Summary
Den nåværende studien beskriver en protokoll for å overvåke endringene i humane navlestrengendotelceller (HUVEC) under virusinfeksjon ved hjelp av et sanntids celleanalyse (RTCA) -system.
Abstract
Endotelceller strekker den indre overflaten av alt blod og lymfekar, og skaper en semi-permeabel barriere som regulerer væske og løsemiddelutveksling mellom blod eller lymfe og deres omkringliggende vev. Et viruss evne til å krysse endotelbarrieren er en viktig mekanisme som letter virusspredning i menneskekroppen. Mange virus er rapportert å endre endotelpermeabilitet og/eller forårsake forstyrrelse av endotelcellebarrieren under infeksjon, noe som kan forårsake vaskulær lekkasje. Den nåværende studien beskriver en sanntids celleanalyse (RTCA) protokoll, ved hjelp av en kommersiell sanntids celleanalysator for å overvåke endotelintegritet og permeabilitetsendringer under Zika-virus (ZIKV) infeksjon av humane navlestrengendotelceller (HUVEC). Impedanssignalene registrert før og etter ZIKV-infeksjon ble oversatt til celleindeksverdier (CI) og analysert. RTCA-protokollen tillater deteksjon av forbigående effekter i form av cellemorfologiske forandringer under en virusinfeksjon. Denne analysen kan også være nyttig for å studere endringer i vaskulær integritet av HUVEC i andre eksperimentelle oppsett.
Introduction
Endotelceller (EC) strekker den indre overflaten av alt blod og lymfekar. De er forbundet med adherens, tette gapkryss, og skaper en semi-permeabel barriere mellom blod eller lymf og det omkringliggende vevet 1,2. De intakte endotelcelle-cellekryssene er kritiske for å regulere transporten av makromolekyler, løsemidler og væsker, avgjørende for de fysiologiske aktivitetene til de tilsvarende vev og organer3. Endotelbarrieren er dynamisk og modulert av spesifikke stimuli4. Forstyrrelse eller tap av endotelbarrierefunksjon er et kjennetegn på sykdomspatofysiologi ved akutt og kronisk inflammasjon i patogenesen av mange sykdommer 5,6,7, inkludert virusinfeksjon 8,9,10,11. For flavivirus ble det funnet at det ikke-strukturelle proteinet NS1 kan endre endotelpermeabilitet, for eksempel via forstyrrelse av det endoteliale glykokalykslignende laget som følge av økt ekspresjon og aktivering av cathepsin L, sialidaser og endoglykosidase heparinase9. I sykdomstilstanden påvirkes endotelmonolagets integritet, og celle-celle-kryss forstyrres, noe som kan føre til endotelskade og dysfunksjon12 og til slutt utbredte patologiske manifestasjoner på tvers av flere organsystemer13,14. Viral infeksjon av ECs resulterer i endringer i cellesignalveiene og cellulær genuttrykksprofil, noe som kan påvirke væskebarrierefunksjonene, forårsake forstyrrelse av EC og indusere vaskulær lekkasje10,15. Zikavirus (ZIKV) infeksjon av ECs har vist seg å forstyrre kryssintegriteten som forårsaker endringer i vaskulær permeabilitet og fører til endotelbarriere dysfunksjon, noe som resulterer i vaskulær lekkasje10,15. Studier har vist at ZIKV er knyttet til alvorlige fødselsskader; Imidlertid er ikke mye kjent om den eksakte mekanismen som dette skjer 16,17. Forståelse av endotelbarriereendringer under en infeksjon er derfor avgjørende for å forstå sykdomsmekanismen.
EC brukes for tiden som et viktig eksperimentelt in vitro vaskulært modellsystem for ulike fysiologiske og patologiske prosesser 18,19,20,21. Humane endotelceller i navlestrengen (HUVEC) har blitt mye brukt som et primært, ikke-udødeliggjort cellesystem for å studere vaskulært endotel og vaskulær biologi in vitro 22,23,24,25. HUVEC ble først isolert for in vitro-kultur tidlig på 1970-tallet fra navlestrengen i den menneskelige navlestrengen26. HUVECs har en brosteinslignende morfologi som lett gjøres for å spre seg i laboratoriet. På grunn av skjærspenning etter å ha blitt opprettholdt i lange perioder i konfluent tilstand, observeres forlengelse av celleformen. HUVECs kan karakteriseres ved tilstedeværelse av Weibel og Palade-legemer (WPB), pinocytiske vesikler, små mengder fibriller som ligger nær kjernen, mitokondrier med rørformede former som sjelden viser forgreninger, en ellipsoidkjerne med et fint granulært mønster av kondensert kromatin og en til tre nukleoler tilstede i hver kjerne27. Selv om HUVECs viser mange morfologiske egenskaper, kan identifisering av HUVECs ikke oppnås ved optisk undersøkelse alene. Analyser, som immunfluorescensfarging av vaskulær endotelial (VE)-cadherin, brukes ofte til overvåking av vaskulær integritet i HUVECs 28,29,30,31.
