Summary
במאמר זה אנו מתארים תהליך עבודה של פרוטאומיקה לאפיון הפרוטאום של פני התא של סוגי תאים שונים. זרימת עבודה זו כוללת העשרת חלבון בפני השטח של התא, הכנת דגימה לאחר מכן, ניתוח באמצעות פלטפורמת LC-MS/MS ועיבוד נתונים עם תוכנה מיוחדת.
Abstract
במהלך העשור האחרון, פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות אפשרה אפיון מעמיק של מערכות ביולוגיות במגוון רחב של יישומים. פרוטאום פני השטח של התא ("surfaceome") במחלות אנושיות הוא בעל עניין משמעותי, שכן חלבונים בקרום הפלזמה הם המטרה העיקרית של רוב הטיפולים המאושרים קלינית, כמו גם תכונה מרכזית שבאמצעותה ניתן להבחין באופן אבחוני בין תאים חולים לרקמות בריאות. עם זאת, אפיון ממוקד של חלבוני הממברנה ופני השטח של התא נותר מאתגר, בעיקר בשל המורכבות של ליזטים תאיים, המסווים חלבונים בעלי עניין על ידי חלבונים אחרים בעלי שפע גבוה. כדי להתגבר על מחסום טכני זה ולהגדיר במדויק את הפרוטאום של פני התא של סוגי תאים שונים באמצעות פרוטאומיקה של ספקטרומטריית מסות, יש צורך להעשיר את הליזט של התא עבור חלבוני פני התא לפני ניתוח על ספקטרומטר המסות. מאמר זה מציג תהליך עבודה מפורט לתיוג חלבוני פני התא מתאי סרטן, העשרת חלבונים אלה מתוך הליזט של התא, ולאחר מכן הכנת דגימות לניתוח ספקטרומטריית מסות.
Introduction
חלבונים משמשים כיחידות היסוד שבאמצעותן מתבצעות רוב הפונקציות התאיות. אפיון המבנה והתפקוד של חלבונים רלוונטיים הוא צעד חיוני להבנת תהליכים ביולוגיים. במהלך העשור האחרון, ההתקדמות בטכנולוגיית ספקטרומטריית מסות, תוכנות ניתוח ומסדי נתונים אפשרו זיהוי ומדידה מדויקים של חלבונים בקנה מידה רחב פרוטאום1. ניתן להשתמש בפרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות במגוון רחב של יישומים, החל מניתוח מדעי בסיסי של מסלולים ביוכימיים, דרך זיהוי מטרות תרופות חדשות בסביבה תרגומית, וכלה באבחון וניטור של מחלות במרפאה2. בעת סינון מטרות תרופות חדשות, אפיון הפרוטאום של פני התא חשוב במיוחד, כאשר למעלה מ-65% מהתרופות המאושרות כיום בבני אדם מכוונות לחלבוני פני התא3. תחום האימונותרפיה לסרטן גם מסתמך לחלוטין על אנטיגנים ספציפיים לפני השטח של התא הסרטני כדי למקד ולחסל באופן ספציפי תאים סרטניים4. פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות יכולה אפוא לשמש ככלי מבטיח לזיהוי חלבונים חדשים על פני התא לקראת התערבויות טיפוליות.
עם זאת, ישנן מספר מגבלות בעת שימוש בשיטות פרוטאומיקה קונבנציונליות כדי לסקור תאי גידול עבור מטרות חלבון חדשות על פני התא. דאגה עיקרית היא שחלבוני פני השטח מהווים חלק קטן מאוד מכלל מולקולות החלבון בתא. לכן, מקטעים של חלבונים אלה מוסווים על ידי שפע גבוה של חלבונים תוך תאיים בעת ביצוע ניתוח ספקטרומטריית מסה של כל התא ליזט5. מגבלה זו מקשה על אפיון מדויק של הפרוטאום של פני התא בתהליך עבודה מסורתי של פרוטאומיקה. כדי להתמודד עם אתגר זה, יש צורך לפתח דרכים להעשיר חלבונים על פני התא מתוך ליזט התא כולו, לפני ניתוח על ספקטרומטר המסות. שיטה אחת כזו כוללת חמצון ותיוג ביוטין של חלבוני פני השטח של התא המסוכרר בתאים השלמים, ולאחר מכן העשרה של חלבונים ביוטינילטים אלה מהליזט באמצעות משיכת נויטרווידין, תהליך שזכה לכינוי "לכידת פני השטח של התא"6. מכיוון ש~85% מהחלבונים על פני התא של יונקים נחשבים לגליקוזילטים7, זה משמש כשיטה יעילה להעשרת פרוטאום פני התא מתוך כל התא ליזט. מאמר זה מתאר תהליך עבודה מלא, החל מתאים בתרבית, של תיוג ביוטין על פני התא, ולאחר מכן הכנת דגימות לניתוח ספקטרומטריית מסות (איור 1). על פני מספר עותקים משוכפלים, שיטה זו מספקת כיסוי חזק של פרוטאום פני התא של דגימה מסוימת. שימוש בשיטה זו כדי לאפיין את הפרוטאום של פני התא הן של תאים סרטניים והן של תאים בריאים יכול להקל על גילוי אנטיגנים חדשים בפני השטח של התא כדי לזהות מטרות אימונותרפיות פוטנציאליות8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: תאי פלסמקיטומה AMO1 שימשו לניסוי זה בפרוטאום פני השטח של התא. אותו פרוטוקול יכול לשמש גם עבור סוגי תאים אחרים, כולל מגוון רחב של קווי תאים השעיה ודבק9, כמו גם סוגים שונים של דגימות ראשוניות10. עם זאת, מספרי תאים (חומר מוצא לניסוי) בדרך כלל צריכים להיות אופטימליים עבור כיסוי פרוטאום שווה ערך. לפרטים הקשורים לחומרים ולציוד, ראו טבלת חומרים. לפרטים הקשורים למאגרים ולתמיסות ריאגנטים והרכבם, ראו טבלה 1.
