zika (VZIK) interrompe a integridade juncional que causa alterações na permeabilidade vascular e leva à disfunção da barreira endotelial, resultando em extravasamento vascular10,15. Estudos mostraram que o VZIK está ligado a defeitos congênitos graves; no entanto, pouco se sabe sobre o mecanismo exato pelo qual isso ocorre16,17. Compreender as alterações da barreira endotelial durante uma infecção é, portanto, fundamental para entender o mecanismo da doença.

As CEs são atualmente utilizadas como um importante sistema experimental modelo vascular in vitro para diversos processos fisiológicos e patológicos 18,19,20,21. As células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) têm sido extensivamente utilizadas como sistema celular primário não imortalizado para estudar o endotélio vascular e a biologia vascular in vitro 22,23,24,25. As HUVECs foram isoladas pela primeira vez para cultivo in vitro no início da década de 1970 a partir da veia umbilical do cordão umbilical humano26. Os HUVECs têm uma morfologia semelhante a um paralelepípedo que é facilmente feita para proliferar em laboratório. Devido à tensão de cisalhamento após ser mantida por longos períodos no estado confluente, observa-se alongamento da forma celular. As HUVECs podem ser caracterizadas pela presença de corpos de Weibel e Palade (WPB), vesículas pinocíticas, pequenas quantidades de fibrilas localizadas próximas ao núcleo, mitocôndrias com formas tubulares que raramente apresentam ramificações, núcleo elipsoide com fino padrão granular de cromatina condensada e um a três nucléolos presentes em cadanúcleo27. Embora os HUVECs apresentem numerosas características morfológicas, a identificação dos HUVECs não pode ser obtida apenas pelo exame óptico. Ensaios como a coloração por imunofluorescência do endotélio vascular (VE)-caderina, são comumente utilizados para a monitorização da integridade vascular em HUVECs 28,29,30,31.

Este estudo descreve o protocolo de análise celular em tempo real (ATR) da infecção de HUVECs. O sistema RTCA utiliza placas especializadas revestidas a ouro contendo microeletrodos que fornecem uma superfície condutora para a fixação celular. Quando as células se ligam à superfície do microeletrodo, uma barreira que impede o fluxo de elétrons através dos microeletrodos é formada. A medida da impedância gerada pelos microeletrodos pode ser utilizada para obter informações sobre alguns processos celulares, incluindo a fixação celular, proliferação e migração32. O ensaio relatado é um ensaio celular baseado em impedância que, juntamente com um analisador celular em tempo real, fornece medição contínua da proliferação de células vivas, mudanças morfológicas (como encolhimento celular) e qualidade da ligação celular de forma não invasiva e livre de marcação. Neste estudo, o analisador celular em tempo real é usado para monitorar a integridade endotelial e as alterações morfológicas das HUVECs durante a infecção pelo ZIKV. Resumidamente, o instrumento mede o fluxo de elétrons transmitidos em placas especializadas de microtitulação revestidas com microeletrodos de ouro na presença de um meio de cultura (solução eletricamente condutora). A aderência celular ou alterações no número e morfologia celular perturbam o fluxo de elétrons e causam variações de impedância que podem ser captadas pelo instrumento (Figura 1 Suplementar). A diferença entre o crescimento, proliferação e aderência do HUVEC antes e após a infecção pelo VZIK é registrada em tempo real por um sinal de impedância elétrica e, em seguida, traduzida para o valor do índice celular (IC). O valor de IC da pré-infecção é usado como linha de base para a normalização do valor de IC. As alterações nos valores de IC refletem alterações morfológicas celulares ou perda de aderência celular com a infecção33. Os resultados do estudo mostram que o protocolo RTCA permite a detecção de efeitos transitórios ou alterações morfológicas celulares durante a infecção viral em comparação com um ensaio final, como a coloração de imunofluorescência da VE-caderina. O método RTCA pode ser útil para analisar as alterações da integridade vascular do HUVEC quando da infecção por outros vírus.

