Summary
Bu çalışma, gerçek zamanlı hücre analizi (RTCA) sistemi kullanarak viral enfeksiyon sırasında insan umbilikal ven endotel hücrelerindeki (HUVEC'ler) değişiklikleri izlemek için bir protokol açıklamaktadır.
Abstract
Endotel hücreleri, tüm kan ve lenfatik damarların iç yüzeyini kaplayarak, kan veya lenf ile çevresindeki dokular arasında sıvı ve çözünen madde değişimini düzenleyen yarı geçirgen bir bariyer oluşturur. Bir virüsün endotel bariyerini geçme yeteneği, virüsün insan vücudunda yayılmasını kolaylaştıran önemli bir mekanizmadır. Birçok virüsün endotel geçirgenliğini değiştirdiği ve/veya enfeksiyon sırasında endotel hücre bariyerinin bozulmasına neden olduğu ve bunun da vasküler sızıntıya neden olabileceği bildirilmektedir. Bu çalışma, insan göbek damarı endotel hücrelerinin (HUVEC'ler) Zika virüsü (ZIKV) enfeksiyonu sırasında endotel bütünlüğünü ve geçirgenlik değişikliklerini izlemek için ticari bir gerçek zamanlı hücre analizörü kullanan gerçek zamanlı bir hücre analizi (RTCA) protokolünü açıklamaktadır. ZIKV enfeksiyonu öncesi ve sonrası kaydedilen empedans sinyalleri hücre indeksi (CI) değerlerine çevrildi ve analiz edildi. RTCA protokolü, viral bir enfeksiyon sırasında hücre morfolojik değişiklikleri şeklinde geçici etkilerin saptanmasına izin verir. Bu test, diğer deney düzeneklerinde HUVEC'lerin vasküler bütünlüğündeki değişiklikleri incelemek için de yararlı olabilir.
Introduction
Endotel hücreleri (EC'ler) tüm kan ve lenfatik damarların iç yüzeyini kaplar. Kan veya lenf ile çevre dokulararasında yarı geçirgen bir bariyer oluşturan aderenler, sıkı boşluk bağlantıları ile bağlanırlar 1,2. Sağlam endotel hücre-hücre bağlantıları, karşılık gelen doku ve organların fizyolojik aktiviteleri için çok önemli olan makromoleküllerin, çözünen maddelerin ve sıvıların taşınmasını düzenlemek için kritik öneme sahiptir3. Endotel bariyeri dinamiktir ve spesifik uyaranlarlamodüle edilir 4. Endotel bariyeri fonksiyonunun bozulması veya kaybı, viral enfeksiyon 8,9,10,11 dahil olmak üzere birçok hastalığın5,6,7 patogenezinde akut ve kronik inflamasyonda hastalık patofizyolojisinin ayırt edici bir özelliğidir. Flavivirüsler için, yapısal olmayan protein NS1'in, örneğin katepsin L, sialidaz ve endoglikozidazheparinaz 9'un artan ekspresyonu ve aktivasyonunun bir sonucu olarak endotelyal glikokaliks benzeri tabakanın bozulması yoluyla endotel geçirgenliğini değiştirebileceği bulunmuştur. Hastalık durumunda, endotel tek tabakasının bütünlüğü etkilenir ve hücre-hücre bağlantıları bozulur, bu da endotel hasarına ve işlev bozukluğuna12 ve sonunda çoklu organ sistemlerinde yaygın patolojik belirtilereyol açabilir 13,14. EC'lerin viral enfeksiyonu, hücre sinyal yolaklarında ve hücresel gen ekspresyon profilinde sıvı bariyer fonksiyonlarını etkileyebilen, EC'lerin bozulmasına neden olabilen ve vasküler sızıntıya neden olabilen değişikliklere neden olur10,15. EC'lerin Zika virüsü (ZIKV) enfeksiyonunun, vasküler geçirgenlikte değişikliklere neden olan ve endotel bariyeri disfonksiyonuna yol açan ve vasküler sızıntıya neden olan eklem bütünlüğünü bozduğu bulunmuştur10,15. Çalışmalar, ZIKV'nin ciddi doğum kusurlarıyla bağlantılı olduğunu göstermiştir; Bununla birlikte, bunun gerçekleştiği kesin mekanizma hakkında pek bir şey bilinmemektedir 16,17. Bu nedenle, bir enfeksiyon sırasında endotel bariyeri değişikliklerini anlamak, hastalık mekanizmasını anlamak için kritik öneme sahiptir.
EC'ler şu anda çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçler için önemli bir deneysel in vitro vasküler model sistem olarak kullanılmaktadır 18,19,20,21. İnsan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC'ler), vasküler endotel ve vasküler biyolojiyi in vitroolarak incelemek için birincil, ölümsüzleştirilmemiş bir hücre sistemi olarak yaygın bir şekilde kullanılmıştır 22,23,24,25. HUVEC'ler ilk olarak 1970'lerin başında insan göbek kordonunun göbek damarından in vitro kültür için izole edildi26. HUVEC'ler, laboratuvarda kolayca çoğalması için yapılan parke taşı benzeri bir morfolojiye sahiptir. Birleşme durumunda uzun süre tutulduktan sonra kayma gerilmesi nedeniyle hücre şeklinin uzaması gözlenir. HUVEC'ler, Weibel ve Palade cisimciklerinin (WPB), pinositik veziküllerin, çekirdeğin yakınında bulunan az miktarda fibrillerin, nadiren dallanma gösteren tübüler şekilli mitokondrilerin, ince tanecikli yoğunlaştırılmış kromatin desenine sahip bir elipsoid çekirdeğin ve her çekirdekte bulunan bir ila üç nükleolün varlığı ile karakterize edilebilir27. HUVEC'ler çok sayıda morfolojik özellik göstermesine rağmen, HUVEC'lerin tanımlanması tek başına optik muayene ile sağlanamaz. Vasküler endotelyal (VE)-kaderinin immünofloresan boyaması gibi tahliller, HUVEC'lerde vasküler bütünlüğün izlenmesi için yaygın olarak kullanılır 28,29,30,31.