1. תיוג פני התא עם ביוטין
- לספור את התאים בתרבית ואת הגלולה על 3.5 × 107 תאים חיים על ידי צנטריפוגה (5 דקות ב 500 × גרם, 24 ° C).
הערה: תאי פלסמקיטומה AMO1 הועברו עם מדיה טרייה כל 3 ימים לפני הקציר. - שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה על ידי הוספת 1 מ"ל של מי מלח קרים (4°C) חוצצי פוספט (D-PBS) של Dulbecco (ללא סידן, ללא מגנזיום), ופיטום עדין למעלה ולמטה.
- גלול שוב את התאים (כמו בשלב 1.1) וחזור על שלב השטיפה (שלב 1.2) פעם נוספת (שתי שטיפות בסך הכל).
- לאחר השטיפה השנייה, גלול את התאים (כמו בשלב 1.1) והשהה אותם מחדש ב 990 μL של D-PBS קר על ידי pipetting בעדינות.
- הכינו מראש תמיסת מלאי של 160 mM נתרן מטפריודט (NaIO4). יש לפצל ל-50 μL aliquots ולאחסן בטמפרטורה של -20°C למשך עד 6 חודשים. הוסף 10 μL של 160 mM נתרן metaperiodate פתרון לתרחיף התא בשלב 1.4, לערבב היטב, לדגור על רוטור מקצה לקצה במשך 20 דקות ב 4 ° C.
- לאחר השלמת הדגירה, גלולה את התאים (כמו בשלב 1.1), decant supernatant, ו resuspend ב 1 מ"ל של D-PBS קר. חזרו על שלב השטיפה פעמיים (שלוש שטיפות בסך הכל). לאחר השטיפה השלישית, להשעות מחדש את התאים ב 989 μL של D-PBS.
- הכינו מראש תמיסת מלאי של 100 מילימטר ביוציטין הידרזיד. לפצל ל 50 μL aliquots, ולאחסן ב -20 ° C עד 6 חודשים. הוסף 1 μL של אנילין ו 10 μL של 100 mM ביוציטין הידרזיד לתרחיף התא בשלב 1.6, לערבב היטב, ולדגור על רוטור מקצה לקצה במשך 60 דקות ב 4 ° C.
- לאחר השלמת הדגירה, גלולה את התאים (כמו בשלב 1.1), decant supernatant, ו resuspend ב 1 מ"ל של D-PBS קר. חזרו על שלב השטיפה פעמיים (שלוש שטיפות בסך הכל).
- לאחר השטיפה השלישית, שאפו את הסופרנאטנט בזהירות עם פיפט, והקפיאו את גלולת התא על ידי הנחת הצינור בנוזל N2. מניחים את הגלולה הקפואה ב -80 מעלות צלזיוס, עד מוכן להמשיך עם ליזה ומשיכה כלפי מטה.
2. ליזה של תאים ומשיכת ביוטין
- הפשירו את גלולת התא הקפואה על קרח.
- מוסיפים 500 μL של חיץ ליזיס 2x לכדורית, מערבבים היטב ומערבלים במשך 30 שניות.
הערה: ייתכן שיידרשו פיפטינג נמרץ ומערבולות כדי לשפוך את הגלולה במלואה. חלק מהפסולת הבלתי מסיסה (כלומר, DNA) מקובלת, מכיוון שהיא מוסרת בשלב הסוניקציה שלאחר מכן. - סוניק את התא ליזט על קרח (שלושה התפרצויות, 20 שניות כל אחד, 60% מחזור עבודה).
- צנטריפוגה את הליזט כדי להניע את כל הפסולת שנותרה (10 דקות ב 17,200 × גרם ב 4 ° C).
- בזמן שהליזט הוא צנטריפוגה, להוסיף 100 μL של חרוזי שרף אגרוז neutravidin לעמוד סינון. חברו את העמוד לסעפת ואקום, מרחו ואקום עדין ושטפו את החרוזים על ידי הזרמת 3 מ"ל של חיץ כביסה 1 מעליהם.
- הסר את עמוד הסינון מסעפת הוואקום, כסה את החלק התחתון והוסף את ליזט התא המובהר לעמודה עם החרוזים. מכסים את החלק העליון של העמודה, ודגרים על הליזט עם החרוזים על רוטור מקצה לקצה למשך 120 דקות ב-4°C.