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Protocol

1. Preparação celular

  1. Preparação de HUVECs
    1. Cultivar 7,5 x 105 células HUVEC/mL em um frasco de cultura celular de 75cm2 (revestido com 20 μg/mL de colágeno tipo 1) contendo 12 mL de meio de células endoteliais (MEC) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), 0,01% de suplemento de crescimento de células endoteliais (ECGS) que contém fatores de crescimento, hormônios e proteínas necessários para a cultura de HUVECs, e penicilina-estreptomicina a 0,01% (P/S). Incubar as células em estufa de cultura celular a 37 °C com CO2 a 5% (Figura 1).

2. Configuração do experimento RTCA

  1. Verificação de resistor executado em RTCA
    1. Clique duas vezes no ícone do software RTCA na área de trabalho para iniciar o aplicativo. Uma janela de login aparecerá, digite o nome de usuário e senha para fazer login.
    2. Coloque uma placa resistora RTCA de 96 poços com o poço A1 voltado para dentro na estação RTCA localizada na incubadora de cultura celular.
    3. Na guia Exp Notes do software RTCA, digite o nome do experimento, o SN do dispositivo e o tipo de dispositivo (placa QC).
    4. Na guia Layout na guia Célula do software RTCA, realce todos os poços e clique com o botão direito do mouse nos poços destacados para garantir que todos os poços estejam ligados (acinzentados).
    5. Na guia Agenda do software RTCA, clique em Step_1. Digite Varreduras: 10 e Intervalo: 30 s. Clique em Aplicar. Clique em Iniciar/Continuar no canto superior esquerdo do software para iniciar a execução de verificação.
      NOTA: Certifique-se de que a conexão dos poços à estação RTCA está correta, observando "Placa digitalizada. Connections OK" na parte inferior da página.
  2. Execução de verificação de resistor para análise de dados
    1. Na guia Índice de Células , verifique os dados após a conclusão da execução. Todos os valores de IC devem ser menores que 0,063.
    2. Na parte inferior da guia Índice de Células , verifique os dados brutos da varredura. Os dados brutos de varredura devem exibir padrões de valores repetidos de 40,0 ± 2,0 (linhas A e H), 67,5 ± 2,5 (linhas B e G), 93,6 ± 2,9 (linhas C e F) e 117,6 ± 3,2 (linhas D e E).
    3. Para interromper a execução da verificação, clique em Placa > Placa de Liberação. A placa resistora RTCA de 96 poços está agora pronta para ser removida da estação RTCA.
  3. Obtendo leitura de fundo no RTCA
    1. Lavar a placa especializada de microeletrodos de ouro revestida com colágeno tipo 1 (revestida com 20 μg/mL de colágeno tipo 1) com 60 μL/poço de solução salina balanceada de Hank (HBSS; com bicarbonato de sódio, sem cloreto de cálcio e sulfato de magnésio) 2x.
    2. Descarte o HBSS restante e adicione 50 μL/poço de MEC. Coloque a placa especializada de microeletrodos de ouro contendo MEC com o poço A1 voltado para dentro na estação RTCA localizada na incubadora de cultura celular.
    3. Na guia Notas Exp do software RTCA, digite o nome do experimento, o SN do dispositivo e o tipo de dispositivo (formato de 96 poços).
    4. Na guia Layout , na guia Célula do software RTCA, destaque os poços que serão usados e clique com o botão direito do mouse nos poços destacados para garantir que todos os poços estejam ligados (esmaecidos).
    5. Na guia Agenda do software RTCA, clique em Step_1 e clique em Iniciar/Continuar no canto superior esquerdo do software para obter uma leitura em segundo plano.
      OBS: Verifique se a conexão dos poços está correta, observando "Placa digitalizada. Connections OK" na parte inferior da página.
    6. Uma vez obtida a leitura de fundo, a placa especializada de microeletrodo de ouro está pronta para a semeadura celular e pronta para ser removida da estação RTCA.
  4. Preparação de HUVEC na placa especializada de microeletrodo de ouro
    1. Semeando as HUVECs na placa especializada de microeletrodo de ouro com 50 μL/poço de meio condicionado, 1 x 104 células/poço (meio condicionado: MEC suplementada com 10% SFB, 0,01% ECGS e 0,01% P/S). Coloque a placa de volta na estação RTCA com o poço A1 voltado para dentro para incubação noturna em uma incubadora de cultura celular a 37 °C com 5% de CO2.
      NOTA: A contagem de células foi realizada na suspensão celular com fator de diluição de dois utilizando um hemocitômetro.
    2. Na guia Agendar, clique em Adicionar uma Etapa no canto superior esquerdo. Clique em Step_2 e altere as Varreduras: 601 e Intervalo: 2 min. Clique em Step_2 e clique em Iniciar/Continuar no canto superior esquerdo do software.
    3. Após 20 h de incubação e quando os valores de IC na guia Gráfico de Poço mostram um platô, a placa está pronta para infecção. Na guia Agenda do software RTCA, clique em Etapa de Anulação.
    4. A placa especializada de microeletrodo de ouro está agora pronta para ser removida da estação RTCA para etapas subsequentes.