Bu çalışma, HUVEC'lerin enfeksiyonunun gerçek zamanlı hücre analizi (RTCA) protokolünü açıklamaktadır. RTCA sistemi, hücre bağlantısı için iletken bir yüzey sağlayan mikroelektrotlar içeren özel altın kaplı plakalar kullanır. Hücreler mikroelektrot yüzeyine yapıştığında, mikroelektrotlardan elektron akışını engelleyen bir bariyer oluşur. Mikroelektrotlar tarafından üretilen empedansın ölçümü, hücre ekleri, proliferasyon ve göç dahil olmak üzere bazı hücresel süreçler hakkında bilgi edinmek için kullanılabilir32. Rapor edilen test, gerçek zamanlı bir hücre analizörü ile birleştiğinde, canlı hücre proliferasyonunun, morfoloji değişikliklerinin (hücre küçülmesi gibi) ve hücre bağlanma kalitesinin noninvaziv ve etiketsiz bir şekilde sürekli ölçümünü sağlayan empedans tabanlı bir hücresel testtir. Bu çalışmada, ZIKV enfeksiyonu sırasında HUVEC'lerin endotel bütünlüğünü ve morfolojik değişikliklerini izlemek için gerçek zamanlı hücre analizörü kullanılmıştır. Kısaca cihaz, bir kültür ortamı (elektriksel olarak iletken çözelti) varlığında özel altın-mikroelektrot kaplı mikrotitre plakalarında iletilen elektron akışını ölçer. Hücre yapışması veya hücre sayısı ve morfolojisindeki değişiklikler elektron akışını bozar ve cihaz tarafından yakalanabilen empedans varyasyonlarına neden olur (Ek Şekil 1). ZIKV enfeksiyonundan önce ve sonra HUVEC büyümesi, proliferasyonu ve uyumu arasındaki fark, bir elektrik empedans sinyali ile gerçek zamanlı olarak kaydedilir ve daha sonra hücre indeksi (CI) değerine çevrilir. Enfeksiyon öncesinden alınan CI değeri, CI değeri normalleştirmesi için temel olarak kullanılır. CI değerlerindeki değişiklikler, enfeksiyon üzerine hücresel morfolojik değişiklikleri veya hücre aderans kaybını yansıtır33. Çalışma sonuçları, RTCA protokolünün, VE-kaderinin immünofloresan boyaması gibi bir son nokta testine kıyasla viral enfeksiyon sırasında geçici etkilerin veya hücre morfolojik değişikliklerinin saptanmasına izin verdiğini göstermektedir. RTCA yöntemi, diğer virüsler tarafından enfekte edildikten sonra HUVEC vasküler bütünlük değişikliklerini analiz etmek için yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre hazırlığı
- HUVEC'lerin Hazırlanması
- %10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 12 mL endotel hücre ortamı (ECM) içeren 75cm2 (20 μg/mL kollajen tip 1 ile kaplanmış) hücre kültürü şişesinde 7,5 x 105 HUVEC hücresi/mL büyütün, HUVEC'lerin kültürü için gerekli büyüme faktörleri, hormonlar ve proteinleri içeren %0,01 endotel hücre büyüme takviyesi (EKGS), ve% 0.01 penisilin-streptomisin (P / S). Hücreleri bir hücre kültürü inkübatöründe 37 °C'de% 5 CO2 ile inkübe edin (Şekil 1).
2. RTCA deneyinin kurulumu
- RTCA'da çalışan direnç doğrulama
- Uygulamayı başlatmak için masaüstündeki RTCA yazılım simgesine çift tıklayın. Bir oturum açma penceresi görünecektir, oturum açmak için kullanıcı adını ve şifreyi yazın.
- Hücre kültürü inkübatöründe bulunan RTCA istasyonuna A96 kuyucuğu içe bakacak şekilde 1 oyuklu bir RTCA direnç plakası yerleştirin.
- RTCA yazılımının Exp Notes (Deneyim Notları ) sekmesinde deney adını, cihaz SN'sini ve cihaz tipini (QC plakası) yazın.
- RTCA yazılımının Hücre sekmesi altındaki Düzen sekmesinde, tüm kuyuları vurgulayın ve tüm kuyuların açık olduğundan (gri) emin olmak için vurgulanan kuyulara sağ tıklayın.
- RTCA yazılımının Schedule (Zamanlama ) sekmesinde Step_1 tıklatın. Süpürme: 10 ve Aralık: 30 s'yi girin. Apply (Uygula) seçeneğini tıklayın. Doğrulama çalıştırmasını başlatmak için yazılımın sol üst köşesindeki Başlat/Devam Et'e tıklayın.
NOT: "Plaka Tarandı. Bağlantılar Tamam" sayfanın alt kısmında.
- Veri analizi için direnç doğrulama çalıştırması
- Hücre Dizini sekmesinde, çalıştırmanın tamamlanmasının ardından verileri kontrol edin. Tüm CI değerleri 0,063'ten küçük olmalıdır.
- Hücre Dizini sekmesinin alt kısmında, ham tarama verilerini kontrol edin. Ham tarama verileri, 40,0 ± 2,0 (A ve H satırları), 67,5 ± 2,5 (B ve G satırları), 93,6 ± 2,9 (C ve F satırları) ve 117,6 ± 3,2 (D ve E satırları) yinelenen değer desenleri göstermelidir.
