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Surveillance des changements dans les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine lors d’une infection virale à l’aide de l’analyse cellulaire en temps réel basée sur l’impédance

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/64887
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

Summary

La présente étude décrit un protocole permettant de surveiller les changements dans les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) au cours d’une infection virale à l’aide d’un système d’analyse cellulaire en temps réel (RTCA).

Abstract

Les cellules endothéliales tapissent la surface interne de tous les vaisseaux sanguins et lymphatiques, créant une barrière semi-perméable régulant les échanges de fluides et de solutés entre le sang ou la lymphe et leurs tissus environnants. La capacité d’un virus à traverser la barrière endothéliale est un mécanisme important qui facilite la dissémination du virus dans le corps humain. De nombreux virus altèrent la perméabilité endothéliale et/ou provoquent une perturbation de la barrière cellulaire endothéliale pendant l’infection, ce qui peut provoquer des fuites vasculaires. La présente étude décrit un protocole d’analyse cellulaire en temps réel (RTCA), utilisant un analyseur cellulaire commercial en temps réel pour surveiller l’intégrité endothéliale et les changements de perméabilité pendant l’infection par le virus Zika (ZIKV) des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC). Les signaux d’impédance enregistrés avant et après l’infection par le virus Zika ont été traduits en valeurs d’indice cellulaire (IC) et analysés. Le protocole RTCA permet de détecter des effets transitoires sous forme de changements morphologiques cellulaires lors d’une infection virale. Ce test pourrait également être utile pour étudier les changements dans l’intégrité vasculaire des HUVEC dans d’autres configurations expérimentales.

Introduction

Les cellules endothéliales (CE) tapissent la surface interne de tous les vaisseaux sanguins et lymphatiques. Ils sont reliés par des adhérents, des jonctions lacunaires serrées, créant une barrière semi-perméable entre le sang ou la lymphe et les tissus environnants 1,2. Les jonctions cellule-cellule endothéliale intactes sont essentielles pour réguler le transport des macromolécules, des solutés et des fluides, ce qui est crucial pour les activités physiologiques des tissus et organes correspondants3. La barrière endothéliale est dynamique et modulée par des stimuli spécifiques4. La perturbation ou la perte de la fonction de barrière endothéliale est une caractéristique de la physiopathologie de la maladie dans l’inflammation aiguë et chronique dans la pathogenèse de nombreuses maladies 5,6,7, y compris l’infection virale 8,9,10,11. Pour les flavivirus, il a été constaté que la protéine non structurale NS1 peut modifier la perméabilité endothéliale, par exemple, via une perturbation de la couche endothéliale de type glycocalyx en raison de l’augmentation de l’expression et de l’activation de la cathepsine L, des sialidaides et de l’endoglycosidase héparinase9. À l’état pathologique, l’intégrité de la monocouche endothéliale est affectée et les jonctions cellule-cellule sont perturbées, ce qui peut entraîner des lésions et des dysfonctionnements endothéliaux12 et, éventuellement, des manifestations pathologiques généralisées dans plusieurs systèmes d’organes 13,14. L’infection virale des CE entraîne des modifications des voies de signalisation cellulaire et du profil d’expression des gènes cellulaires, ce qui peut affecter les fonctions de barrière liquidienne, provoquer une perturbation des CE et induire des fuites vasculaires10,15. Il a été démontré que l’infection par le virus Zika (ZIKV) des CE perturbe l’intégrité jonctionnelle qui provoque des changements dans la perméabilité vasculaire et entraîne un dysfonctionnement de la barrière endothéliale, entraînant des fuites vasculaires10,15. Des études ont montré que le virus Zika est lié à de graves malformations congénitales ; Cependant, on ne sait pas grand-chose sur le mécanisme exact par lequel cela se produit16,17. Il est donc essentiel de comprendre les changements de la barrière endothéliale au cours d’une infection pour comprendre le mécanisme de la maladie.