Denne studien beskriver sanntids celleanalyse (RTCA) protokollen for infeksjon av HUVEC. RTCA-systemet bruker spesialiserte gullbelagte plater som inneholder mikroelektroder som gir en ledende overflate for cellefeste. Når cellene fester seg til mikroelektrodeoverflaten, dannes en barriere som hindrer elektronstrømmen gjennom mikroelektrodene. Måling av impedansen generert av mikroelektroder kan brukes til å få informasjon om noen cellulære prosesser, inkludert cellevedlegg, spredning og migrasjon32. Den rapporterte analysen er en impedansbasert cellulær analyse som, kombinert med en sanntids celleanalysator, gir kontinuerlig måling av levende celleproliferasjon, morfologiendringer (som cellekrymping) og cellefestekvalitet på en ikke-invasiv og etikettfri måte. I denne studien brukes sanntidscelleanalysatoren til å overvåke endotelintegriteten og morfologiske endringer av HUVEC under ZIKV-infeksjon. Kort fortalt måler instrumentet elektronstrømmen overført i spesialiserte gull-mikroelektrodebelagte mikrotiterplater i nærvær av et kulturmedium (elektrisk ledende løsning). Celleadherens eller endringer i celleantall og morfologi forstyrrer elektronstrømmen og forårsaker impedansvariasjoner som kan fanges opp av instrumentet (tilleggsfigur 1). Forskjellen mellom HUVEC-vekst, spredning og etterlevelse før og etter ZIKV-infeksjon registreres i sanntid av et elektrisk impedanssignal og oversettes deretter til celleindeksverdi (CI). CI-verdien fra preinfeksjonen brukes som utgangspunkt for normalisering av CI-verdi. Endringene i CI-verdier reflekterer cellulære morfologiske endringer eller celleadherenstap ved infeksjonen33. Studieresultatene viser at RTCA-protokollen tillater påvisning av forbigående effekter eller cellemorfologiske endringer under virusinfeksjon sammenlignet med en endepunktanalyse, for eksempel immunfluorescensfarging av VE-cadherin. RTCA-metoden kan være nyttig for å analysere HUVECs vaskulære integritetsendringer ved infeksjon av andre virus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell forberedelse
- Fremstilling av HUVECs
- Vokse 7,5 x 105 HUVEC-celler / ml i en 75 cm2 (belagt med 20 μg / ml kollagen type 1) cellekulturflaske inneholdende 12 ml endotelcellemedium (ECM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 0,01% endotelcelleveksttilskudd (EKG) som inneholder vekstfaktorer, hormoner og proteiner som er nødvendige for kulturen av HUVEC, og 0,01 % penicillin-streptomycin (P/S). Inkuber cellene i en cellekulturinkubator ved 37 °C med 5 % CO2 (figur 1).
2. Oppsett av RTCA-eksperiment
- Motstandsverifisering kjørt på RTCA
- Dobbeltklikk på RTCA-programvareikonet på skrivebordet for å starte programmet. Et påloggingsvindu vises, skriv inn brukernavn og passord for å logge inn.
- Plasser en 96-brønns RTCA-motstandsplate med A1-brønnen vendt innover i RTCA-stasjonen som ligger i cellekulturinkubatoren.
- I kategorien Exp Notes i RTCA-programvaren skriver du inn eksperimentnavnet, enhetens SN og enhetstypen (QC-plate).
- I kategorien Layout under kategorien Celle i RTCA-programvaren, alle brønnene og høyreklikk på de uthevede brønnene for å sikre at alle brønnene er slått på (nedtonet).
- I kategorien Tidsplan i RTCA-programvaren klikker du på Step_1. Skriv inn feier: 10, og intervall: 30 s. Klikk på Bruk. Klikk Start / Fortsett øverst til venstre i programvaren for å starte bekreftelseskjøringen.
MERK: Forsikre deg om at tilkoblingen av brønnene til RTCA-stasjonen er i orden ved å observere "Plate Scanned. Tilkoblinger OK" nederst på siden.
- Motstandsverifisering kjøres for dataanalyse
- I kategorien Celleindeks kontrollerer du dataene når kjøringen er fullført. Alle CI-verdiene skal være mindre enn 0,063.
- I den nedre delen av kategorien Celleindeks kontrollerer du de rå skannedataene. De rå skannede dataene skal vise gjentatte verdimønstre på 40,0 ± 2,0 (rad A og H), 67,5 ± 2,5 (rad B og G), 93,6 ± 2,9 (rad C og F) og 117,6 ± 3,2 (rad D og E).
- Hvis du vil stoppe bekreftelseskjøringen, klikker du Plate > utløserplate. RTCA-motstandsplaten med 96 brønner er nå klar til å fjernes fra RTCA-stasjonen.
- Få bakgrunnslesing på RTCA
- Vask kollagen type 1-belagt spesialisert gull-mikroelektrodeplate (belagt med 20 μg / ml kollagen type 1) med 60 μL / brønn av Hanks balanserte saltløsning (HBSS; med natriumbikarbonat, uten kalsiumklorid og magnesiumsulfat) 2x.