3. Infecção viral em HUVECs

  1. Diluição do vírus
    1. A cultura de estoque ZIKV é mantida a -80 °C. Para este estudo, remova o estoque de vírus mantido nos frascos criogênicos e dilua o estoque de VZIK com MEC livre de soro em tubos centrífugos de 1,5 mL para obter multiplicidade de infecções (MOIs) de 0,1 e 1.
      NOTA: O estoque de ZIKV foi previamente preparado por meio de propagação em células Vero e colheita do sobrenadante ZIKV34.
  2. Infecção da monocamada celular
    1. Remover e descartar o meio condicionado (ECM suplementado com 10% FBS, 0,01% ECGS e 0,01% P/S) de cada poço. Enxaguar cada poço com 60 μL de HBSS 2x. Inserir o HBSS com o auxílio da lateral do poço; Não dispare a monocamada celular.
    2. Trabalhando da diluição mais alta para a mais baixa, adicione 40 μL de cada amostra de vírus diluída em ECM sem soro no poço. Triplicar o poço para cada diluição e manter seis poços sem infecção (controle negativo e controle positivo trombina). Não dispare a monocamada celular; Em vez disso, adicione o vírus diluído com a ajuda do lado do poço. Use uma ponta de pipeta fresca para cada inserção.
      OBS: A trombina foi escolhida como controle positivo por poder aumentar rapidamente a permeabilidade endotelial das HUVECs.
    3. Incubar a placa numa incubadora de cultura celular a 37 °C com 5% de CO2 para permitir a adsorção do vírus. Espalhe a placa 5x a cada 15 min para permitir a adsorção do vírus em toda a monocamada celular.
  3. Adição do meio de cultura celular de sobreposição
    1. Após 1 h de incubação, remova e descarte a suspensão do vírus da menor concentração para a mais alta.
    2. Lavar as células infectadas com 60 μL de HBSS 2x. Sobreponha o poço com ECM suplementado com SFB a 2%. Para os poços de controle positivo, diluir a trombina a 20 U/mL com MEC suplementada com SFB a 2% e sobrepor os poços com meio de MEC contendo trombina. Não dispare a monocamada celular; em vez disso, adicione mídia de sobreposição com a ajuda do lado do poço.
  4. Colocação da placa especializada em microeletrodo de ouro infectada de volta na estação RTCA
    1. Na guia Agendar, clique em Adicionar uma Etapa no canto superior esquerdo. Clique em Step_3 e altere as Varreduras: 3.601 e Intervalo: 2 min.
    2. Clique em OK na janela pop-up exibida. Coloque a placa de microeletrodo de ouro especializado infectado com o poço A1 voltado para dentro na estação RTCA localizada na incubadora de cultura celular.
    3. Clique em Step_3 e clique em Iniciar/Continuar no canto superior esquerdo do software.