Les CE sont actuellement utilisées comme un important système modèle vasculaire expérimental in vitro pour divers processus physiologiques et pathologiques 18,19,20,21. Les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) ont été largement utilisées comme système cellulaire primaire non immortalisé pour étudier l’endothélium vasculaire et la biologie vasculaire in vitro 22,23,24,25. Les HUVEC ont été isolés pour la première fois pour la culture in vitro au début des années 1970 à partir de la veine ombilicale du cordon ombilical humain26. Les HUVEC ont une morphologie en forme de pavé qui se fait facilement proliférer en laboratoire. En raison de la contrainte de cisaillement après avoir été maintenue pendant de longues périodes à l’état confluent, un allongement de la forme de la cellule est observé. Les HUVEC peuvent être caractérisés par la présence de corps de Weibel et de Palade (WPB), de vésicules pinocytaires, de petites quantités de fibrilles situées près du noyau, de mitochondries de formes tubulaires qui présentent rarement des ramifications, un noyau ellipsoïde avec un fin motif granulaire de chromatine condensée et un à trois nucléoles présents dans chaque noyau27. Bien que les HUVEC présentent de nombreuses caractéristiques morphologiques, l’identification des HUVEC ne peut être réalisée par le seul examen optique. Des dosages, tels que la coloration par immunofluorescence de l’endothélium vasculaire (VE)-cadhérine, sont couramment utilisés pour la surveillance de l’intégrité vasculaire dans les HUVEC 28,29,30,31.

Cette étude décrit le protocole d’analyse cellulaire en temps réel (RTCA) de l’infection des HUVEC. Le système RTCA utilise des plaques spécialisées recouvertes d’or contenant des microélectrodes qui fournissent une surface conductrice pour la fixation de la cellule. Lorsque les cellules se fixent à la surface de la microélectrode, une barrière qui empêche le flux d’électrons à travers les microélectrodes se forme. La mesure de l’impédance générée par les microélectrodes peut être utilisée pour obtenir des informations sur certains processus cellulaires, notamment les attachements cellulaires, la prolifération et la migration32. Le test rapporté est un test cellulaire basé sur l’impédance qui, couplé à un analyseur de cellules en temps réel, fournit une mesure continue de la prolifération des cellules vivantes, des changements morphologiques (tels que le rétrécissement cellulaire) et de la qualité de l’attachement cellulaire de manière non invasive et sans marquage. Dans cette étude, l’analyseur cellulaire en temps réel est utilisé pour surveiller l’intégrité endothéliale et les changements morphologiques des HUVEC pendant l’infection par le virus Zikv. En bref, l’instrument mesure le flux d’électrons transmis dans des plaques de microtitration spécialisées recouvertes de microélectrodes d’or en présence d’un milieu de culture (solution conductrice d’électricité). L’adhérence cellulaire ou les changements dans le nombre et la morphologie des cellules perturbent le flux d’électrons et provoquent des variations d’impédance qui peuvent être capturées par l’instrument (Figure supplémentaire 1). La différence entre la croissance, la prolifération et l’observance du HUVEC avant et après l’infection par le virus Zika est enregistrée en temps réel par un signal d’impédance électrique, puis traduite en valeur d’indice cellulaire (IC). La valeur de l’IC de la pré-infection est utilisée comme base de référence pour la normalisation de la valeur de l’IC. Les changements dans les valeurs de l’IC reflètent des changements morphologiques cellulaires ou une perte d’adhérence cellulaire lors de l’infection33. Les résultats de l’étude montrent que le protocole RTCA permet de détecter des effets transitoires ou des changements morphologiques cellulaires au cours d’une infection virale par rapport à un test final, tel que la coloration par immunofluorescence de la VE-cadhérine. La méthode RTCA pourrait être utile pour analyser les changements de l’intégrité vasculaire HUVEC lors d’une infection par d’autres virus.

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Protocol

1. Préparation des cellules

  1. Préparation des HUVEC
    1. Cultiver 7,5 x 105 cellules HUVEC/mL dans un flacon de culture cellulaire de 75cm2 (enrobé de 20 μg/mL de collagène de type 1) contenant 12 mL de milieu de cellules endothéliales (MEC) complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 0,01 % de supplément de croissance de cellules endothéliales (ECGS) contenant des facteurs de croissance, des hormones et des protéines nécessaires à la culture de HUVEC, et 0,01 % de pénicilline-streptomycine (P/S). Incuber les cellules dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO2 (Figure 1).