- Kast resten av HBSS og tilsett 50 μL/brønn ECM. Plasser den spesialiserte gullmikroelektrodeplaten som inneholder ECM med A1-brønnen vendt innover i RTCA-stasjonen som ligger i cellekulturinkubatoren.
- I kategorien Exp Notes i RTCA-programvaren skriver du inn eksperimentnavnet, enhetens SN og enhetstype (96-brønnformat).
- I kategorien Layout under kategorien Celle i RTCA-programvaren, brønnene som skal brukes og høyreklikk på de uthevede brønnene for å sikre at alle brønnene er slått på (nedtonet).
- I kategorien Tidsplan i RTCA-programvaren klikker du på Step_1 og klikker Start / Fortsett øverst til venstre i programvaren for å få en bakgrunnsavlesning.
MERK: Kontroller at tilkoblingen av brønnene er riktig ved å observere "Plate Scanned. Tilkoblinger OK" nederst på siden. - Når bakgrunnsavlesningen er oppnådd, er den spesialiserte gull-mikroelektrodeplaten nå klar for cellesåing og klar til å bli fjernet fra RTCA-stasjonen.
- HUVEC-preparat i den spesialiserte gullmikroelektrodeplaten
- Frø HUVECene i den spesialiserte gullmikroelektrodeplaten med 50 μL / brønn av betinget medium, 1 x 104 celler / brønn (betinget medium: ECM supplert med 10% FBS, 0,01% EKG og 0,01% P / S). Plasser platen tilbake i RTCA-stasjonen med A1-brønnen vendt innover for inkubasjon over natten i en cellekulturinkubator ved 37 °C med 5% CO2.
MERK: En celletelling ble utført på cellesuspensjonen med en fortynningsfaktor på to ved bruk av et hemocytometer. - I kategorien Tidsplan klikker du på Legg til et trinn øverst til venstre. Klikk på Step_2 og endre Feier: 601, og Intervall: 2 min. Klikk på Bruk. Klikk på Step_2 og klikk Start / Fortsett øverst til venstre i programvaren.
- Etter 20 timers inkubasjon og når CI-verdiene i brønngraffanen viser et platå, er platen klar for infeksjon. I kategorien Tidsplan i RTCA-programvaren klikker du på Avbryt trinn.
- Den spesialiserte gull-mikroelektrodeplaten er nå klar til å bli fjernet fra RTCA-stasjonen for påfølgende trinn.
- Frø HUVECene i den spesialiserte gullmikroelektrodeplaten med 50 μL / brønn av betinget medium, 1 x 104 celler / brønn (betinget medium: ECM supplert med 10% FBS, 0,01% EKG og 0,01% P / S). Plasser platen tilbake i RTCA-stasjonen med A1-brønnen vendt innover for inkubasjon over natten i en cellekulturinkubator ved 37 °C med 5% CO2.
3. Virusinfeksjon i HUVECs
- Virus fortynning
- ZIKV-bestandskulturen holdes ved -80 °C. For denne studien, fjern viruslageret som oppbevares i kryogene hetteglass og fortynn ZIKV-lageret med serumfri ECM i 1,5 ml sentrifugerør for å oppnå mangfold av infeksjoner (MOI) på 0,1 og 1.
MERK: ZIKV-bestanden ble tidligere forberedt ved å utføre forplantning i Vero-celler og høste ZIKV-supernatanten34.
- ZIKV-bestandskulturen holdes ved -80 °C. For denne studien, fjern viruslageret som oppbevares i kryogene hetteglass og fortynn ZIKV-lageret med serumfri ECM i 1,5 ml sentrifugerør for å oppnå mangfold av infeksjoner (MOI) på 0,1 og 1.
- Infeksjon av cellemonolaget
- Fjern og kast det kondisjonerte mediet (ECM supplert med 10 % FBS, 0,01 % EKG og 0,01 % P/S) fra hver brønn. Skyll hver brønn med 60 μL HBSS 2x. Sett inn HBSS ved hjelp av siden av brønnen; Ikke skyt cellemonolaget.
- Arbeid fra høyeste til laveste fortynning, tilsett 40 μL av hver fortynnet virusprøve i serumfri ECM i brønnen. Tripliker brønnen for hver fortynning og vedlikehold seks brønner uten infeksjon (negativ kontroll og trombinkontroll). Ikke skyt cellen monolayer; I stedet tilsettes det fortynnede viruset ved hjelp av siden av brønnen. Bruk en ny pipetspiss til hver innsetting.
MERK: Trombin ble valgt som den positive kontrollen, da det kan øke endotelpermeabiliteten til HUVECs raskt. - Inkuber platen i en cellekulturinkubator ved 37 °C med 5% CO2 for å tillate virusadsorpsjon. Skyv platen 5x hvert 15. minutt for å tillate virusadsorpsjon i hele cellemonolaget.