הערה: בעת סגירת החלק העליון של העמודה, החזק היטב את המכסה התחתון במקומו, אחרת הוא עלול להשתחרר וליזט התא עלול לדלוף במהלך הדגירה. - הכינו את מאגרי הכביסה 1, 2 ו-3 (כ-5 מ"ל מכל חיץ כביסה לדגימה, ראו טבלה 1), והניחו אותם באמבט מים בטמפרטורה של 42°C
- לאחר סיום הדגירה של הליזט, הניחו את עמוד הסינון בחזרה על סעפת הוואקום, מרחו ואקום עדין ושטפו את החרוזים על ידי הזרמת 5 מ"ל של חיץ כביסה 1 מעליהם.
הערה: ניתן להשתמש ביותר מ-5 מ"ל ממאגרי הכביסה לכביסה; כביסה נוספת עשויה להפחית את הרקע ואת הקשירה הלא ספציפית על החרוזים. - חזור על שלב הכביסה עם 5 מ"ל של חיץ כביסה 2.
- חזור על שלב הכביסה עם 5 מ"ל של חיץ כביסה 3.
- לאחר שחיץ הכביסה הסופי זרם כולו דרך החרוזים, הסר את העמוד מהסעפת. הוסף 100 μL של פתרון "Lyse" לחרוזים ולהעביר אותם 1.7 מ"ל צינור microcentrifuge נמוך חלבון מחייב עם pipet. סובבו בקצרה את הצינור כדי ליישב את החרוזים, והסירו 50 μL של התמיסה מבלי להפריע לחרוזים המיושבים.
הערה: הריאגנטים בשלב זה ובכל השלבים הבאים משתמשים בערכת הכנת דגימות פרוטאומיקה הזמינה באופן מסחרי. הערכה מספקת תהליך עבודה ממוטב ופשוט להכנת דוגמאות. עם זאת, ניתן לבצע שלבים אלה גם ללא תלות בערכה, תוך שימוש בתהליך עבודה פרוטאומיקה מסורתי כמתואר ב- Verma et al.9. אם החרוזים נשארים דבוקים לצד או לתחתית העמודה, אפשרו לחרוזים שהועברו לצינור לשקוע, והשתמשו בתמיסת "ליז" נוספת בצינור כדי להעביר את החרוזים הנותרים. - הניחו את הצינור על בלוק חום/שייקר בטמפרטורה של 65°C, ונערו ב-1,000 סל"ד למשך 10 דקות.
הערה: שלב זה נדרש להפחתה ואלקילציה של שאריות ציסטאין לפני העיכול.
3. עיכול חלבון
- השהה מחדש את הטריפסין המיובש (צינור "Digest" בערכה, מאוחסן ב -20 ° C) על ידי הוספת 210 μL של תמיסת "Resuspend". פיפט את התמיסה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להבטיח שכל הטריפסין המיובש מושהה מחדש.
- לאחר השלמת הדגירה, להוסיף 50 μL של תמיסת טריפסין resuspended לחרוזים. לדגור על הצינור ב 37 ° C, רועד ב 500 סל"ד לפחות 90 דקות כדי לעכל את החלבון.
- לאחר השלמת העיכול, העבירו את התמיסה המכילה את החרוזים לעמוד ספין, והכניסו את העמוד לצינור מיקרוצנטריפוגה דל חלבון בנפח 1.7 מ"ל. סובבו את הצינורית (500 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר [RT]) כדי להפריד את תמיסת הפפטיד המעוכלת מהחרוזים.
הערה: בשלב זה, טיפול PNGase יכול להתבצע על החרוזים ברגע שהם מופרדים מתמיסת הפפטידים, כדי לנטרל שברי פפטיד biotinylated מן חרוזי streptavidin. לאחר מכן ניתן להעביר דגימת פפטיד זו קדימה דרך שארית זרימת העבודה כדגימת פפטיד נפרדת ומשנית שניתן לנתח ולהשוות לדגימה הראשונית מטריפסיניזציה של חרוזים. גישת PNGase עשויה לספק נתונים משלימים לטריפסיניזציה על חרוזים, בהתחשב בספציפיות הנוספת עבור אספרגינים N-glycosylated שנלכדו בהתבסס על שינוי שרשרת צד הניתן לזיהוי MS12. עם זאת, החיסרון של גישת אלוציה רציפה זו הוא הדרישה לזמן כפול של מכשיר ספקטרומטר מסה לכל ניתוח דגימה. - הוסף 100 μL של תמיסת "עצור" כדי לעצור את תגובת העיכול ולהחמיץ את הפתרון הפפטידי.
4. התפלת פפטיד
- באמצעות מתאם צינור, מקם עמודת התפלה בצינור מיקרוצנטריפוגה דל חלבון בנפח 1.7 מ"ל. הוסף את כל תמיסת הפפטיד החומצי לעמודה. סובב את העמוד (3,800 × גרם למשך 3 דקות) כך שהפתרון יזרום דרך העמודה. הפפטידים קשורים כעת לעמודה; מחק את הזרימה.
- הוסף 200 μL של תמיסת "Wash 1" לעמוד וסחרור (3,800 × גרם למשך 3 דקות, RT). מחק את הזרימה.
- הוסף 200 μL של תמיסת "Wash 2" לעמוד וסחרור (3,800 × גרם למשך 3 דקות, RT). מחק את הזרימה.