- Doğrulama çalıştırmasını durdurmak için Plaka > Serbest Bırakma Plakası'na tıklayın. 96 kuyulu RTCA direnç plakası artık RTCA istasyonundan çıkarılmaya hazırdır.
- RTCA'da arka plan okuması elde etme
- Kollajen tip 1 kaplı özel altın-mikroelektrot plakasını (20 μg/mL kollajen tip 1 ile kaplanmış) 60 μL/kuyu Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS; sodyum bikarbonat ile, kalsiyum klorür ve magnezyum sülfat olmadan) 2x ile yıkayın.
- Kalan HBSS'yi atın ve 50 μL/kuyucuk ECM ekleyin. ECM içeren özel altın-mikroelektrot plakasını, A1 kuyusu içe bakacak şekilde hücre kültürü inkübatöründe bulunan RTCA istasyonuna yerleştirin.
- RTCA yazılımının Exp Notes sekmesinde deney adını, cihaz SN'sini ve cihaz türünü (96 kuyucuklu format) yazın.
- RTCA yazılımının Hücre sekmesi altındaki Düzen sekmesinde, kullanılacak kuyuları vurgulayın ve tüm kuyuların açık olduğundan (gri) emin olmak için vurgulanan kuyulara sağ tıklayın.
- RTCA yazılımının Zamanlama sekmesinde, Step_1'ye tıklayın ve bir arka plan okuması elde etmek için yazılımın sol üst köşesindeki Başlat/Devam Et'e tıklayın.
NOT: "Plaka Tarandı. Bağlantılar Tamam" sayfanın alt kısmında. - Arka plan okuması elde edildikten sonra, özel altın-mikroelektrot plakası artık hücre tohumlama için hazırdır ve RTCA istasyonundan çıkarılmaya hazırdır.
- Özel altın-mikroelektrot plakasında HUVEC hazırlığı
- HUVEC'leri özel altın-mikroelektrot plakasına 50 μL/kuyucuk şartlandırılmış ortam, 1 x 104 hücre/kuyucuk (şartlandırılmış ortam: %10 FBS, %0.01 EKGS ve %0.01 P/S ile desteklenmiş ECM) ile tohumlayın. %5 CO 2 ile 37 ° C'de bir hücre kültürü inkübatöründe gece inkübasyonu için A1 kuyusu içe bakacak şekilde plakayı tekrar RTCA istasyonunayerleştirin.
NOT: Bir hemositometre kullanılarak iki seyreltme faktörü ile hücre süspansiyonu üzerinde bir hücre sayımı yapıldı. - Zamanlama sekmesinde, sol üst köşedeki Adım Ekle'ye tıklayın. Step_2'e tıklayın ve Süpürmeler: 601 ve Aralık: 2 dk'yı değiştirin. Step_2'e tıklayın ve yazılımın sol üst köşesindeki Başlat/Devam Et'e tıklayın.
- 20 saatlik inkübasyondan sonra ve Kuyu Grafiği sekmesindeki CI değerleri bir plato gösterdiğinde, plaka enfeksiyona hazırdır. RTCA yazılımının Zamanlama sekmesinde Abort Step'i tıklatın.
- Özel altın-mikroelektrot plakası artık sonraki adımlar için RTCA istasyonundan çıkarılmaya hazırdır.
- HUVEC'leri özel altın-mikroelektrot plakasına 50 μL/kuyucuk şartlandırılmış ortam, 1 x 104 hücre/kuyucuk (şartlandırılmış ortam: %10 FBS, %0.01 EKGS ve %0.01 P/S ile desteklenmiş ECM) ile tohumlayın. %5 CO 2 ile 37 ° C'de bir hücre kültürü inkübatöründe gece inkübasyonu için A1 kuyusu içe bakacak şekilde plakayı tekrar RTCA istasyonunayerleştirin.
3. HUVEC'lerde viral enfeksiyon
- Virüs seyreltme
- ZIKV stok kültürü -80 °C'de tutulur. Bu çalışma için, kriyojenik şişelerde tutulan virüs stoğunu çıkarın ve 0,1 ve 1'lik çok sayıda enfeksiyon (MOI) elde etmek için ZIKV stoğunu 1,5 mL santrifüj tüplerinde serumsuz ECM ile seyreltin.
NOT: ZIKV stoğu daha önce Vero hücrelerinde çoğaltma gerçekleştirilerek ve ZIKV süpernatantı34'ün hasat edilmesiyle hazırlanmıştı.
- ZIKV stok kültürü -80 °C'de tutulur. Bu çalışma için, kriyojenik şişelerde tutulan virüs stoğunu çıkarın ve 0,1 ve 1'lik çok sayıda enfeksiyon (MOI) elde etmek için ZIKV stoğunu 1,5 mL santrifüj tüplerinde serumsuz ECM ile seyreltin.
- Hücre tek tabakasının enfeksiyonu
- Her bir oyuktan şartlandırılmış ortamı (%10 FBS, %0.01 EKGS ve %0.01 P/S ile desteklenmiş ECM) çıkarın ve atın. Her birini 60 μL HBSS 2x ile iyice durulayın. HBSS'yi kuyu kenarının yardımıyla yerleştirin; Hücre tek tabakasını çekmeyin.
- En yüksekten en düşüğe doğru çalışarak, serumsuz ECM'de seyreltilmiş her virüs örneğinden 40 μL'yi kuyucuğa ekleyin. Her seyreltme için kuyucuğu üç katına çıkarın ve altı kuyuyu enfeksiyon olmadan koruyun (negatif kontrol ve pozitif kontrol trombin). Hücre tek tabakasını çekmeyin; Bunun yerine, seyreltilmiş virüsü kuyu kenarının yardımıyla ekleyin. Her yerleştirme için yeni bir pipet ucu kullanın.