4. Análise de dados e exportação de dados

  1. Adição de informações experimentais de cada poço
    1. Na guia Layout , clique na guia Cell (Figura 2A). Para inserir as informações da célula de destino e determinar o tipo de poço para cada poço, realce o poço e digite o nome, o número e a cor da célula de destino na parte inferior do software. Clique em Aplicar (Figura 2B).
    2. Para selecionar e determinar o tipo de poço para cada poço na guia Célula , realce o poço, selecione o tipo de poço (amostra, controle positivo ou controle negativo) e clique em Definir.
    3. Na guia Layout , clique na guia Tratamento (Figura 2C). Para inserir informações de tratamento, destaque o poço e o tipo no nome do tratamento, concentração de tratamento, unidade e cor. Clique em Aplicar (Figura 2D).
    4. Para selecionar e determinar o tipo de poço para cada poço na guia Tratamento , realce o poço, selecione o tipo de poço (amostra, controle positivo ou controle negativo) e clique em Definir.
      NOTA: Para cada seleção, vários poços podem ser destacados ao mesmo tempo.
  2. Normalização do valor do IC
    1. Clique com o botão direito do mouse à direita da guia Análise de dados e selecione Índice de células normalizado na caixa suspensa Eixo Y (Figura 3A). Na seção Eixo X na parte inferior, selecione o tempo normalizado como o último ponto de tempo medido onde a placa especializada de microeletrodo de ouro foi removida para infecção (Figura 3B).
      NOTA: O processo de normalização realizado pelo software remove a maior parte da variabilidade devido às diferenças na semeadura e fixação do poço, desde que o ponto de normalização escolhido seja antes da adição do vírus e/ou tratamento. Assim, o ponto de tempo ideal de normalização deve ser o último ponto de tempo antes da adição do vírus e/ou do tratamento. O ponto de tempo para normalizar pode ser verificado na guia Agenda em Step_2. O tempo total indicado é o tempo para normalizar (Figura 3C).
  3. Plotagem dos dados obtidos utilizando o software RTCA
    1. Na guia Análise de dados , selecione os poços a serem adicionados ao gráfico destacando os poços e clicando << em Adicionar. O índice de célula normalizado em relação ao gráfico de tempo agora está pronto para ser copiado e exportado. Certifique-se de marcar a caixa de seleção Média .
  4. Exportando dados usando o software RTCA
    1. No canto superior esquerdo do software RTCA, clique em Placa > Exportar Informações do Experimento.... Marque a caixa para selecionar os dados a serem exportados. Clique em OK.
      Observação : dados brutos (valores de CI brutos) podem ser exportados quando o índice de célula > tudo está marcado.
    2. Selecione a pasta para salvar o arquivo de exportação. Clique em SALVAR. Uma janela pop-up aparecerá indicando a exportação de informações experimentais. Quando a exportação estiver concluída, outra janela aparecerá indicando que as informações do experimento exportado estão prontas para serem visualizadas.