- העבר את העמודה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בעל תווית של 1.7 מ"ל קושר חלבון נמוך. הוסף 100 μL של תמיסת "Elute" לעמוד וספין (3,800 × גרם למשך 3 דקות, RT). הוסף עוד 100 μL של תמיסת "Elute" לעמוד וספין (3,800 × גרם למשך 3 דקות, RT). הפפטידים מדוללים כעת מהעמוד לתוך הצינור.
- מניחים את תמיסת הפפטיד בצנטריפוגת ואקום ומניחים לה להתייבש למשך הלילה. מניחים את הפפטידים המיובשים בטמפרטורה של -80°C עד שהם מוכנים לכימות, ומנתחים על ספקטרומטר המסות.
5. השעיית פפטיד וכימות
- מרחפים מחדש את הפפטידים המיובשים ב-20 מיקרוליטר של ממס A (0.1% חומצה פורמית, 2% אצטוניטריל).
- צנטריפוגה את הפפטידים המרחפים מחדש (17,200 × גרם למשך 10 דקות) כדי לשלשל כל פסולת בלתי מסיסה.
- הכן תקני פפטיד לבדיקת כימות פפטיד קולורימטרי.
- מניחים 5 μL של 1,000 מ"ג / מ"ל תמיסת מלאי פפטיד בבאר אחת של צלחת 96 בארות.
- בצע דילול סדרתי בן שבעה שלבים בצלחת עם מים שעברו דה-יוניזציה (DI), באופן הבא, עם 5 מיקרוליטר מכל תקן לכל באר: 1,000 מ"ג/מ"ל, 500 מ"ג/מ"ל, 250 מ"ג/מ"ל, 125 מ"ג/מ"ל, 62.5 מ"ג/מ"ל, 31.25 מ"ג/מ"ל ו-15.625 מ"ג/מ"ל. מניחים 5 μL של מים DI בבאר שמינית עבור החסר.
- מניחים 4 μL של מי DI בשלוש בארות נפרדות של צלחת 96 בארות. הוסף 1 μL של תמיסת פפטיד מרחף לכל באר, עבור נפח כולל של 5 μL.
הערה: בעת צפירת תמיסת הפפטיד לצורך כימות, יש לזלף בזהירות מראש התמיסה כדי למנוע הפרעה לפסולת שהתיישבה. - חשב כמה מגיב עובד נדרש (45 μL נדרש לכל באר). הכן את הנפח הנדרש של מגיב העבודה של הבדיקה הקולורימטרית; מערבול מגיב העבודה כדי להבטיח ערבוב נכון של הרכיבים.
- הוסף 45 μL של מגיב עובד לכל אחד הבארות תקן דגימה.
הערה: הפוך את התקנים לכפולים, והשתמש בצינור רב-ערוצי כדי להבטיח הבדל מינימלי בעיתוי של הוספת מגיב לבארות. - מכסים את הצלחת ברדיד אלומיניום ודגרים בטמפרטורה של 37°C למשך 15 דקות.
- נתח את הצלחת בקורא לוחות אוטומטי. השתמשו בערכי הספיגה שנרשמו בדגימות הסטנדרטיות ליצירת עקומה סטנדרטית ליניארית. קבע את המשוואה של העקומה הסטנדרטית והערך R2 . אם ערך R2 סביר (0.95 ≥), השתמש בעקומה הסטנדרטית כדי לקבוע את ריכוז הפפטידים המרחפים מחדש, תוך התחשבות בדילול פי חמישה בלוח הבדיקה הקולורימטרי.
6. ניתוח ספקטרומטריית מסות כרומטוגרפיה נוזלית טנדם (LC-MS/MS) של הפפטידים המעוכלים
- התאימו את ריכוז דגימות הפפטיד ל-0.2 מיקרוגרם/מיקרוליטר על ידי הוספת ממס A, והעבירו 10 מיקרוליטר לצינור בעל קשירת חלבון נמוכה של 0.6 מ"ל.
- מקם את הצינור בדוגם האוטומטי LC.
- הגדר את הפרמטרים LC ו- MS/MS, לפי איור 2 ואיור 3.
- הזריקו 5 μL (1 מיקרוגרם) של דגימת הפפטיד למערך LC-MS/MS לצורך ניתוח.
הערה: הגדרות LC-MS/MS המוצגות כאן מייצגות רק את האיורים. בהתאם לזמינות מכשירי LC ו- MS, משתמשים יכולים לשנות את ההגדרות עבור הפרמטרים LC הדרגתי ו- MS/MS כדי לקבל כיסוי פרוטאום עמוק. עבור מאמר זה, ניתוח נתוני MS בוצע באמצעות MaxQuant https://www.maxquant.org/, ניתוח נתונים משני בוצע באמצעות Perseus https://maxquant.net/perseus/, וניתוח מסלולים באמצעות https://reactome.org/.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עבור הניסוי הזה, אפיינו את הפרוטאום של פני השטח של קו תאי הגידול על-ידי סימון חלבוני קרום N-glycosylated של תאים שלמים עם ביוטין, והעשרת החלבונים המסומנים האלה מליזט התא כולו באמצעות משיכת נויטרווידין (איור 1). יתר על כן, ביצענו ניתוח פרוטאום באמצעות LC-MS/MS כדי לאפיין חלבונים מועשרים בפני השטח של התא. שלא כמו אנליזה של פרוטאום תאי שלם, כאן, המטרה הייתה לאפיין רק חלבונים על פני התא. לפיכך, התחלנו עם קלט מדגם של 3.5 × 107 AMO-1 plasmacytoma תאים. השגנו ריכוז פפטידים סופי של ~630 ננוגרם/מיקרוליטר בהתבסס על בדיקת כימות הפפטיד הקולרימטרי, והתשואה הכוללת הייתה ~12.6 מיקרוגרם של פפטידים (ב-20 מיקרוליטר) (איור 2A). לאחר מכן הזרקנו 1 מיקרוגרם של דגימת פפטיד למערכת LC-MS/MS, וחזרנו על ההזרקה שלוש פעמים עבור שכפולים טכניים. הפרמטרים LC ו-MS ששימשו עברו אופטימיזציה בהתבסס על ניסויים קודמים (איור 2C ואיור 3A). השתמשנו בשיפוע LC ארוך של 4 שעות כדי להבטיח כיסוי מקסימלי.