NOT: Trombin, HUVEC'lerin endotel geçirgenliğini hızla artırabildiği için pozitif kontrol olarak seçilmiştir. - Virüs adsorpsiyonuna izin vermek için plakayı 37 ° C'de% 5 CO2 ile bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. Hücre tek tabakası boyunca virüs adsorpsiyonuna izin vermek için plakayı her 15 dakikada bir 5 kez çevirin.
- Kaplama hücre kültürü ortamının eklenmesi
- 1 saatlik inkübasyondan sonra, virüs süspansiyonunu en düşük konsantrasyondan en yükseğe çıkarın ve atın.
- Enfekte olmuş hücreleri 60 μL HBSS 2x ile yıkayın. Kuyuyu% 2 FBS ile desteklenmiş ECM ile kaplayın. Pozitif kontrol kuyucukları için, trombini %2 FBS ile takviye edilmiş ECM ile 20 U/mL'ye seyreltin ve oyukları trombin içeren ECM ortamı ile kaplayın. Hücre tek tabakasını çekmeyin; Bunun yerine, kuyu kenarının yardımıyla bindirme ortamı ekleyin.
- Enfekte olmuş özel altın-mikroelektrot plakasının RTCA istasyonuna geri yerleştirilmesi
- Zamanlama sekmesinde, sol üst köşedeki Adım Ekle'ye tıklayın. Step_3'e tıklayın ve Süpürmeler: 3.601 ve Aralık: 2 dk. Uygula'yı tıklayın.
- Görüntülenen açılır pencerede Tamam'a tıklayın. Enfekte olmuş özel altın-mikroelektrot plakasını, A1 kuyusu içe bakacak şekilde hücre kültürü inkübatöründe bulunan RTCA istasyonuna yerleştirin.
- Step_3'ye tıklayın ve yazılımın sol üst köşesindeki Başlat/Devam Et'e tıklayın.
4. Veri analizi ve verilerin dışa aktarılması
- Her kuyucuğun deneysel bilgilerinin eklenmesi
- Düzen sekmesinde, Hücre sekmesini tıklatın (Şekil 2A). Hedef hücre bilgilerini girmek ve her kuyu için kuyu tipini belirlemek için kuyuyu vurgulayın ve yazılımın altındaki hedef hücre adını, numarasını ve rengini yazın. Apply (Uygula) öğesine tıklayın (Şekil 2B).
- Hücre sekmesinde her bir kuyu için kuyu tipini seçmek ve belirlemek için, kuyu tipini vurgulayın, kuyu tipini (örnek, pozitif kontrol veya negatif kontrol) seçin ve Ayarla'yı tıklatın.
- Düzen sekmesinde, Tedavi sekmesine tıklayın (Şekil 2C). Tedavi bilgilerini girmek için, kuyuyu ve tedavi adını, tedavi konsantrasyonunu, üniteyi ve rengi vurgulayın. Apply (Uygula) (Uygula) düğmesini tıklatın (Şekil 2D).
- Tedavi sekmesinde her kuyu için kuyu tipini seçmek ve belirlemek için kuyuyu vurgulayın, kuyu tipini seçin (örnek, pozitif kontrol veya negatif kontrol) ve Ayarla'ya tıklayın.
NOT: Her seçim için aynı anda birden fazla kuyu vurgulanabilir.
- CI değerinin normalleştirilmesi
- Veri analizi sekmesinin sağına sağ tıklayın ve Y Ekseni açılır kutusundan Normalleştirilmiş Hücre Dizini'ni seçin (Şekil 3A). Alttaki X Ekseni bölümünde, özel altın-mikroelektrot plakasının enfeksiyon nedeniyle çıkarıldığı son ölçülen zaman noktası olarak normalleştirilmiş zamanı seçin (Şekil 3B).
NOT: Yazılım tarafından gerçekleştirilen normalleştirme işlemi, seçilen normalizasyon noktası virüs ve/veya tedavinin eklenmesinden önce olduğu sürece, kuyu tohumlama ve bağlanmadaki farklılıklardan kaynaklanan değişkenliğin çoğunu ortadan kaldırır. Bu nedenle, optimal normalizasyon zaman noktası, virüs ve/veya tedavi ilavesinden önceki son zaman noktası olmalıdır. Normalleştirilecek zaman noktası, Step_2 altındaki Zamanlama sekmesinden kontrol edilebilir. Belirtilen toplam süre, normalleştirilecek zaman noktasıdır (Şekil 3C).
- Veri analizi sekmesinin sağına sağ tıklayın ve Y Ekseni açılır kutusundan Normalleştirilmiş Hücre Dizini'ni seçin (Şekil 3A). Alttaki X Ekseni bölümünde, özel altın-mikroelektrot plakasının enfeksiyon nedeniyle çıkarıldığı son ölçülen zaman noktası olarak normalleştirilmiş zamanı seçin (Şekil 3B).
- RTCA yazılımı kullanılarak elde edilen verilerin grafiği
- Veri analizi sekmesinde, kuyucukları vurgulayarak ve Ekle'<< tıklayarak grafiğe eklenecek kuyuları seçin. Zaman grafiğine göre normalleştirilmiş hücre dizini artık kopyalanmaya ve dışa aktarılmaya hazırdır. Ortalama onay kutusunu işaretlediğinizden emin olun.
- RTCA yazılımını kullanarak verileri dışa aktarma
- RTCA yazılımının sol üst köşesinde, Plaka > Deney Bilgilerini Dışa Aktar...'a tıklayın. Dışa aktarılacak verileri seçmek için kutuyu işaretleyin. Tamam'a tıklayın.