- Tilsetning av overleggscellekulturmediet
- Etter 1 time med inkubasjon, fjern og kast virussuspensjonen fra den laveste konsentrasjonen til den høyeste.
- Vask de infiserte cellene med 60 μL HBSS 2x. Legg brønnen med ECM supplert med 2% FBS. For de positive kontrollbrønnene fortynnes trombinet til 20 U/ml med ECM supplert med 2 % FBS, og brønnene legges over med trombinholdig ECM-medium. Ikke skyt cellen monolayer; Legg i stedet til overleggsmedier ved hjelp av siden av brønnen.
- Plassering av den infiserte spesialiserte gull-mikroelektrodeplaten tilbake i RTCA-stasjonen
- I kategorien Tidsplan klikker du på Legg til et trinn øverst til venstre. Klikk på Step_3 og endre Feier: 3 601 og Intervall: 2 min. Klikk på Bruk.
- Klikk på OK i popup-vinduet som vises. Plasser den infiserte spesialiserte gullmikroelektrodeplaten med A1-brønnen vendt innover i RTCA-stasjonen som ligger i cellekulturinkubatoren.
- Klikk på Step_3 og klikk Start / Fortsett øverst til venstre i programvaren.
4. Dataanalyse og eksport av data
- Tillegg av eksperimentell informasjon om hver brønn
- I kategorien Oppsett klikker du kategorien Celle (figur 2A). For å angi målcelleinformasjonen og bestemme brønntypen for hver brønn, brønnen og skriv inn målcellenavnet, nummeret og fargen nederst i programvaren. Klikk på Bruk (figur 2B).
- Hvis du vil velge og bestemme brønntypen for hver brønn i kategorien Celle , merker du brønnen, velger brønntype (utvalg, positiv kontroll eller negativ kontroll) og klikker Angi.
- I kategorien Layout klikker du på kategorien Behandling (figur 2C). For å angi behandlingsinformasjon, brønnen og skriv inn behandlingsnavnet, konsentrasjonen av behandlingen, enheten og fargen. Klikk på Bruk (figur 2D).
- Hvis du vil velge og bestemme brønntypen for hver brønn i kategorien Behandling , merker du brønnen, velger brønntype (prøve, positiv kontroll eller negativ kontroll) og klikker Angi.
MERK: For hvert valg kan flere brønner utheves samtidig.
- Normalisering av CI-verdi
- Høyreklikk til høyre for Dataanalyse-fanen og velg Normalisert celleindeks fra rullegardinlisten Y-akse (figur 3A). I X-akseseksjonen nederst, velg normalisert tid som det siste målte tidspunktet der den spesialiserte gullmikroelektrodeplaten ble fjernet for infeksjon (figur 3B).
MERK: Normaliseringsprosessen utført av programvaren fjerner det meste av variabiliteten på grunn av forskjellene i brønnsåing og vedlegg, så lenge det valgte normaliseringspunktet er før tilsetning av viruset og / eller behandlingen. Derfor bør det optimale normaliseringstidspunktet være det siste tidspunktet før virus og/eller behandlingstillegg. Tidspunktet for normalisering kan kontrolleres i kategorien Tidsplan under Step_2. Den totale tiden som er angitt, er tidspunktet for normalisering (figur 3C).
- Høyreklikk til høyre for Dataanalyse-fanen og velg Normalisert celleindeks fra rullegardinlisten Y-akse (figur 3A). I X-akseseksjonen nederst, velg normalisert tid som det siste målte tidspunktet der den spesialiserte gullmikroelektrodeplaten ble fjernet for infeksjon (figur 3B).
- Plotting innhentede data ved hjelp av RTCA-programvare
- I kategorien Dataanalyse velger du brønnene som skal legges til i grafen ved å markere brønnene og klikke << Legg til. Den normaliserte celleindeksen mot tidsgrafen er nå klar til å kopieres og eksporteres. Pass på at du merker av for Gjennomsnitt .
- Eksportere data ved hjelp av RTCA-programvare
- Øverst til venstre i RTCA-programvaren klikker du på Plate > Export Experiment Info.... Merk av i boksen for å velge dataene som skal eksporteres. Klikk OK.
MERK: Rådata (rå CI-verdier) kan eksporteres når det er merket av for Celleindeks > Alle . - Velg mappen for å lagre eksportfilen. Klikk på LAGRE. Et popup-vindu vises som indikerer eksport av eksperimentell informasjon. Når eksporten er ferdig, vises et nytt vindu som indikerer at den eksporterte eksperimentinformasjonen er klar til visning.