נתוני LC-MS/MS נותחו באמצעות MaxQuant; הצלחנו לזהות 2,221 חלבונים עם לפחות פפטיד ייחודי אחד, ו-1,764 חלבונים עם לפחות שני פפטידים ייחודיים בכל שלושת הרפליקטים. בסך הכל זוהו 12,307 פפטידים ייחודיים. קבענו את העשרת החלבונים בפני השטח של התא בדגימה באמצעות סקריפט Python (הסקריפט המדויק שבו השתמשנו נמצא באיור משלים S1) שמשווה את התוצאות שהתקבלו מ-MaxQuant למספר מערכי נתונים מבוססים של חלבוני פני התא. מערכי נתונים אלה כוללים את הנתונים שדווחו בעבר "במשטח סיליקו"3 ומערך נתונים שנקבע מחלבונים שסומנו כממברנה-לוקליזציה ב- UniProt13 (ערכות נתונים זמינות בטבלה משלימה S1). ניתוח זה הניב 601 חלבוני פני שטח במדגם שלנו (כ-27% מכלל החלבונים שזוהו) (איור 4A). בוצע ביאור אונטולוגיה גנטית (http://geneontology.org/), אשר הצביע על כ -30% מהחלבונים להיות ממוקמים באופן קנוני לקרום הפלזמה. ניתוח מסלול ריאקטום (https://reactome.org/) הצביע גם על העשרה יחסית של חלבוני הממברנה המעורבים בהובלה טרנס-ממברנית ובאינטראקציות בין פני השטח של התא (איור 5 וטבלה משלימה S2).
איור 1: זרימת עבודה לתיוג פני השטח של התא והכנת דגימות עוקבות לניתוח ספקטרומטריית מסות. ראשית, חלבונים על פני השטח של הדגימה התאית הרצויה מסומנים עם ביוטין. תאים אלה עוברים ליזה, ולאחר מכן דגירה עם חרוזי נויטרווידין הקושרים חלבונים המסומנים בביוטין. לאחר מכן החרוזים נשטפים שוב ושוב כדי להסיר חלבונים תוך תאיים ומזהמים אחרים. לאחר מכן דגימת החלבון עוברת עיכול על חרוזים בתוספת טריפסין. הדגימה המתקבלת של שברי פפטיד עוברת התפלה כדי להסיר מזהמים משלבי השטיפה והעיכול. לאחר מכן מייבשים את דגימת הפפטיד הסופית ומוכנים לעבור ניתוח ספקטרומטריית מסות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: עקומה סטנדרטית לכימות פפטיד קולורימטרי ושיפוע LC. (A) עקומה סטנדרטית בת שמונה נקודות הנוצרת על-ידי בדיקת כימות פפטיד קולורימטרי המשמשת לקביעת ריכוז הפפטיד בדגימות מעובדות. (B) איור של מערכת LC-MS/MS המשמשת לעיבוד דגימות. (C) שיפוע הכרומטוגרפיה הנוזלית וקצב הזרימה המשמשים להזרקת דגימות לספקטרומטר המסות. קיצורים: LC-MS/MS = כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: פרמטרים של ספקטרומטריית מסות וכרומטוגרמה מייצגת . (A) פרמטרים ששימשו לניסוי זה באמצעות ספקטרומטר מסות אורביטרפ. (B) כרומטוגרמה מייצגת הנוצרת על ידי ניתוח ספקטרומטריית מסות בעקבות פרוטוקול "לכידת פני השטח של התא" עבור שיפוע של 4 שעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניתוח העשרת חלבונים על פני התא והשוואה של שכפולים טכניים. מערכי נתונים אלה כוללים את " במשטח סיליקו"3 שדווח בעבר ומערך נתונים שנקבע מחלבונים שסומנו כממברנה-לוקליזציה ב-UniProt13. (A) מספר החלבונים והפפטידים שזוהו עם חתך שונה לאחר הסרת מזהמים, חלבונים הפוכים, וערך q > 0.05. (B) העלילה מייצגת את התפלגות החלבון שזוהה ואת ציוןאנדרומדה 14. (C) תרשים הפיזור מדגים את מתאם המדגם-לדגימה. מתאם הדירוג של ספירמן מודד את עוצמת וכיוון הקשר בין שני משתנים מדורגים. (D) עלילות קופסה המתארות את וריאציית הריצה לריצה. (E) תרשים הפצה לפי מדגם המייצג את איכות הנתונים של עותקים משוכפלים. קיצור: LFQ = כימות ללא תווית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ניתוח נתיבים. ניתוח המסלול בוצע באמצעות Reactome גרסה 8222. תיאור ממחיש של אינטראקציות פני השטח של התא בדופן כלי הדם, המציג את העשרת פרוטאום פני התא עבור אינטראקציות מפתח המעורבות באינטראקציה של טסיות הדם ולויקוציטים עם האנדותל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| שם מגיב | הרכב | אחסון | |||||