NOT: Ham veriler (ham CI değerleri), Hücre dizini > Tümü işaretlendiğinde dışa aktarılabilir. - Dışa aktarma dosyasının kaydedileceği klasörü seçin. KAYDET'e tıklayın. Deneysel bilgilerin dışa aktarıldığını gösteren bir açılır pencere görünecektir. Dışa aktarma işlemi tamamlandıktan sonra, dışa aktarılan deneme bilgilerinin görüntülenmeye hazır olduğunu belirten başka bir pencere açılır.
- RTCA yazılımının sol üst köşesinde, Plaka > Deney Bilgilerini Dışa Aktar...'a tıklayın. Dışa aktarılacak verileri seçmek için kutuyu işaretleyin. Tamam'a tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ZIKV enfeksiyonundan önce, özel bir altın-mikroelektrot kaplı mikrotitre plakası üzerinde kültürlenen HUVEC tek tabakası için kaydedilen CI, 8'in üzerindeydi ve bu da güçlü yapışma özelliklerini düşündürüyordu. CI indeksi 8'den az olan plakalar veya oyuklar atılmalıdır. HUVEC'ler daha sonra 0.1 ve 1'lik bir MOI'de ZIKV ile enfekte edildi ve hücre empedansı 7 gün boyunca kaydedildi. ZIKV P6-740 ile enfekte olmuş HUVEC'lerin CI değeri, 0.1'lik bir MOI'de (açık mavi çizgi), negatif enfeksiyon kontrolüne (kahverengi çizgi; Şekil 4). 1 MOI'de (mavi çizgi) daha yüksek dozda ZIKV P6-740 ile enfekte olan HUVEC'lere gelince, CI değeri 11 HPI'de düşmeye başladı. 24 HPI'de, EC'ler sırasıyla 0.1 ve 1'lik bir MOI'de ZIKV ile enfekte olduğunda normalleştirilmiş CI değerinde (0.949, 0.929) %5 ve %7'lik bir düşüş oldu. Normalleştirilmiş CI değerinde, sırasıyla 0.1 ve 1'lik bir MOI'de ZIKV enfeksiyonu üzerine 96 HPI ve 66.75 HPI'de %50'lik bir azalma kaydedildi. Normalize CI değeri, 0.1 ve 1'lik bir MOI'de ZIKV enfeksiyonu üzerine sırasıyla% 51 ve% 60 (0.4915, 0.3984) azalma olduğu 107 HPI'de en düşük noktasına ulaştı. Normalize CI değerinin 107 HPI'dan deney sonuna kadar 168 HPI'da (0.5128, 0.4571) %4 ve %13'lük bir artışa sahip olduğu bulundu. Siyah çizgi, pozitif kontrol olarak kullanılan trombinin etkilerini gösterir, burada CI değerleri deney boyunca düşük kalır, sıkı bağlantıların bozulmasını taklit eder ve indüklenen vasküler sızıntı35.
Şekil 1: İnsan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC'ler). Şekil, birleşme oranını görüntülemek için 40x büyütme boyutundadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: RTCA yazılımındaki Layout sekmesi altındaki Cell and Treatment sekmesinin ekran görüntüleri. (A) Layout (Düzen) sekmesinde, Hücre sekmesini tıklatın. (B) Hedef hücre bilgilerini girmek ve her kuyu için kuyu tipini belirlemek için kuyuyu vurgulayın ve yazılımın altındaki hedef hücre adını, numarasını ve rengini yazın. Apply (Uygula) seçeneğini tıklayın. (C) Tedavi sekmesinin altındaki Düzen sekmesine tıklayın. (D) Tedavi bilgilerini girmek için, kuyuyu vurgulayın ve tedavi adını, tedavi konsantrasyonunu, üniteyi ve rengini yazın. Apply (Uygula) seçeneğini tıklayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Hücre indeksi normalizasyonu için RTCA yazılımındaki Veri Analizi sekmesinin ekran görüntüleri. (A) Y Ekseni açılır kutusunda, Normalleştirilmiş Hücre Dizini'ni seçin. (B) X Ekseni bölümünde normalleştirme süresini seçin. (C) RTCA yazılımındaki Program sekmesinin ekran görüntüsü. Normalleştirme süresi, Step_2 toplam süre olarak gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İnsan göbek damarı endotel hücrelerinde (HUVEC'ler) Zika virüsü (ZIKV) enfeksiyonunun zaman grafiğine karşı normalleştirilmiş hücre indeksi. Özel altın-mikroelektrot plakası 20 μg/mL kollajen tip 1 ile kaplandı. HUVEC'ler 1.0 x 104 hücre/kuyu yoğunluğunda tohumlandı. Enfeksiyon için ZIKV P6-740 (MOI: 0.1, 1) kullanıldı. Açık mavi: ZIKV P6-740 (MOI: 0.1); mavi: ZIKV P6-740 (MOI: 1); siyah: pozitif kontrol olarak trombin (20 U / mL); Kahverengi: Negatif enfeksiyon kontrolü. Her veri noktası ortalamayı ifade eder ve üç nüsha halinde analiz edilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Elektriksel biyosensör empedans tabanlı RTCA'da kullanılan tekniğin şematik çizimi. Kuyu plakasının yandan görünümü; Kuyuların dibinde altın kaplama negatif ve pozitif terminaller vardır. Cihaz, elektriğin iletilmesine izin veren kültür ortamını içeren mikro kuyuda CI'yi ölçerken, elektron negatiften pozitif terminale akar. Boş bir kontrol olduğunda, elektron akışı pürüzsüzdür, dolayısıyla empedans kaydedilmez. Hücreler tohumlandığında ve gittikçe daha fazla hücre kuyunun dibine bağlandıkça, elektron akışındaki empedans bulunur ve bilgisayar tarafından kaydedilir. Bu empedans değerini kullanarak, cihaz onu kuyunun dibine bağlı hücre sayısını (yapışma) gösteren bir CI değerine dönüştürür. BioRender ile oluşturuldu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İzin verilen hücrelerde sitosidal viral enfeksiyon genellikle hücre morfolojisi ve biyosentezindeki önemli değişikliklerle ilişkilidir36. Hücre küçülmesi, hücre büyümesi ve/veya sinsitya oluşumu gibi virüsün neden olduğu hücresel morfolojik değişiklikler, bazı viral enfeksiyonlara özgü sitopatik etkiler (CPE'ler) olarak da bilinir37. EC'lerde CPE, hücrelerin yıkımı ve her bir EC arasındaki sıkı bağlantıların bozulması olarak tanımlandı, bu nedenle endotel bariyerininparçalanmasına neden oldu 38,39. HUVEC'lerdeki CPE'ler, tek tabakalı hücre ayrılması ve doku kültürü kabından yüzmesi olarak tanımlanabilir. Yapışık hücrelerin ayrılması ve yüzmesi gibi enfekte hücre morfolojik değişiklikleri, RTCA yöntemi kullanılarak sürekli olarak tespit edilebilir. Bu teknik, hücrelerin birkaç saniyede bir gerçek zamanlı olarak izlenmesine izin veren elektrik empedansına dayanmaktadır. Hücre proliferasyonunun, morfolojik değişikliklerin ölçülmesine izin verir ve HUVEC'ler söz konusu olduğunda, stimülasyon üzerine endotel bütünlüğü ve hücre bariyeri fonksiyonundaki40 değişiklikleri izlemek için kullanılabilir.