2. Mise en place de l’expérience RTCA

  1. Vérification de la résistance exécutée sur RTCA
    1. Double-cliquez sur l’icône du logiciel RTCA sur le bureau pour lancer l’application. Une fenêtre de connexion apparaîtra, tapez le nom d’utilisateur et le mot de passe pour vous connecter.
    2. Placez une plaque de résistance RTCA à 96 puits avec le puits A1 orienté vers l’intérieur dans la station RTCA située dans l’incubateur de culture cellulaire.
    3. Dans l’onglet Exp Notes du logiciel RTCA, tapez le nom de l’expérience, le numéro de série de l’appareil et le type d’appareil (plaque de contrôle qualité).
    4. Dans l’onglet Mise en page sous l’onglet Cellule du logiciel RTCA, mettez en surbrillance tous les puits et cliquez avec le bouton droit de la souris sur les puits en surbrillance pour vous assurer que tous les puits sont activés (grisés).
    5. Dans l’onglet Planification du logiciel RTCA, cliquez sur Step_1. Entrez les balayages : 10 et l’intervalle : 30 s. Cliquez sur Appliquer. Cliquez sur Démarrer/Continuer dans le coin supérieur gauche du logiciel pour lancer l’exécution de la vérification.
      REMARQUE : Assurez-vous que la connexion des puits à la station RTCA est correcte en observant « Plaque balayée. Connexions OK » en bas de la page.
  2. Exécution de vérification de la résistance pour l’analyse des données
    1. Dans l’onglet Index des cellules , vérifiez les données à la fin de l’exécution. Toutes les valeurs de l’IC doivent être inférieures à 0,063.
    2. Dans la partie inférieure de l’onglet Index des cellules , vérifiez les données brutes de numérisation. Les données brutes de numérisation doivent présenter des modèles de valeurs répétées de 40,0 ± 2,0 (rangées A et H), 67,5 ± 2,5 (lignes B et G), 93,6 ± 2,9 (lignes C et F) et 117,6 ± 3,2 (lignes D et E).
    3. Pour arrêter l’exécution de la vérification, cliquez sur Plaque > Plaque de dégagement. La plaque de résistance RTCA à 96 puits est maintenant prête à être retirée de la station RTCA.
  3. Obtenir une lecture de fond sur le RTCA
    1. Lavez la plaque de microélectrode d’or spécialisée recouverte de collagène de type 1 (recouverte de 20 μg/mL de collagène de type 1) avec 60 μL/puits de solution saline équilibrée de Hank (HBSS ; avec bicarbonate de sodium, sans chlorure de calcium ni sulfate de magnésium) 2x.
    2. Jeter le reste de l’HBSS et ajouter 50 μL/puits d’ECM. Placez la plaque de microélectrode en or spécialisée contenant l’ECM avec le puits A1 orienté vers l’intérieur dans la station RTCA située dans l’incubateur de culture cellulaire.
    3. Dans l’onglet Exp Notes du logiciel RTCA, tapez le nom de l’expérience, le numéro de série de l’appareil et le type d’appareil (format 96 puits).
    4. Dans l’onglet Mise en page sous l’onglet Cellule du logiciel RTCA, mettez en surbrillance les puits qui seront utilisés et cliquez avec le bouton droit de la souris sur les puits en surbrillance pour vous assurer que tous les puits sont activés (grisés).
    5. Dans l’onglet Planification du logiciel RTCA, cliquez sur Step_1, puis sur Démarrer/Continuer dans le coin supérieur gauche du logiciel pour obtenir une lecture en arrière-plan.
      REMARQUE : Assurez-vous que la connexion des puits est correcte en observant « Plaque balayée. Connexions OK » en bas de la page.
    6. Une fois la lecture de fond obtenue, la plaque de microélectrode d’or spécialisée est maintenant prête pour l’ensemencement des cellules et prête à être retirée de la station RTCA.
  4. Préparation HUVEC dans la plaque de microélectrode d’or spécialisée
    1. Ensemencer les HUVEC dans la plaque de microélectrode d’or spécialisée avec 50 μL/puits de milieu conditionné, 1 x 104 cellules/puits (milieu conditionné : ECM complété par 10 % de FBS, 0,01 % d’ECGS et 0,01 % de P/S). Replacez la plaque dans la station RTCA avec le puits A1 orienté vers l’intérieur pour une incubation de nuit dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO2.
      REMARQUE : Une numération cellulaire a été effectuée sur la suspension cellulaire avec un facteur de dilution de deux à l’aide d’un hémocytomètre.
    2. Dans l’onglet Planification , cliquez sur Ajouter une étape dans le coin supérieur gauche. Cliquez sur Step_2 et modifiez les balayages : 601 et l’intervalle : 2 min. Cliquez sur Appliquer. Cliquez sur Step_2 et cliquez sur Démarrer/Continuer dans le coin supérieur gauche du logiciel.
    3. Après 20 h d’incubation et lorsque les valeurs de l’IC dans l’onglet Well Graph montrent un plateau, la plaque est prête pour l’infection. Dans l’onglet Planification du logiciel RTCA, cliquez sur Étape d’abandon.
    4. La plaque de microélectrode en or spécialisée est maintenant prête à être retirée de la station RTCA pour les étapes suivantes.