| 100 מילימטר ביוציטין הידרזיד | בצורת אבקה ביוציטין הידרזיד מומס ב-DMSO | יש לפצל ל-50 μL aliquots ולאחסן בטמפרטורה של -20°C למשך עד 6 חודשים. | |||||
| 160 mM נתרן metaperiodate (NaIO4) | NaIO4 מוצק מומס במי DI | יש לפצל ל-50 μL aliquots ולאחסן בטמפרטורה של -20°C למשך עד 6 חודשים. | |||||
| 2x RIPA Lysis Buffer | 2x RIPA Lysis Buffer, 1.25 mM EDTA, קוקטייל מעכב פרוטאז לשימוש חד פעמי | הכינו טרי בכל פעם לפני השימוש ב-10x RIPA Lysis Buffer. | |||||
| פפטיד Colorimetric Assay מגיב עבודה | 50% מגיב A, 48% מגיב B, 2% מגיב C | יש להכין טרי בכל פעם לפני השימוש. יש לאחסן רכיבים בטמפרטורה של 4°C. | |||||
| ממס א' | 0.1% חומצה פורמית, 2% אצטוניטריל | ניתן להכין מראש ולאחסן בטמפרטורת החדר | |||||
| חיץ כביסה 1 | 1x RIPA Lysis Buffer, 1 mM EDTA | ניתן להכין אצווה גדולה מראש ולאחסן בטמפרטורת החדר | |||||
| חיץ כביסה 2 | 1x PBS, 1 M NaCl | ניתן להכין אצווה גדולה מראש ולאחסן בטמפרטורת החדר | |||||
| חיץ כביסה 3 | 2 מטר אוריאה, 50 מ"מ אמוניום ביקרבונט | הכינו טרי בכל פעם, שכן אוריאה תתפרק במהירות עם הזמן. | |||||
טבלה 1: מאגרים ופתרונות ריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה.
איור משלים S1: סקריפט Python להשוואת תוצאות שהתקבלו מ- MaxQuant למספר מערכי נתונים מבוססים של חלבוני פני התא. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה S1: מערכי נתונים של חלבונים על פני התא. מערכי נתונים אלה כוללים את " במשטח סיליקו"3 שדווח בעבר ומערך נתונים שנקבע מחלבונים שסומנו כממברנה-לוקליזציה ב-UniProt13. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה S2: 10 המסלולים הרלוונטיים ביותר (ממוינים לפי ערך p ) מוצגים כאן. קיצורים: FDR = שיעור גילוי כוזב; SLC = נשא מומס; TCR = קולטן תא T. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות היא כלי רב עוצמה שאיפשר אפיון בלתי משוחד של אלפי חלבונים לא ידועים בקנה מידה בלתי אפשרי בעבר. גישה זו מאפשרת לנו לזהות ולכמת את החלבונים, כמו גם לדלות מגוון תובנות לגבי יכולות המבנה והאיתות של תאים ורקמות, על ידי אפיון מגוון החלבונים הקיימים בדגימה מסוימת. מעבר לפרופיל חלבונים גלובלי בדגימה, ספקטרומטריית מסות מאפשרת לנו לאפיין שינויים שונים לאחר תרגום (PTM) על חלבונים אלה, ומספקת הצצה עמוקה עוד יותר לשלבים של מסלולי איתות ודינמיקה של חלבונים שאינם זמינים בעת ניתוח ברמת הדנ"א או הרנ"א1. לקראת פיתוח טיפולים חדשניים לסרטן, פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות מאפשרת לנו להשוות את פרופיל החלבון של תאי גידול ממאירים לעומת רקמות בריאות, כדי לזהות מטרות פוטנציאליות הניתנות לתרופות.