Bu çalışmada kritik adım, 96 oyuklu direnç plakasının kullanıldığı deney kurulumudur. Bu, analizörün tüm bağlantılarının plakaya iyi bir şekilde bağlanmasını sağlamak içindir. RTCA'da, ölçülen empedans değeri, hücre sayısı, adezyon derecesi, hücresel morfoloji ve hücre canlılığındaki farklılıkları ayırt etmek için bir CI değerine dönüştürülür41. CI değerinde bir düşüşe dönüşen RTCA analizörü tarafından kaydedilen empedanstaki düşüş, hücre sayısının azalmasına, daha zayıf yapışma derecesine ve hücresel morfolojideönemli değişikliklere işaret eder 42. Bu nedenle, RTCA deneyinde kullanılacak hücre hatlarının ve optimum hücre sayılarının uygunluğunun test edilmesi de önemlidir. RTCA sistemi kullanılarak hücreler üzerinde test yapılmadan önce istenen CI indeksinin elde edilip edilemeyeceğini belirlemek çok önemlidir. Ek olarak, bu aynı zamanda RTCA sisteminin seçilen hücre tiplerinin hücre büyümesini ve hücre ölümü profillerini izlemek için uygun olup olmadığını belirlemeye yardımcı olur. Çalışmamızda, HUVEC'ler 0.1 ve 1 MOI'de ZIKV P6-740 ile enfekte olduğunda CI değerlerinde dik bir düşüş gözlendi. CI değerindeki keskin düşüş, dolayısıyla enfeksiyonu takiben HUVEC hücresel morfolojik değişikliklerin meydana geldiğini düşündürmektedir ve bu da sıkı bağlantıların ve EC vasküler bütünlüğünün bozulmasına yol açmıştır.
Geleneksel olarak, in vitro hücrelerin viral enfeksiyonunun neden olduğu CPE'ler, enfekte olmuş hücrelerin mikroskobik gözlemine dayanarak tahmin edilir. Ek olarak, plak tahlili gibi diğer bazı tahliller, CPE'lerin (hücre ayrılması gibi) görselleştirilmesine izin verir ve CPE'lerin kapsamını ölçmek için kullanılır42. Bununla birlikte, bu yöntemlerin yalnızca hücresel morfolojik değişikliklerin ayrı zaman noktaları (son nokta tahlilleri) hakkında bilgi sağlamaları bakımından sınırlamaları vardır. İmmünofloresan boyama gibi diğer tahliller, morfolojik değişiklikleri görselleştirmek için bir florofor ile etiketlenmiş spesifik antikorların kombinasyonlarına dayanır43. İmmünofloresan testi, herhangi bir doku veya hücre tipindeki birçok bileşenin görselleştirilmesine izin veren geniş bir yeteneğe sahip olmasına rağmen, bu teknik, viral enfeksiyon sırasında gerçek zamanlı izleme ve algılamaya izin vermez. Buna karşılık, RTCA sistemi, viral enfeksiyon sırasında gerçek zamanlı hücre morfolojik değişikliklerini kaydeder ve son nokta tahlilleri tarafından gözden kaçırılabilecek geçici vasküler sızıntı gibi geçici etkilerin yakalanmasına izin verir. Örneğin, uç nokta tahlilleri, verileri ve morfolojik değişiklikleri 60 HPI, 80 HPI ve 100 HPI kadar erken bir sürede tespit edemez. RTCA'ya ek olarak, trans-epitelyal elektrik direnci (TEER) ölçümü, hücre tek tabakası boyunca elektrik direncinin ölçüldüğü, hücreden hücreye etkileşimleri izlemek için yaygın olarak kullanılan başka bir yöntemdir. Bununla birlikte, TEER, canlı hücre aktivitelerini izlemek için zaman içinde birkaç tekrarlanan ölçüm gerektirir ve genellikle bir seferde daha az sayıda numune veya kuyucuk üzerinde gerçekleştirilir. Sonuç olarak, TEER tipik olarak RTCA'ya kıyasla daha düşük verime sahiptir ve aynı anda 96 kuyuya kadarçalışabilir 44.