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Representative Results

Antes da infecção pelo ZIKV, o IC registrado para a monocamada HUVEC cultivada em uma placa de microtitulação revestida com microeletrodo de ouro era superior a 8, sugerindo fortes propriedades de aderência. Placas ou poços com índice de IC menor que 8 devem ser descartados. Os HUVECs foram então infectados com ZIKV em um MOI de 0,1 e 1, e a impedância celular foi registrada por 7 dias. O valor de IC dos HUVECs infectados com ZIKV P6-740 em um MOI de 0,1 (linha azul clara) começou a cair em 15 h pós-infecção (HPI), em comparação com o controle de infecção negativo (linha marrom; Gráfico 4). Quanto aos HUVECs infectados com uma dose maior de ZIKV P6-740 em um MOI de 1 (linha azul), o valor de IC começou a cair já em 11 HPI. No 24 HPI, houve uma queda de 5% e 7% no valor normalizado do IC (0,949, 0,929) quando as CE foram infectadas com ZIKV em um MOI de 0,1 e 1, respectivamente. Uma redução de 50% no valor normalizado de IC foi registrada em 96 HPI e em 66,75 HPI após a infecção pelo ZIKV em um MOI de 0,1 e 1, respectivamente. O valor normalizado do IC atingiu seu ponto mais baixo em 107 HPI, onde houve uma redução de 51% e 60% (0,4915, 0,3984) com a infecção pelo VZIK em um MOI de 0,1 e 1, respectivamente. O valor normalizado do IC apresentou um aumento de 4% e 13% a partir de 107 HPI até o final do experimento em 168 HPI (0,5128, 0,4571). A linha preta mostra os efeitos da trombina utilizada como controle positivo, onde os valores de IC permaneceram baixos durante todo o experimento, mimetizando a ruptura das tight junctions, e induziram extravasamento vascular35.

Figure 1
Figura 1: Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). A figura está em ampliação de 40x para visualizar a taxa de confluência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Capturas de tela da guia Célula e Tratamento na guia Layout do software RTCA. (A) Na guia Layout , clique na guia Célula . (B) Para inserir informações da célula de destino e determinar o tipo de poço para cada poço, realce o poço e digite o nome, o número e a cor da célula de destino na parte inferior do software. Clique em Aplicar. (C) Clique na guia Layout na guia Tratamento (D) Para inserir informações de tratamento, destaque o poço e digite o nome do tratamento, concentração de tratamento, unidade e cor. Clique em Aplicar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Capturas de tela da guia Análise de dados no software RTCA para normalização do índice de células. (A) Na caixa suspensa Eixo Y , selecione Índice de Célula Normalizado. (B) Na seção Eixo X , selecione o tempo de normalização. (C) Captura de tela da guia Agenda no software RTCA. O tempo de normalização é indicado no tempo total Step_2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Índice celular normalizado versus gráfico de tempo da infecção pelo vírus Zika (ZIKV) em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). A placa especializada em microeletrodo de ouro foi revestida com 20 μg/mL de colágeno tipo 1. As HUVECs foram semeadas a uma densidade de 1,0 x 104 células/poço. ZIKV P6-740 (MOI: 0,1, 1) foi usado para infecção. Azul claro: ZIKV P6-740 (MOI: 0,1); azul: ZIKV P6-740 (MOI: 1); preto: trombina como controle positivo (20 U/mL); marrom: controle de infecção negativo. Cada ponto de dados significa a média e foi analisado em triplicata. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura Suplementar 1: Desenho esquemático da técnica utilizada na ATCR baseada em impedância de biossensor elétrico. Vista lateral da placa do poço; No fundo dos poços há terminais negativos e positivos banhados a ouro. Como o instrumento mede o IC no micropoço que contém meios de cultura que permitem conduzir eletricidade, o elétron flui do terminal negativo para o positivo. Quando é um controle em branco, o fluxo de elétrons é suave, portanto, nenhuma impedância é registrada. Quando as células são semeadas, e à medida que mais e mais células se ligam ao fundo do poço, a impedância no fluxo de elétrons está presente e é registrada pelo computador. Usando esse valor de impedância, o instrumento o converte em um valor de IC, indicando o número de células aderidas ao fundo do poço (adesão). Criado com BioRender. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

A infecção viral citocida em células permissivas geralmente está associada a alterações substanciais na morfologia celular e na biossíntese36. As alterações morfológicas celulares induzidas pelo vírus, como encolhimento celular, aumento celular e/ou formação de sincícios, também são conhecidas como efeitos citopáticos (EPCs), característicos de certas infecções virais37. Nas CE, o ECP foi descrito como a destruição das células e quebra das tight junctions entre cada CE, causando a quebra da barreira endotelial38,39. Os EPCs em HUVECs podem ser descritos como descolamento celular de monocamada e flutuação do vaso de cultura de tecidos. As alterações morfológicas celulares infectadas, como desprendimento e flutuação das células aderentes, podem ser continuamente detectadas pelo método RTCA. Essa técnica é baseada na impedância elétrica, que permite o monitoramento das células em tempo real até a cada poucos segundos. Permite quantificar a proliferação celular, alterações morfológicas e, no caso das HUVECs, pode ser utilizado para monitorar alterações na integridade endotelial e na função de barreira celular40 após estimulação.