התחום הצומח במהירות של אימונותרפיה לסרטן מסתמך על אנטיגנים המתבטאים על פני השטח של תאים ממאירים כדי לזהות ולהשמיד גידולים באופן סלקטיבי. מכיוון שהפיתוח של אימונותרפיה חדשה לסרטן מוגבל על ידי היעדר אנטיגנים ייחודיים ספציפיים לסרטן, אשר נעדרים ברקמות בריאות, חיוני לזהות אנטיגנים חדשים יותר ספציפיים לתאי הגידול15. אנטיגנים ספציפיים לגידול אינם חייבים להיות חלבונים מלאים ייחודיים לתא הגידול, אלא יכולים להיות גם קונפורמציות חלבונים ספציפיות או PTMs הנעדרים ברקמות בריאות16,17. ניתוח פרוטאומי של חלבונים על פני התא הן על תאים סרטניים והן על תאים בריאים יכול להניב מטרות אנטיגן ספציפיות לסרטן. פרוטאומיקה של פני השטח של התא דורשת העשרה של חלבוני פני השטח מליזט התא כולו לפני ניתוח ספקטרומטריית מסות, כדי להפחית את מורכבות הדגימה ולמנוע דיכוי יונים של חלבוני הממברנה הרצויים (לעתים קרובות בשפע נמוך) על ידי חלבונים תוך-תאיים בעלי ביטוי גבוה18. בעוד שאסטרטגיית לכידת פני השטח של התא המיושמת כאן היא אחת מגישות ההעשרה הנפוצות ביותר עבור פרוטאומיקה של פני השטח של התא, ישנן שיטות אחרות להעשרת חלבונים בפני השטח של התא ששולבו בתהליך עבודה של ספקטרומטריית מסות, כולל אולטרה-צנטריפוגה סלקטיבית של קרומי תאים, תיוג NHS-ביוטין של ליזין פני השטח, וביוטינילציה בתיווך אנזים של חלבוני פני התא19, 20. השוואות ראש בראש מצביעות על כך שגישת לכידת פני השטח של התא מספקת את האיזון האופטימלי של קלות השימוש והעשרה מוצלחת ובלתי משוחדת יחסית של חלבוני פני התא עם תיוג הרקע הנמוך ביותר של חלבונים תוך-תאיים20.
מאמר זה מציג פרוטוקול יעיל וחסכוני בזמן עבור זרימת עבודה של פרוטאומיקה של פני השטח של התא על-ידי שילוב תהליך התיוג והמשיכה של פני השטח של התא עם זרימת עבודה אופטימלית להכנת דגימות פרוטאומיקה (איור 1). ההליך כולו, מקצירת תאים בתרבית ועד ניתוח על ספקטרומטר המסות, יכול להיות מושג במשך 3 ימים. כדי להשיג את הכיסוי החזק ביותר של פרוטאום פני השטח, ייתכן שיהיה צורך למטב את הקלט הראשוני של התאים בהתבסס על סוג התא שבו נעשה שימוש. מומלץ לבצע ניסוי פיילוט עם קלט תאים משתנה, החל מכמה מיליוני תאים ועד 50 מיליון תאים, כדי להבטיח כיסוי מקסימלי. בנוסף, אם נצפתה כמות גדולה של חלבונים תוך-תאיים בעלי ביטוי גבוה, שטיפה מוגברת של חרוזי נויטרווידין לאחר הדגירה עם הליזט יכולה למזער קשירה לא ספציפית של חלבונים לחרוזים.
אנו ממליצים לבצע את הניסוי עם לפחות שלושה משכפלים ביולוגיים ושלושה משכפלים טכניים לכל מצב, כדי להגביר את הביטחון שהסמנים שזוהו בפני השטח של התא אכן קיימים ברוב התאים. בנוסף, בעת ביצוע תהליך העבודה של לכידת פני השטח של התא עבור סוג דגימה חדש, זה יכול להיות מועיל לנתח ליזט של תא שלם באמצעות גישת פרוטאומיקה קונבנציונלית של רובה ציד21, כדי להשוות עם תוצאות לכידת פני השטח של התא. ניתוח נתוני ספקטרומטריית המסה הגולמית יכול להתבצע על ידי חיפוש מסדי נתונים שונים וחבילות תוכנה - כאן, השתמשנו ב- MaxQuant - כדי להניב רשימה של חלבונים מזוהים22,23. ניתן לסנן רשימה זו מול מאגרי מידעידועים שונים 3,24 של חלבוני פני השטח כדי ליצור רשימה של חלבוני פני התא שזוהו בניסוי יחיד. לאחר שנקבעה רשימה של חלבונים על פני התא, ניתן לנתח אותם עוד יותר עבור תפקידם במסלולים ביוכימיים רלוונטיים25 או מועמדים ליעד תרופה26. תהליך עבודה זה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של סוגי תאים, כולל תרחיף ושורות תאים נצמדים (עבור תאים דבקים, אנו ממליצים להרים תאים ללא שימוש בטריפסין לפני הכנת הדגימה, כדי למנוע פיצול של חלבוני פני התא), כמו גם דגימות ראשוניות.
באמצעות זרימת עבודה זו, הצלחנו לאפיין בביטחון את פרוטאום פני התא של קו תאים מסוים. על ידי השוואת פרוטאום פני השטח של שורות תאי הגידול מול תאים בריאים, והצלבה עם מסד נתונים של ריצוף RNA עבור רקמות נורמליות, ניתן לקבוע רשימה של מטרות אימונותרפיות פוטנציאליות 8,13. מגבלה של שיטה זו היא שלמרות ההעשרה המשמעותית של חלבוני פני התא לעומת ניסוי ליזט סטנדרטי של כל התא, רוב החלבונים שזוהו על ידי ניתוח ספקטרומטריית מסות בתהליך עבודה זה עדיין מסומנים כתוך-תאיים. בהתאם לחומרת מסד הנתונים של חלבוני פני השטח שבהם נעשה שימוש, כ-25%-30% מהחלבונים שזוהו הם מפני השטח של התא. אנו צופים כי חלק משמעותי מהרקע הלא-פני השטח נובע ככל הנראה מחלבון רקע שאינו קשור באופן ספציפי לחרוזים (לדוגמה, כפי שמאופיין בניתוח CRAPome27), בעוד שאחרים מייצגים חדירה תאית של מגיב התיוג כדי להגיב עם חלבונים N-glycosylated ברשתית האנדופלסמית, Golgi, או תאים תוך-תאיים אחרים.