Faydalarına rağmen, RTCA sisteminin çeşitli sınırlamaları vardır. RTCA sisteminin ana sınırlaması, maliyetli ekipman ve sarf malzemeleridir. RTCA sistemi tarafından kullanılan özel altın-mikroelektrot plakaları nispeten maliyetli, tek kullanımlık ve tek kullanımlıktır45. Ek olarak, hücre morfolojik değişiklikleri bir kayıt cihazında (kamera) görüntülenemez ve yakalanamaz, ayrıca test, virüs antijeninin birikimini veya HUVEC'lerdeki VE-kaderin gibi hücre yüzey proteinindeki değişiklikleri yakalayamaz46. Sonuç olarak, RTCA, hastalık patogenezini aydınlatmak için ek yararlı bilgiler sağlayacak hücre morfolojik değişikliklerini görselleştiremez. Tahlil veya model oluşturma sırasında, HUVEC'ler için VE-kaderin boyaması gibi ek boyama doğrulaması, elde edilen ölçümleri doğrulamak için faydalı olacaktır. Ayrıca, RTCA sistemi, empedansın kaydedilmesi için kuyuların dibindeki hücrelerin bağlanmasını gerektirdiğinden, yapışık hücre hatlarıyla sınırlıdır. Bu nedenle, rapor edilen tahlil, yapışık olmayan hücre hatları46 için kullanılamaz.
Sonuç olarak, ZIKV enfeksiyonu üzerine endotel hücrelerindeki değişiklikleri 96 oyuklu formatta izlemek için RTCA cihazını kullanan gerçek zamanlı bir hücre analiz protokolü tanımladık. Bu yöntem, hücresel morfolojik değişiklikleri gerçek zamanlı olarak sürekli izlemek için noninvaziv ve etiketsiz yoğun bir yaklaşıma izin vermesi bakımından geleneksel son nokta tahlillerine göre çeşitli avantajlar sunar. Bu test, farklı deney düzeneklerinde diğer hücre hatlarının vasküler bütünlük değişikliklerini analiz etmek için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu araştırma, Malezya Yüksek Öğrenim Bakanlığı'ndan Yüksek Kurum Mükemmeliyet Merkezi (HICoE) programı (MO002-2019) kapsamında destek ve Uzun Vadeli Araştırma Hibe Programı (LRGS MRUN Faz 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) kapsamında fon almıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Nest | 615601 | |
| 37 °C incubator with 5% CO2 | Sanyo | MCO-18AIC | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning | 430725U | |
| Antibiotic solution penicillin-streptomycin (P/S) | Sciencell | 0503 | |
| Biological safety cabinet, Class II | Holten | HB2448 | |
| Collagen Type 1 | SIgma-Aldrich | C3867 | |
| Endothelial cell growth supplement (ECGS) | Sciencell | 1052 | |
| Endothelial cell medium (ECM) | Sciencell | 1001 | |
| E-plate 96 | Agilent Technologies, Inc. | 05232368001 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sciencell | 0025 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | H9394 | |
| Hemocytometer | Laboroptik LTD | Neubauer improved | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) | Sciencell | 8000 | |
| Inverted microscope | ZEISS | TELAVAL 31 | |
| Latitude 3520 Laptop | Dell | - | |
| Multichannel micropipette (10 - 100 µL) | Eppendorf | 3125000036 | |
| Multichannel micropipette (30 - 300 µL) | Eppendorf | 3125000052 | |
| Reagent reservior | Tarsons | T38-524090 | |
| RTCA resistor plate 96 | Agilent Technologies, Inc. | 05232350001 | |
| RTCA Software Pro (Version 2.6.1) | Agilent Technologies, Inc. | 5454433001 | |
| Single channel pipettes (10 - 100 µL) | Eppendorf | 3123000047 | |
| Single channel pipettes (100 - 1000 µL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Single channel pipettes (20 - 200 µL) | Eppendorf | 3123000055 | |
| xCELLigence Real-time cell analyzer SP (Model: W380) | Agilent Technologies, Inc. | 00380601030 | https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232 |
References
- Alberts, B., et al. Cell junctions. Molecular Biology of the Cell. 4th Edition. , Garland Science. (2002).
- Pugsley, M. K., Tabrizchi, R. The vascular system: An overview of structure and function. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 44 (2), 333-340 (2000).
- Stevens, T., Garcia, J. G., Shasby, D. M., Bhattacharya, J., Malik, A. B. Mechanisms regulating endothelial cell barrier function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 279 (3), L419-L422 (2000).
- Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. The Journal of Physiology. 569, 359-366 (2005).
- Boueiz, A., Hassoun, P. M. Regulation of endothelial barrier function by reactive oxygen and nitrogen species). Microvascular Research. 77 (1), 26-34 (2009).
- Fosse, J. H., Haraldsen, G., Falk, K., Edelmann, R. Endothelial cells in emerging viral infections. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 619690 (2021).
- Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
- Iyer, S., Ferreri, D. M., DeCocco, N. C., Minnear, F. L., Vincent, P. A. VE-cadherin-p120 interaction is required for maintenance of endothelial barrier function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (6), L1143-L1153 (2004).
- Puerta-Guardo, H., et al. Flavivirus NS1 triggers tissue-specific vascular endothelial dysfunction reflecting disease tropism. Cell Reports. 26 (6), 1598-1613 (2019).
- Rastogi, M., Singh, S. K. Zika virus NS1 affects the junctional integrity of human brain microvascular endothelial cells. Biochimie. 176, 52-61 (2020).
- Soe, H. J., et al. High dengue virus load differentially modulates human microvascular endothelial barrier function during early infection. Journal of General Virology. 98 (12), 2993-3007 (2017).
- Krouwer, V. J., Hekking, L. H. P., Langelaar-Makkinje, M., Regan-Klapisz, E., Post, J. A. Endothelial cell senescence is associated with disrupted cell-cell junctions and increased monolayer permeability. Vascular Cell. 4 (1), 12 (2012).