3. Infection virale chez les HUVEC

  1. Dilution du virus
    1. La culture souche de ZIKV est maintenue à -80 °C. Pour cette étude, retirer le stock de virus conservé dans les flacons cryogéniques et diluer le stock de virus Zika avec de l’ECM sans sérum dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL pour obtenir une multiplicité d’infections (MOI) de 0,1 et 1.
      NOTA : Le stock de virus Zika a été préalablement préparé en multipliant dans des cellules Vero et en récoltant le surnageant du virus Zika34.
  2. Infection de la monocouche cellulaire
    1. Retirer et jeter le milieu conditionné (ECM complété par 10 % de FBS, 0,01 % d’ECGS et 0,01 % de P/S) de chaque puits. Rincez chaque puits avec 60 μL de HBSS 2x. Insérez le HBSS à l’aide du côté du puits ; Ne tirez pas sur la monocouche de cellule.
    2. En travaillant de la dilution la plus élevée à la plus faible, ajoutez 40 μL de chaque échantillon de virus dilué dans une MEC sans sérum dans le puits. Triplicer le puits pour chaque dilution et maintenir six puits sans infection (thrombine témoin négative et thrombine témoin positive). Ne tirez pas sur la monocouche de cellules ; Au lieu de cela, ajoutez le virus dilué à l’aide du côté du puits. Utilisez un embout de pipette neuf pour chaque insertion.
      REMARQUE : La thrombine a été choisie comme témoin positif car elle peut augmenter rapidement la perméabilité endothéliale des HUVEC.
    3. Incuber la plaque dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO2 pour permettre l’adsorption du virus. Agitez la plaque 5 fois toutes les 15 minutes pour permettre l’adsorption du virus dans toute la monocouche cellulaire.
  3. Ajout du milieu de culture cellulaire de recouvrement
    1. Après 1 h d’incubation, retirez et jetez la suspension virale de la concentration la plus faible à la plus élevée.
    2. Laver les cellules infectées avec 60 μL de HBSS 2x. Recouvrir le puits d’ECM complété par 2 % de FBS. Pour les puits témoins positifs, diluer la thrombine à 20 U/mL avec de l’ECM additionnée de 2 % de FBS, et recouvrir les puits d’un milieu ECM contenant de la thrombine. Ne tirez pas sur la monocouche de cellules ; Au lieu de cela, ajoutez un média de recouvrement à l’aide du côté du puits.
  4. Repositionnement de la plaque de microélectrode d’or spécialisée infectée dans la station RTCA
    1. Dans l’onglet Planification , cliquez sur Ajouter une étape dans le coin supérieur gauche. Cliquez sur Step_3 et modifiez les balayages : 3 601 et l’intervalle : 2 min. Cliquez sur Appliquer.
    2. Cliquez sur OK dans la fenêtre contextuelle qui s’affiche. Placez la plaque de microélectrode en or spécialisée infectée avec le puits A1 tourné vers l’intérieur dans la station RTCA située dans l’incubateur de culture cellulaire.
    3. Cliquez sur Step_3 et cliquez sur Démarrer/Continuer dans le coin supérieur gauche du logiciel.