- Øverst til venstre i RTCA-programvaren klikker du på Plate > Export Experiment Info.... Merk av i boksen for å velge dataene som skal eksporteres. Klikk OK.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Før ZIKV-infeksjon var CI registrert for HUVEC-monolaget dyrket på en spesialisert gullmikroelektrodebelagt mikrotiterplate over 8, noe som tyder på sterke adherensegenskaper. Plater eller brønner med CI-indeks mindre enn 8 skal kastes. HUVECene ble deretter infisert med ZIKV ved en MOI på 0,1 og 1, og celleimpedansen ble registrert i 7 dager. CI-verdien av HUVECs infisert med ZIKV P6-740 ved en MOI på 0,1 (lyseblå linje) begynte å falle 15 timer etter infeksjon (HPI), sammenlignet med negativ infeksjonskontroll (brun linje; Figur 4). Når det gjelder HUVECs infisert med en høyere dose ZIKV P6-740 ved en MOI på 1 (blå linje), begynte CI-verdien å falle så tidlig som ved 11 HPI. Ved 24 HPI var det et fall på 5% og 7% i normalisert CI-verdi (0,949, 0,929) når ECs ble infisert med ZIKV ved en MOI på henholdsvis 0,1 og 1. En 50% reduksjon i normalisert CI-verdi ble registrert ved 96 HPI og ved 66,75 HPI ved ZIKV-infeksjon ved en MOI på henholdsvis 0,1 og 1. Den normaliserte CI-verdien nådde sitt laveste punkt på 107 HPI, hvor det var en reduksjon på 51% og 60% (0,4915, 0,3984) ved ZIKV-infeksjon ved en MOI på henholdsvis 0,1 og 1. Den normaliserte CI-verdien ble funnet å ha en økning på 4% og 13% fra 107 HPI og utover til slutten av forsøket ved 168 HPI (0,5128, 0,4571). Den svarte linjen viser effekten av trombin brukt som en positiv kontroll, hvor CI-verdiene forble lave gjennom hele forsøket, etterlignet forstyrrelsen av stramme kryss og induserte vaskulær lekkasje35.
Figur 1: Endotelceller i humane navleårer (HUVEC). Figuren er i 40x forstørrelse for å se samløpshastigheten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjermbilder av kategorien Celle og behandling under kategorien Layout i RTCA-programvaren. (A) I kategorien Layout klikker du kategorien Celle . (B) For å legge inn målcelleinformasjon og bestemme brønntypen for hver brønn, brønnen og skriv inn målcellenavnet, nummeret og fargen nederst i programvaren. Klikk på Bruk. (C) Klikk på kategorien Layout under kategorien Behandling . (D) For å legge inn behandlingsinformasjon, brønnen og skriv inn behandlingsnavnet, konsentrasjonen av behandlingen, enheten og fargen. Klikk på Bruk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Skjermbilder av kategorien Dataanalyse i RTCA-programvaren for normalisering av celleindeks. (A) I rullegardinlisten Y-akse velger du Normalisert celleindeks. (B) I X-aksen velger du normaliseringstiden. (C) Skjermbilde av kategorien Tidsplan i RTCA-programvaren. Normaliseringstiden er angitt på Step_2 total tid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Normalisert celleindeks versus tidsplott for zikavirus (ZIKV)-infeksjon i humane navlestrengendotelceller (HUVEC). Den spesialiserte gullmikroelektrodeplaten ble belagt med 20 μg / ml kollagen type 1. HUVECene ble sådd med en tetthet på 1,0 x 104 celler/brønn. ZIKV P6-740 (MOI: 0.1, 1) ble brukt til infeksjon. Lyseblå: ZIKV P6-740 (MOI: 0,1); blå: ZIKV P6-740 (MOI: 1); svart: trombin som positiv kontroll (20 E/ml); Brun: Negativt smittevern. Hvert datapunkt betyr gjennomsnittet og ble analysert i tre eksemplarer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Skjematisk tegning av teknikken som brukes i den elektriske biosensorimpedansbaserte RTCA. Et sidebilde av brønnplaten; På bunnen av brønnene er det gullbelagte negative og positive terminaler. Når instrumentet måler CI i mikrobrønnen som inneholder kulturmedier som gjør det mulig å lede elektrisitet, strømmer elektronet fra den negative til den positive terminalen. Når det er en tom kontroll, er elektronstrømmen jevn, og dermed registreres ingen impedans. Når cellene sås, og etter hvert som flere og flere celler fester seg til bunnen av brønnen, er impedans i elektronstrømmen til stede og registreres av datamaskinen. Ved hjelp av denne impedansverdien konverterer instrumentet den til en CI-verdi, som indikerer antall celler festet til bunnen av brønnen (adhesjon). Laget med BioRender. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cytocidal virusinfeksjon i permissive celler er vanligvis forbundet med betydelige endringer i cellemorfologi og biosyntese36. De virusinduserte cellulære morfologiske endringene, som cellekrymping, celleforstørrelse og/eller syncytidannelse, er også kjent som cytopatiske effekter (CPE), karakteristiske for visse virusinfeksjoner37. I EC ble CPE beskrevet som ødeleggelse av celler og nedbrytning av de stramme kryssene mellom hver EC, og forårsaket dermed nedbrytningen av endotelbarrieren38,39. CPE i HUVEC kan beskrives som monolagscelleavløsning og flytende fra vevskulturbeholderen. De infiserte cellemorfologiske endringene, som løsrivelse og flyt av adherente celler, kan kontinuerlig detekteres ved hjelp av RTCA-metoden. Denne teknikken er basert på elektrisk impedans, som tillater overvåking av celler i sanntid opptil noen få sekunder. Det tillater kvantifisering av celleproliferasjon, morfologiske endringer, og i tilfelle HUVEC kan den brukes til å overvåke endringer i endotelintegritet og cellebarrierefunksjon40 ved stimulering.