- Aird, W. C. The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome. Blood. 101 (10), 3765-3777 (2003).
- Bryce, C., et al. Pathophysiology of SARS-CoV-2: targeting of endothelial cells renders a complex disease with thrombotic microangiopathy and aberrant immune response. The Mount Sinai COVID-19 autopsy experience. MedRxiv. , (2020).
- Khaiboullina, S., et al. Transcriptome profiling reveals pro-inflammatory cytokines and matrix metalloproteinase activation in Zika virus infected human umbilical vein endothelial cells. Frontiers in Pharmacology. 10, 642 (2019).
- Cao-Lormeau, V. -M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. The Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
- Sarno, M., et al. Zika virus infection and stillbirths: a case of hydrops fetalis, hydranencephaly and fetal demise. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (2), e0004517 (2016).
- Dalrymple, N. A., Mackow, E. R. Virus interactions with endothelial cell receptors: implications for viral pathogenesis. Current Opinion in Virology. 7, 134-140 (2014).
- Buchanan, C. F., et al. Three-dimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (1), 64-75 (2014).
- Daniels, B. P., et al. Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 212 (1), 173-179 (2013).
- Vozzi, F., Bianchi, F., Ahluwalia, A., Domenici, C. Hydrostatic pressure and shear stress affect endothelin-1 and nitric oxide release by endothelial cells in bioreactors. Biotechnology Journal. 9 (1), 146-154 (2014).
- Gallinat, A., Badimon, L. DJ-1 interacts with the ectopic ATP-synthase in endothelial cells during acute ischemia and reperfusion. Scientific Reports. 12 (1), 12753 (2022).
- Jiménez, N., Krouwer, V. J. D., Post, J. A. A new, rapid and reproducible method to obtain high quality endothelium in vitro. Cytotechnology. 65 (1), 1-14 (2013).
- Latifi-Navid, H., et al. Network analysis and the impact of Aflibercept on specific mediators of angiogenesis in HUVEC cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (17), 8285-8299 (2021).
- Poulet, M., et al. PRL-2 phosphatase is required for vascular morphogenesis and angiogenic signaling. Communications Biology. 3 (1), 603 (2020).
- Laurens, N., van Hinsbergh, V. W. Isolation, purification and culture of human micro- and macrovascular endothelial cells. Methods in Endothelial Cell Biology. , Springer. 3-13 (2004).
- Haudenschild, C. C., Zahniser, D., Folkman, J., Klagsbrun, M. Human vascular endothelial cells in culture: lack of response to serum growth factors. Experimental Cell Research. 98 (1), 175-183 (1976).
- Cenni, E., Perut, F., Baldini, N. In vitro models for the evaluation of angiogenic potential in bone engineering. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (1), 21-30 (2011).
- Lau, S., Gossen, M., Lendlein, A., Jung, F. Venous and arterial endothelial cells from human umbilical cords: potential cell sources for cardiovascular research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 978 (2021).
- Marquez-Curtis, L. A., Sultani, A. B., McGann, L. E., Elliott, J. A. W. Beyond membrane integrity: Assessing the functionality of human umbilical vein endothelial cells after cryopreservation. Cryobiology. 72 (3), 183-190 (2016).
- Park, H. -J., et al. Human umbilical vein endothelial cells and human dermal microvascular endothelial cells offer new insights into the relationship between lipid metabolism and angiogenesis. Stem Cell Reviews. 2 (2), 93-102 (2006).
- Dowling, C. M., Herranz Ors, C., Kiely, P. A. Using real-time impedance-based assays to monitor the effects of fibroblast-derived media on the adhesion, proliferation, migration and invasion of colon cancer cells. Bioscience Reports. 34 (4), e00126 (2014).
- Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 54 (8), 2120-2127 (2016).
- Tan, J. Y., Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar, S., Tan, K. K. Virus propagation and cell-based colorimetric quantification. Journal of Visualized Experiments. , (2023).
- Kustermann, S., et al. A real-time impedance-based screening assay for drug-induced vascular leakage. Toxicological Sciences. 138 (2), 333-343 (2014).
- Albrecht, T., Fons, M., Boldogh, I., Rabson, A. S.
- Hematian, A., et al. Traditional and modern cell culture in virus diagnosis. Osong Public Health and Research Perspectives. 7 (2), 77-82 (2016).
- Friedman, H. M. Infection of endothelial cells by common human viruses. Reviews of Infectious Diseases. 11, S700-S704 (1989).
- Friedman, H. M., Macarak, E. J., MacGregor, R. R., Wolfe, J., Kefalides, N. A.
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Analytical Chemistry. 74 (22), 5748-5753 (2002).
- Marlina, S., Shu, M. -H., AbuBakar, S., Zandi, K. Development of a Real-Time Cell Analysing (RTCA) method as a fast and accurate screen for the selection of chikungunya virus replication inhibitors. Parasites & Vectors. 8, 579 (2015).
- Liu, S., DeLalio, L. J., Isakson, B. E., Wang, T. T. AXL-mediated productive infection of human endothelial cells by Zika virus. Circulation Research. 119 (11), 1183-1189 (2016).
- Souf, S. Recent advances in diagnostic testing for viral infections. Bioscience Horizons: The International Journal of Student Research. 9, (2016).
- Sun, M., et al. A dynamic real-time method for monitoring epithelial barrier function in vitro. Analytical Biochemistry. 425 (2), 96-103 (2012).
- Stefanowicz-Hajduk, J., Ochocka, J. R. Real-time cell analysis system in cytotoxicity applications: Usefulness and comparison with tetrazolium salt assays. Toxicology Reports. 7, 335-344 (2020).
- Kho, D., et al. Application of xCELLigence RTCA biosensor technology for revealing the profile and window of drug responsiveness in real time. Biosensors. 5 (2), 199-222 (2015).