4. Analyse des données et exportation des données

  1. Ajout d’informations expérimentales pour chaque puits
    1. Dans l’onglet Layout (Mise en page ), cliquez sur l’onglet Cell (Cellule) (Figure 2A). Pour entrer les informations de la cellule cible et déterminer le type de puits pour chaque puits, mettez en surbrillance le puits et tapez le nom, le numéro et la couleur de la cellule cible en bas du logiciel. Cliquez sur Apply (Appliquer ) (Figure 2B).
    2. Pour sélectionner et déterminer le type de puits pour chaque puits dans l’onglet Cellule , mettez le puits en surbrillance, sélectionnez le type de puits (échantillon, témoin positif ou contrôle négatif), puis cliquez sur Définir.
    3. Dans l’onglet Layout (Mise en page ), cliquez sur l’onglet Treatment (Traitement (Figure 2C). Pour saisir les informations sur le traitement, mettez en surbrillance le puits et saisissez le nom du traitement, la concentration du traitement, l’unité et la couleur. Cliquez sur Apply (Appliquer ) (Figure 2D).
    4. Pour sélectionner et déterminer le type de puits pour chaque puits dans l’onglet Traitement , mettez le puits en surbrillance, sélectionnez le type de puits (échantillon, témoin positif ou témoin négatif), puis cliquez sur Définir.
      REMARQUE : Pour chaque sélection, plusieurs puits peuvent être mis en surbrillance en même temps.
  2. Normalisation de la valeur de l’IC
    1. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur la droite de l’onglet Analyse des données et sélectionnez Index des cellules normalisées dans la liste déroulante Axe Y (Figure 3A). Dans la section Axe X en bas, sélectionnez le temps normalisé comme dernier point de temps mesuré où la plaque de microélectrode en or spécialisée a été retirée pour cause d’infection (Figure 3B).
      REMARQUE : Le processus de normalisation effectué par le logiciel élimine la majeure partie de la variabilité due aux différences d’ensemencement et de fixation des puits, à condition que le point de normalisation choisi soit avant l’ajout du virus et/ou du traitement. Par conséquent, le point de temps optimal de normalisation devrait être le dernier point de temps avant l’ajout du virus et/ou du traitement. Le point temporel à normaliser peut être vérifié dans l’onglet Planification sous Step_2. Le temps total indiqué est le point temporel à normaliser (Figure 3C).
  3. Tracé des données obtenues à l’aide du logiciel RTCA
    1. Dans l’onglet Analyse des données , sélectionnez les puits à ajouter dans le graphique en les mettant en surbrillance et en cliquant << Ajouter. L’index de cellule normalisé par rapport au graphique temporel est maintenant prêt à être copié et exporté. Assurez-vous de cocher la case Moyenne .
  4. Exportation de données à l’aide d’un logiciel RTCA
    1. Dans le coin supérieur gauche du logiciel RTCA, cliquez sur Plaque > Exporter les informations sur l’expérience.... Cochez la case pour sélectionner les données à exporter. Cliquez sur OK.
      REMARQUE : Les données brutes (valeurs CI brutes) peuvent être exportées lorsque l’option Index de cellule > Tout est cochée.
    2. Sélectionnez le dossier dans lequel enregistrer le fichier d’exportation. Cliquez sur ENREGISTRER. Une fenêtre contextuelle apparaîtra indiquant l’exportation des informations expérimentales. Une fois l’exportation terminée, une autre fenêtre s’affiche indiquant que les informations de l’expérience exportées sont prêtes à être affichées.

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Representative Results

Avant l’infection par le virus Zika, l’IC enregistré pour la monocouche HUVEC cultivée sur une plaque de microtitration spécialisée recouverte de microélectrodes d’or était supérieur à 8, ce qui suggère de fortes propriétés d’adhérence. Les plaques ou les puits dont l’indice IC est inférieur à 8 doivent être jetés. Les HUVEC ont ensuite été infectés par le virus Zika à un moment d’inertie de 0,1 et 1, et l’impédance cellulaire a été enregistrée pendant 7 jours. La valeur de l’IC des HUVEC infectés par le virus Zikv P6-740 à un moment d’inertie de 0,1 (ligne bleu clair) a commencé à baisser 15 h après l’infection (HPI), par rapport au témoin d’infection négatif (ligne brune ; Graphique 4). En ce qui concerne les HUVEC infectés par une dose plus élevée de ZIKV P6-740 à un moment d’inertie de 1 (ligne bleue), la valeur de l’IC a commencé à baisser dès 11 HPI. À 24 HPI, il y a eu une baisse de 5 % et de 7 % de la valeur normalisée de l’IC (0,949, 0,929) lorsque les EC ont été infectés par le virus Zika à un moment d’inertie de 0,1 et 1, respectivement. Une réduction de 50 % de la valeur normalisée de l’IC a été enregistrée à 96 HPI et à 66,75 HPI lors de l’infection par le virus Zika à un moment d’inertie de 0,1 et 1, respectivement. La valeur normalisée de l’IC a atteint son point le plus bas à 107 HPI, où il y a eu une réduction de 51 % et 60 % (0,4915, 0,3984) lors de l’infection par le virus Zika à un moment d’inertie de 0,1 et 1, respectivement. La valeur normalisée de l’IC a augmenté de 4 % et de 13 % à partir de 107 HPI jusqu’à la fin de l’expérience à 168 HPI (0,5128, 0,4571). La ligne noire montre les effets de la thrombine utilisée comme témoin positif, où les valeurs de l’IC sont restées faibles tout au long de l’expérience, imitant la perturbation des jonctions serrées, et induisant une fuite vasculaire35.