Neste estudo, a etapa crítica é a montagem do experimento, onde a placa resistora de 96 poços é utilizada. Isso é para garantir que todas as conexões do analisador estejam bem conectadas à placa. Na ATR, o valor de impedância medido é convertido como valor de IC para diferenciar as diferenças no número celular, grau de adesão, morfologia celular e viabilidade celular41. A queda da impedância registrada pelo analisador de ATR, que se traduz em queda no valor do IC, sugere número reduzido de células, menor grau de adesão e alterações substanciais na morfologia celular42. Portanto, também é importante testar a adequação das linhagens celulares e o número ótimo de células a serem utilizadas no experimento de ATR. É fundamental determinar se o índice CI desejado pode ser alcançado antes da execução do teste nas células usando o sistema RTCA. Além disso, isso também ajuda a determinar se o sistema RTCA é adequado para monitorar o crescimento celular e perfis de morte celular de tipos celulares selecionados. Em nosso estudo, uma queda acentuada nos valores de IC foi observada quando HUVECs foram infectados com ZIKV P6-740 em MOI de 0,1 e 1. A queda acentuada no valor de IC, portanto, sugere que as alterações morfológicas celulares de HUVEC ocorreram após a infecção, e isso levou à ruptura das tight junctions e da integridade vascular da CE.

Convencionalmente, as CPEs causadas pela infecção viral de células in vitro são estimadas com base na observação microscópica das células infectadas. Além disso, alguns outros ensaios, como o ensaio de placa, permitem a visualização de CPEs (como o descolamento celular) e são usados para medir a extensão das CPEs42. No entanto, esses métodos têm limitações na medida em que fornecem apenas informações sobre pontos de tempo discretos das alterações morfológicas celulares (ensaios finais). Outros ensaios, como a coloração por imunofluorescência, dependem de combinações de anticorpos específicos marcados com fluoróforo para visualizar as alterações morfológicas43. Embora o ensaio de imunofluorescência tenha uma ampla capacidade que permite a visualização de muitos componentes em qualquer tecido ou tipo celular, essa técnica não permite o monitoramento e a detecção em tempo real durante a infecção viral. Em contraste, o sistema RTCA registra as mudanças morfológicas celulares em tempo real durante a infecção viral, permitindo a captura de efeitos transitórios, como extravasamento vascular transitório, que poderiam ser perdidos por ensaios de desfecho. Por exemplo, os ensaios de endpoint falhariam em detectar os dados e as alterações morfológicas tão cedo quanto 60 HPI, 80 HPI e 100 HPI. Além do RTCA, a medição da resistência elétrica transepitelial (TEER) é outro método comumente usado para monitorar interações célula-célula, onde a resistência elétrica através da monocamada celular é medida. No entanto, o TEER requer várias medições repetidas ao longo do tempo para monitorar as atividades de células vivas e é frequentemente realizado em um número menor de amostras ou poços de cada vez. Como resultado, o TEER normalmente tem menor rendimento em comparação com o RTCA, que pode executar até 96 poços simultaneamente44.