I denne studien er det kritiske trinnet oppsettet av eksperimentet, hvor 96-brønnmotstandsplaten benyttes. Dette er for å sikre at alle tilkoblinger til analysatoren er godt koblet til platen. I RTCA konverteres den målte impedansverdien som en CI-verdi for å skille forskjellene i cellenummer, adhesjonsgrad, cellulær morfologi og cellelevedyktighet41. Fallet i den registrerte impedansen av RTCA-analysatoren, som oversettes til et fall i CI-verdien, antyder et redusert celleantall, svakere adhesjonsgrad og betydelige endringer i cellulær morfologi42. Derfor er det også viktig å teste egnetheten til cellelinjer og optimale celletall som skal brukes i RTCA-eksperimentet. Det er avgjørende å avgjøre om den ønskede CI-indeksen kan oppnås før utførelsen av testing på cellene ved hjelp av RTCA-systemet. I tillegg bidrar dette også til å avgjøre om RTCA-systemet er egnet til å overvåke cellevekst og celledødsprofiler av utvalgte celletyper. I vår studie ble det observert et bratt fall i CI-verdier når HUVEC ble infisert med ZIKV P6-740 ved MOI på 0,1 og 1. Det bratte fallet i CI-verdi, noe som tyder på at HUVEC-cellulære morfologiske endringer skjedde etter infeksjon, og dette førte til forstyrrelse av stramme kryss og EC-vaskulær integritet.
Konvensjonelt estimeres CPE forårsaket av virusinfeksjon av celler in vitro basert på mikroskopisk observasjon av de infiserte cellene. I tillegg tillater noen andre analyser, for eksempel plakkanalysen, visualisering av CPE (for eksempel celleavløsning) og brukes til å måle omfanget av CPE42. Disse metodene har imidlertid begrensninger ved at de bare gir informasjon om diskrete tidspunkter for de cellulære morfologiske endringene (endepunktanalyser). Andre analyser, for eksempel immunfluorescensfarging, er avhengige av kombinasjoner av spesifikke antistoffer merket med en fluorofor for å visualisere de morfologiske endringene43. Selv om immunfluorescensanalysen har en bred evne som tillater visualisering av mange komponenter i et gitt vev eller celletype, tillater denne teknikken ikke sanntidsovervåking og deteksjon under virusinfeksjon. I motsetning til dette registrerer RTCA-systemet sanntids cellemorfologiske endringer under virusinfeksjonen, noe som tillater fangst av forbigående effekter, for eksempel forbigående vaskulær lekkasje, som kan bli savnet av endepunktanalyser. For eksempel vil endepunktsanalyser ikke oppdage data og morfologiske endringer så tidlig som 60 HPI, 80 HPI og 100 HPI. I tillegg til RTCA er transepitelial elektrisk motstand (TEER) måling en annen vanlig metode for å overvåke celle-til-celle-interaksjoner, hvor den elektriske motstanden over cellemonolaget måles. TEER krever imidlertid flere gjentatte målinger over tid for å overvåke levende celleaktiviteter og utføres ofte på et mindre antall prøver eller brønner om gangen. Som et resultat har TEER vanligvis lavere gjennomstrømning sammenlignet med RTCA, som kan kjøre opptil 96 brønner samtidig44.
Til tross for fordelene har RTCA-systemet flere begrensninger. Hovedbegrensningen til RTCA-systemet er det kostbare utstyret og forbruksvarer. De spesialiserte gullmikroelektrodeplatene som brukes av RTCA-systemet er relativt kostbare, engangsbruk og engangs45. I tillegg kan cellemorfologiske endringer ikke avbildes og fanges opp på en opptaker (kamera), og analysen kan heller ikke fange opp akkumulering av virusantigenet eller endringer i celleoverflateproteinet, slik som VE-cadherin i HUVECs46. Som et resultat kan RTCA ikke visualisere cellemorfologiske endringer som vil gi ytterligere nyttig informasjon for å belyse sykdomspatogenesen. Under analysen eller modelletableringen vil ytterligere fargeverifisering, for eksempel VE-cadherinfarging for HUVEC, være nyttig for å validere de oppnådde målingene. Videre er RTCA-systemet begrenset til adherente cellelinjer, da det krever vedlegg av celler i bunnen av brønnene for at impedansen skal registreres. Den rapporterte analysen kan derfor ikke brukes for ikke-adherente cellelinjer46.