Figure 1
Figure 1 : Cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC). La figure est en grossissement 40x pour visualiser le taux de confluence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Captures d’écran de l’onglet Cellule et traitement sous l’onglet Mise en page du logiciel RTCA. (A) Dans l’onglet Mise en page, cliquez sur l’onglet Cellule. (B) Pour entrer des informations sur la cellule cible et déterminer le type de puits pour chaque puits, mettez le puits en surbrillance et tapez le nom, le numéro et la couleur de la cellule cible en bas du logiciel. Cliquez sur Appliquer. (C) Cliquez sur l’onglet Mise en page sous l’onglet Traitement. (D) Pour entrer des informations sur le traitement, mettez en surbrillance le puits et tapez le nom du traitement, la concentration du traitement, l’unité et la couleur. Cliquez sur Appliquer. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Captures d’écran de l’onglet Analyse des données du logiciel RTCA pour la normalisation de l’index des cellules. (A) Dans la liste déroulante Axe Y, sélectionnez Index de cellule normalisé. (B) Dans la section Axe X, sélectionnez le temps de normalisation. (C) Capture d’écran de l’onglet Planification dans le logiciel RTCA. Le temps de normalisation est indiqué au Step_2 temps total. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Indice cellulaire normalisé en fonction du tracé temporel de l’infection par le virus Zika (ZIKV) dans les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC). La plaque de microélectrode en or spécialisée a été recouverte de 20 μg/mL de collagène de type 1. Les HUVEC ont été ensemencés à une densité de 1,0 x 104 cellules/puits. Le virus Zika P6-740 (MMO : 0,1, 1) a été utilisé pour traiter l’infection. Bleu clair : ZIKV P6-740 (moment d’inertie : 0,1) ; bleu : ZIKV P6-740 (MOI : 1) ; noir : thrombine comme témoin positif (20 U/mL) ; Marron : contrôle négatif de l’infection. Chaque point de données correspond à la moyenne et a été analysé en trois exemplaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Dessin schématique de la technique utilisée dans le RTCA basé sur l’impédance des biocapteurs électriques. Une vue latérale de la plaque du puits ; Au fond des puits, il y a des bornes négatives et positives plaquées or. Au fur et à mesure que l’instrument mesure l’IC dans le micropuits qui contient un milieu de culture qui permet de conduire l’électricité, l’électron circule de la borne négative vers la borne positive. Lorsqu’il s’agit d’un contrôle vierge, le flux d’électrons est régulier, donc aucune impédance n’est enregistrée. Lorsque les cellules sont ensemencées, et que de plus en plus de cellules se fixent au fond du puits, l’impédance dans le flux d’électrons est présente et enregistrée par l’ordinateur. À l’aide de cette valeur d’impédance, l’instrument la convertit en une valeur CI, indiquant le nombre de cellules attachées au fond du puits (adhérence). Créé avec BioRender. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