Apesar de seus benefícios, o sistema RTCA apresenta várias limitações. A principal limitação do sistema RTCA são os equipamentos e consumíveis dispendiosos. As placas especializadas de microeletrodos de ouro utilizadas pelo sistema RTCA são relativamente caras, de uso único e descartáveis45. Além disso, as alterações morfológicas celulares não podem ser imageadas e capturadas em um gravador (câmera), nem o ensaio pode capturar o acúmulo do antígeno viral ou alterações na proteína de superfície celular, como a VE-caderina em HUVECs46. Como resultado, a ATR não consegue visualizar as alterações morfológicas celulares que forneceriam informações úteis adicionais para elucidar a patogênese da doença. Durante o estabelecimento do ensaio ou modelo, a verificação de coloração adicional, como a coloração de VE-caderina para HUVECs, seria útil para validar as medidas obtidas. Além disso, o sistema RTCA é limitado a linhagens celulares aderentes, pois requer a fixação de células no fundo dos poços para que a impedância seja registrada. Portanto, o ensaio relatado não pode ser usado para linhagens celulares não aderentes46.

Em conclusão, descrevemos um protocolo de análise celular em tempo real usando o instrumento RTCA para monitorar mudanças nas células endoteliais após a infecção pelo ZIKV no formato de 96 poços. Este método oferece várias vantagens em relação aos ensaios convencionais de desfecho, na medida em que permite uma abordagem intensiva não invasiva e não rotulada para monitorar continuamente as mudanças morfológicas celulares em tempo real. Este ensaio também pode ser usado para analisar alterações na integridade vascular de outras linhagens celulares em diferentes arranjos experimentais.

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Disclosures

Os autores declaram não ter interesses concorrentes.

Acknowledgments

Esta pesquisa recebeu apoio do Ministério do Ensino Superior da Malásia no âmbito do programa do Centro de Excelência da Instituição Superior (HICoE) (MO002-2019) e financiamento sob o Esquema de Bolsas de Pesquisa de Longo Prazo (LRGS MRUN Fase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Nest 615601
37 °C incubator with 5% CO2 Sanyo MCO-18AIC
75 cm2 tissue culture flask  Corning 430725U
Antibiotic solution penicillin-streptomycin (P/S) Sciencell 0503
Biological safety cabinet, Class II Holten HB2448
Collagen Type 1 SIgma-Aldrich C3867
Endothelial cell growth supplement (ECGS) Sciencell 1052
Endothelial cell medium (ECM) Sciencell 1001
E-plate 96 Agilent Technologies, Inc. 05232368001
Fetal bovine serum (FBS) Sciencell 0025
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma-Aldrich H9394
Hemocytometer Laboroptik LTD Neubauer improved
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) Sciencell 8000
Inverted microscope ZEISS TELAVAL 31
Latitude 3520 Laptop Dell  -
Multichannel micropipette (10 - 100 µL) Eppendorf 3125000036
Multichannel micropipette (30 - 300 µL) Eppendorf 3125000052
Reagent reservior Tarsons T38-524090
RTCA resistor plate 96 Agilent Technologies, Inc. 05232350001
RTCA Software Pro (Version 2.6.1) Agilent Technologies, Inc. 5454433001
Single channel pipettes (10 - 100 µL) Eppendorf 3123000047
Single channel pipettes (100 - 1000 µL) Eppendorf 3123000063
Single channel pipettes (20 - 200 µL) Eppendorf 3123000055
xCELLigence Real-time cell analyzer SP (Model: W380) Agilent Technologies, Inc. 00380601030 https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232

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Biologia Edição 195 Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana Infecção Viral Impedância Análise Celular em Tempo Real Células Endoteliais Barreira Troca de Fluidos Troca de Solutos Disseminação de Vírus Permeabilidade Endotelial Ruptura da Barreira Celular Endotelial Extravasamento Vascular Analisador de Células em Tempo Real Infecção pelo Zika Vírus (ZIKV) Índice Celular (IC) Efeitos Transitórios Alterações Morfológicas Celulares Integridade Vascular
Monitorando Alterações em Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana após Infecção Viral Usando Análise Celular em Tempo Real Baseada em Impedância
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Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar, S., Tan, K. K. Monitoring Changes in Human Umbilical Vein Endothelial Cells upon Viral Infection Using Impedance-Based Real-Time Cell Analysis. J. Vis. Exp. (195), e64887, doi:10.3791/64887 (2023).

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