Avslutningsvis har vi beskrevet en sanntids celleanalyseprotokoll ved hjelp av RTCA-instrumentet for å overvåke endringer i endotelceller ved ZIKV-infeksjon i 96-brønnformat. Denne metoden gir flere fordeler i forhold til konvensjonelle endepunktanalyser, ved at den muliggjør en ikke-invasiv og ikke-etikettintensiv tilnærming for kontinuerlig overvåking av cellulære morfologiske endringer i sanntid. Denne analysen kan også brukes til å analysere vaskulære integritetsendringer av andre cellelinjer i forskjellige eksperimentelle oppsett.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Denne forskningen mottok støtte fra departementet for høyere utdanning Malaysia under programmet Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) (MO002-2019) og finansiering under Long-Term Research Grant Scheme (LRGS MRUN fase 1: LRGS MRUN / F1 / 01/2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Nest | 615601 | |
| 37 °C incubator with 5% CO2 | Sanyo | MCO-18AIC | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning | 430725U | |
| Antibiotic solution penicillin-streptomycin (P/S) | Sciencell | 0503 | |
| Biological safety cabinet, Class II | Holten | HB2448 | |
| Collagen Type 1 | SIgma-Aldrich | C3867 | |
| Endothelial cell growth supplement (ECGS) | Sciencell | 1052 | |
| Endothelial cell medium (ECM) | Sciencell | 1001 | |
| E-plate 96 | Agilent Technologies, Inc. | 05232368001 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sciencell | 0025 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | H9394 | |
| Hemocytometer | Laboroptik LTD | Neubauer improved | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) | Sciencell | 8000 | |
| Inverted microscope | ZEISS | TELAVAL 31 | |
| Latitude 3520 Laptop | Dell | - | |
| Multichannel micropipette (10 - 100 µL) | Eppendorf | 3125000036 | |
| Multichannel micropipette (30 - 300 µL) | Eppendorf | 3125000052 | |
| Reagent reservior | Tarsons | T38-524090 | |
| RTCA resistor plate 96 | Agilent Technologies, Inc. | 05232350001 | |
| RTCA Software Pro (Version 2.6.1) | Agilent Technologies, Inc. | 5454433001 | |
| Single channel pipettes (10 - 100 µL) | Eppendorf | 3123000047 | |
| Single channel pipettes (100 - 1000 µL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Single channel pipettes (20 - 200 µL) | Eppendorf | 3123000055 | |
| xCELLigence Real-time cell analyzer SP (Model: W380) | Agilent Technologies, Inc. | 00380601030 | https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232 |
References
- Alberts, B., et al. Cell junctions. Molecular Biology of the Cell. 4th Edition. , Garland Science. (2002).
- Pugsley, M. K., Tabrizchi, R. The vascular system: An overview of structure and function. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 44 (2), 333-340 (2000).
- Stevens, T., Garcia, J. G., Shasby, D. M., Bhattacharya, J., Malik, A. B. Mechanisms regulating endothelial cell barrier function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 279 (3), L419-L422 (2000).
- Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. The Journal of Physiology. 569, 359-366 (2005).
- Boueiz, A., Hassoun, P. M. Regulation of endothelial barrier function by reactive oxygen and nitrogen species). Microvascular Research. 77 (1), 26-34 (2009).
- Fosse, J. H., Haraldsen, G., Falk, K., Edelmann, R. Endothelial cells in emerging viral infections. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 619690 (2021).
- Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
- Iyer, S., Ferreri, D. M., DeCocco, N. C., Minnear, F. L., Vincent, P. A. VE-cadherin-p120 interaction is required for maintenance of endothelial barrier function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (6), L1143-L1153 (2004).
- Puerta-Guardo, H., et al. Flavivirus NS1 triggers tissue-specific vascular endothelial dysfunction reflecting disease tropism. Cell Reports. 26 (6), 1598-1613 (2019).
- Rastogi, M., Singh, S. K. Zika virus NS1 affects the junctional integrity of human brain microvascular endothelial cells. Biochimie. 176, 52-61 (2020).
- Soe, H. J., et al. High dengue virus load differentially modulates human microvascular endothelial barrier function during early infection. Journal of General Virology. 98 (12), 2993-3007 (2017).
- Krouwer, V. J., Hekking, L. H. P., Langelaar-Makkinje, M., Regan-Klapisz, E., Post, J. A. Endothelial cell senescence is associated with disrupted cell-cell junctions and increased monolayer permeability. Vascular Cell. 4 (1), 12 (2012).
- Aird, W. C. The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome. Blood. 101 (10), 3765-3777 (2003).
- Bryce, C., et al. Pathophysiology of SARS-CoV-2: targeting of endothelial cells renders a complex disease with thrombotic microangiopathy and aberrant immune response. The Mount Sinai COVID-19 autopsy experience. MedRxiv. , (2020).
- Khaiboullina, S., et al. Transcriptome profiling reveals pro-inflammatory cytokines and matrix metalloproteinase activation in Zika virus infected human umbilical vein endothelial cells. Frontiers in Pharmacology. 10, 642 (2019).
- Cao-Lormeau, V. -M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. The Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
- Sarno, M., et al. Zika virus infection and stillbirths: a case of hydrops fetalis, hydranencephaly and fetal demise. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (2), e0004517 (2016).