L’infection virale cytocide dans les cellules permissives est généralement associée à des changements substantiels dans la morphologie cellulaire et la biosynthèse36. Les changements morphologiques cellulaires induits par le virus, tels que le rétrécissement cellulaire, l’élargissement cellulaire et/ou la formation de syncytia, sont également connus sous le nom d’effets cytopathiques (EPC), caractéristiques de certaines infections virales37. Dans les CE, l’EPC a été décrite comme la destruction des cellules et la rupture des jonctions serrées entre chaque CE, provoquant ainsi la rupture de la barrière endothéliale38,39. Les CPE dans les HUVEC peuvent être décrits comme un détachement cellulaire monocouche et un flottement à partir du récipient de culture tissulaire. Les changements morphologiques des cellules infectées, tels que le détachement et le flottement des cellules adhérentes, peuvent être détectés en continu à l’aide de la méthode RTCA. Cette technique est basée sur l’impédance électrique, ce qui permet de surveiller les cellules en temps réel jusqu’à quelques secondes d’intervalle. Il permet de quantifier la prolifération cellulaire, les changements morphologiques et, dans le cas des HUVEC, il peut être utilisé pour surveiller les changements dans l’intégrité endothéliale et la fonction de barrière cellulaire40 lors de la stimulation.

Dans cette étude, l’étape critique est la mise en place de l’expérience, où la plaque de résistance à 96 puits est utilisée. Cela permet de s’assurer que toutes les connexions de l’analyseur sont bien connectées à la plaque. Dans le RTCA, la valeur d’impédance mesurée est convertie en valeur IC pour différencier les différences de nombre de cellules, de degrés d’adhérence, de morphologie cellulaire et de viabilité cellulaire41. La baisse de l’impédance enregistrée par l’analyseur RTCA, qui se traduit par une baisse de la valeur de l’IC, suggère un nombre de cellules réduit, un degré d’adhésion plus faible et des changements substantiels dans la morphologie cellulaire42. Par conséquent, il est également important de tester l’adéquation des lignées cellulaires et le nombre optimal de cellules à utiliser dans l’expérience RTCA. Il est essentiel de déterminer si l’indice d’IC souhaité peut être atteint avant l’exécution des tests sur les cellules à l’aide du système RTCA. De plus, cela permet également de déterminer si le système RTCA est adapté pour surveiller les profils de croissance et de mort cellulaire de certains types de cellules. Dans notre étude, une forte baisse des valeurs de l’IC a été observée lorsque les HUVEC ont été infectés par le ZIKV P6-740 à des MMO de 0,1 et 1. La forte baisse de la valeur de l’IC, suggérant ainsi que des changements morphologiques cellulaires HUVEC se sont produits après l’infection, ce qui a conduit à la perturbation des jonctions serrées et de l’intégrité vasculaire de l’EC.

Classiquement, les CPE provoqués par l’infection virale des cellules in vitro sont estimés sur la base de l’observation microscopique des cellules infectées. De plus, d’autres tests, tels que le test de plaque, permettent de visualiser les CPE (tels que le détachement cellulaire) et sont utilisés pour mesurer l’étendue des CPEs42. Cependant, ces méthodes ont des limites en ce sens qu’elles ne fournissent des informations que sur des points temporels discrets des changements morphologiques cellulaires (tests de paramètres). D’autres essais, tels que la coloration par immunofluorescence, reposent sur des combinaisons d’anticorps spécifiques marqués avec un fluorophore pour visualiser les changements morphologiques43. Bien que le test d’immunofluorescence ait une large capacité qui permet de visualiser de nombreux composants dans un tissu ou un type de cellule donné, cette technique ne permet pas de surveiller et de détecter en temps réel pendant l’infection virale. En revanche, le système RTCA enregistre les changements morphologiques cellulaires en temps réel au cours de l’infection virale, ce qui permet de capturer les effets transitoires, tels que les fuites vasculaires transitoires, qui pourraient être manqués par les tests de paramètres. Par exemple, les tests de paramètres ne parviendraient pas à détecter les données et les changements morphologiques dès 60 HPI, 80 HPI et 100 HPI. En plus du RTCA, la mesure de la résistance électrique transépithéliale (TEER) est une autre méthode couramment utilisée pour surveiller les interactions de cellule à cellule, où la résistance électrique à travers la monocouche cellulaire est mesurée. Cependant, le TEER nécessite plusieurs mesures répétées au fil du temps afin de surveiller les activités des cellules vivantes et est souvent effectué sur un plus petit nombre d’échantillons ou de puits à la fois. Par conséquent, le TEER a généralement un débit inférieur à celui du RTCA, qui peut exploiter jusqu’à 96 puits simultanément44.