- Dalrymple, N. A., Mackow, E. R. Virus interactions with endothelial cell receptors: implications for viral pathogenesis. Current Opinion in Virology. 7, 134-140 (2014).
- Buchanan, C. F., et al. Three-dimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (1), 64-75 (2014).
- Daniels, B. P., et al. Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 212 (1), 173-179 (2013).
- Vozzi, F., Bianchi, F., Ahluwalia, A., Domenici, C. Hydrostatic pressure and shear stress affect endothelin-1 and nitric oxide release by endothelial cells in bioreactors. Biotechnology Journal. 9 (1), 146-154 (2014).
- Gallinat, A., Badimon, L. DJ-1 interacts with the ectopic ATP-synthase in endothelial cells during acute ischemia and reperfusion. Scientific Reports. 12 (1), 12753 (2022).
- Jiménez, N., Krouwer, V. J. D., Post, J. A. A new, rapid and reproducible method to obtain high quality endothelium in vitro. Cytotechnology. 65 (1), 1-14 (2013).
- Latifi-Navid, H., et al. Network analysis and the impact of Aflibercept on specific mediators of angiogenesis in HUVEC cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (17), 8285-8299 (2021).
- Poulet, M., et al. PRL-2 phosphatase is required for vascular morphogenesis and angiogenic signaling. Communications Biology. 3 (1), 603 (2020).
- Laurens, N., van Hinsbergh, V. W. Isolation, purification and culture of human micro- and macrovascular endothelial cells. Methods in Endothelial Cell Biology. , Springer. 3-13 (2004).
- Haudenschild, C. C., Zahniser, D., Folkman, J., Klagsbrun, M. Human vascular endothelial cells in culture: lack of response to serum growth factors. Experimental Cell Research. 98 (1), 175-183 (1976).
- Cenni, E., Perut, F., Baldini, N. In vitro models for the evaluation of angiogenic potential in bone engineering. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (1), 21-30 (2011).
- Lau, S., Gossen, M., Lendlein, A., Jung, F. Venous and arterial endothelial cells from human umbilical cords: potential cell sources for cardiovascular research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 978 (2021).
- Marquez-Curtis, L. A., Sultani, A. B., McGann, L. E., Elliott, J. A. W. Beyond membrane integrity: Assessing the functionality of human umbilical vein endothelial cells after cryopreservation. Cryobiology. 72 (3), 183-190 (2016).
- Park, H. -J., et al. Human umbilical vein endothelial cells and human dermal microvascular endothelial cells offer new insights into the relationship between lipid metabolism and angiogenesis. Stem Cell Reviews. 2 (2), 93-102 (2006).
- Dowling, C. M., Herranz Ors, C., Kiely, P. A. Using real-time impedance-based assays to monitor the effects of fibroblast-derived media on the adhesion, proliferation, migration and invasion of colon cancer cells. Bioscience Reports. 34 (4), e00126 (2014).
- Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 54 (8), 2120-2127 (2016).
- Tan, J. Y., Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar, S., Tan, K. K. Virus propagation and cell-based colorimetric quantification. Journal of Visualized Experiments. , (2023).
- Kustermann, S., et al. A real-time impedance-based screening assay for drug-induced vascular leakage. Toxicological Sciences. 138 (2), 333-343 (2014).
- Albrecht, T., Fons, M., Boldogh, I., Rabson, A. S.
- Hematian, A., et al. Traditional and modern cell culture in virus diagnosis. Osong Public Health and Research Perspectives. 7 (2), 77-82 (2016).
- Friedman, H. M. Infection of endothelial cells by common human viruses. Reviews of Infectious Diseases. 11, S700-S704 (1989).
- Friedman, H. M., Macarak, E. J., MacGregor, R. R., Wolfe, J., Kefalides, N. A.
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Analytical Chemistry. 74 (22), 5748-5753 (2002).
- Marlina, S., Shu, M. -H., AbuBakar, S., Zandi, K. Development of a Real-Time Cell Analysing (RTCA) method as a fast and accurate screen for the selection of chikungunya virus replication inhibitors. Parasites & Vectors. 8, 579 (2015).
- Liu, S., DeLalio, L. J., Isakson, B. E., Wang, T. T. AXL-mediated productive infection of human endothelial cells by Zika virus. Circulation Research. 119 (11), 1183-1189 (2016).
- Souf, S. Recent advances in diagnostic testing for viral infections. Bioscience Horizons: The International Journal of Student Research. 9, (2016).
- Sun, M., et al. A dynamic real-time method for monitoring epithelial barrier function in vitro. Analytical Biochemistry. 425 (2), 96-103 (2012).
- Stefanowicz-Hajduk, J., Ochocka, J. R. Real-time cell analysis system in cytotoxicity applications: Usefulness and comparison with tetrazolium salt assays. Toxicology Reports. 7, 335-344 (2020).
- Kho, D., et al. Application of xCELLigence RTCA biosensor technology for revealing the profile and window of drug responsiveness in real time. Biosensors. 5 (2), 199-222 (2015).