Malgré ses avantages, le système RTCA présente plusieurs limites. La principale limite du système RTCA est le coût élevé de l’équipement et des consommables. Les plaques de microélectrodes en or spécialisées utilisées par le système RTCA sont relativement coûteuses, à usage unique et jetables45. De plus, les changements morphologiques cellulaires ne peuvent pas être imagés et capturés sur un enregistreur (caméra), et le test ne peut pas non plus capturer l’accumulation de l’antigène du virus ou les changements dans la protéine de surface cellulaire, comme la VE-cadhérine dans les HUVEC46. Par conséquent, le RTCA ne peut pas visualiser les changements morphologiques cellulaires qui fourniraient des informations supplémentaires utiles pour élucider la pathogenèse de la maladie. Lors de l’essai ou de l’établissement du modèle, une vérification supplémentaire de la coloration, telle que la coloration de la VE-cadhérine pour les HUVEC, serait utile pour valider les mesures obtenues. De plus, le système RTCA est limité aux lignées cellulaires adhérentes, car il nécessite la fixation de cellules au fond des puits pour que l’impédance soit enregistrée. Par conséquent, le test rapporté ne peut pas être utilisé pour les lignées cellulaires non adhérentes46.

En conclusion, nous avons décrit un protocole d’analyse cellulaire en temps réel utilisant l’instrument RTCA pour surveiller les changements dans les cellules endothéliales lors d’une infection par le virus Zika dans un format à 96 puits. Cette méthode offre plusieurs avantages par rapport aux tests conventionnels, en ce sens qu’elle permet une approche non invasive et non intensive pour surveiller en continu les changements morphologiques cellulaires en temps réel. Ce test peut également être utilisé pour analyser les changements d’intégrité vasculaire d’autres lignées cellulaires dans différentes configurations expérimentales.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Acknowledgments

Cette recherche a reçu le soutien du ministère de l’Enseignement supérieur de Malaisie dans le cadre du programme Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) (MO002-2019) et un financement dans le cadre du programme de subventions de recherche à long terme (LRGS MRUN Phase 1 : LRGS MRUN/F1/01/2018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Nest 615601
37 °C incubator with 5% CO2 Sanyo MCO-18AIC
75 cm2 tissue culture flask  Corning 430725U
Antibiotic solution penicillin-streptomycin (P/S) Sciencell 0503
Biological safety cabinet, Class II Holten HB2448
Collagen Type 1 SIgma-Aldrich C3867
Endothelial cell growth supplement (ECGS) Sciencell 1052
Endothelial cell medium (ECM) Sciencell 1001
E-plate 96 Agilent Technologies, Inc. 05232368001
Fetal bovine serum (FBS) Sciencell 0025
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma-Aldrich H9394
Hemocytometer Laboroptik LTD Neubauer improved
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) Sciencell 8000
Inverted microscope ZEISS TELAVAL 31
Latitude 3520 Laptop Dell  -
Multichannel micropipette (10 - 100 µL) Eppendorf 3125000036
Multichannel micropipette (30 - 300 µL) Eppendorf 3125000052
Reagent reservior Tarsons T38-524090
RTCA resistor plate 96 Agilent Technologies, Inc. 05232350001
RTCA Software Pro (Version 2.6.1) Agilent Technologies, Inc. 5454433001
Single channel pipettes (10 - 100 µL) Eppendorf 3123000047
Single channel pipettes (100 - 1000 µL) Eppendorf 3123000063
Single channel pipettes (20 - 200 µL) Eppendorf 3123000055
xCELLigence Real-time cell analyzer SP (Model: W380) Agilent Technologies, Inc. 00380601030 https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232

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Biologie Numéro 195 Cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine Infection virale Analyse cellulaire en temps réel Cellules endothéliales Barrière Échange de fluides Échange de solutés Dissémination de virus Perméabilité endothéliale Perturbation de la barrière cellulaire endothéliale Fuite vasculaire Analyseur de cellules en temps réel Infection par le virus Zika (ZIKV) Indice cellulaire (IC) Effets transitoires Changements morphologiques cellulaires Intégrité vasculaire
Surveillance des changements dans les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine lors d’une infection virale à l’aide de l’analyse cellulaire en temps réel basée sur l’impédance
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Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar, S., Tan, K. K. Monitoring Changes in Human Umbilical Vein Endothelial Cells upon Viral Infection Using Impedance-Based Real-Time Cell Analysis. J. Vis. Exp. (195), e64887, doi:10.3791/64887 (2023).

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