בעוד ששיטות חלופיות של אלוציית פפטידים, כגון טיפול ב-PNGase, מביאות להעשרה גדולה הרבה יותר של N-גליקוזיטים בין כלל הפפטידים שנותחו, גישה זו מאפשרת רק זיהוי של פפטידים גליקוזילטים בודדים, ומאבדת מידע רב ערך מהשארית הלא-גליקוזילטית של רצף החלבונים המשוך מטה12. מידע נוסף זה ניתן ללכוד באמצעות גישת טריפסיניזציה זו על חרוזים, אם כי בתמורה פוטנציאלית של ספציפיות מופחתת עבור חלבונים N-glycosylated מנותחים בספקטרומטר המסות. בנוסף, אפילו אלוציית PNGase אינה מתגברת על האתגר של סימון חלבונים מסוכררים תוך תאיים, ואלוטיון PNGase מוביל בדרך כלל לפפטיד אחד בלבד לכל חלבון; זה מוביל לשונות משמעותית בזיהוי חלבונים, על פי ניסיון המעבדה שלנו, בעוד שעיכול החרוזים המתואר כאן מוביל לפפטידים מרובים לכל חלבון שנלכד. לכן, בהתאם למטרת הניסוי, ניתן לבחור אסטרטגיות שונות ליישום אסטרטגיית לכידת פני השטח של התא. אסטרטגיות אלה כוללות מזעור ואוטומציה של פרוטוקול לכידת פני השטח של התא עבור קלט מדגם קטן28 ושימוש בחרוזי סטרפטווידין בעלי קיבולת קשירה משתנה29 בהתאם ליישום. השיטה וזרימת העבודה המתוארות כאן משמשות כאסטרטגיה כללית חזקה וקלה לביצוע להעשרת חלבונים על פני התא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר כמאל מנדל (המחלקה לרפואת מעבדה, UCSF) על העזרה בהקמת ריצת LC-MS/MS, Deeptarup Biswas (BSBE, IIT Bombay) על העזרה בניתוח נתונים, ולד"ר אודרי ריבס (המחלקה לרפואת מעבדה, UCSF) על העזרה בניתוח נתונים. עבודה קשורה במעבדת A.P.W. נתמכת על ידי NIH R01 CA226851 ו- Chan Zuckerberg Biohub. איור 1 ואיור 2B נוצרו באמצעות BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| 96X iST Sample Preparation Kit | PreOmics | P.O.00027 | Proteomics sample preparation kit. Includes reagents for reduction, alkylation, and digestion. Also include desalting columns and reagents. |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo | 23275 | Peptide quantification kit. Includes peptide standards and components of working reagents. |
| Reagents | |||
| Acetonitrile | Fisher | A955-1 | |
| Ammonium bicarbonate | Millipore Sigma | 09830-1KG | |
| Biocytin hydrazide | Biotium | 90060 | |
| D-PBS (w/o Calcium and Magnesium Salts) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003-225B01 | |
| Formic Acid | Honeywell | 94318 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Single-Use Cocktail | Thermo | 1861280 | |
| High Capacity Neutravidin Agarose Resin | Thermo | 29204 | |
| Phosphate Buffered Saline | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001-22J01 | |
| RIPA Lysis Buffer, 10x | Millipore Sigma | 20-188 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Sodium metaperiodate | Alfa Aesar | 13798 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | |
| Urea (Proteomics Grade) | VWR | M123-1KG | |
| Equipment | |||
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | |
| PrismR Microcentrifuge | Labnet International | C2500-R-230V | |
| Sonicator | VWR | Branson Sonifier 240 | |
| Vacuum Manifold | Promega | Promega Vac-Man | |
| Shaking Heatblock | Eppendorf | Eppendorf Thermomixer C | |
| End-to-End rotator | Labnet | Revolver Adjustable Rotator | |
| LC | Thermo | Ultimate 3000 HPLC and UHPLC | |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrapole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| Microplate Reader | Biotek | Biotek Synergy 2 | |
| Vacuum Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| Supplies | |||
| 1.5 mL Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | |||
| Filtration Columns | Bio-Rad | 7326008 | |
| Spin Columns | Thermo | 69725 |
References
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Aslam, B., Basit, M. B., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. Proteomics: technologies and their applications. Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).
- Bausch-Fluck, D., et al.
- Takahashi, Y., et al. Research advance in tumor specific antigens: A narrative review. AME Medical Journal. 6, 35 (2021).
- Li, Y., Qin, H., Ye, M. An overview on enrichment methods for cell surface proteome profiling. Journal of Separation Science. 43 (1), 292-312 (2020).
- Wollscheid, B., et al. Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins. Nature Biotechnology. 27 (4), 378-386 (2009).
- Chandler, K. B., Costello, C. C. Glycomics and glycoproteomics of membrane proteins and cell-surface receptors: present trends and future opportunities. Electrophoresis. 37 (11), 1407-1419 (2016).
- Ferguson, I. D., et al. The surfaceome of multiple myeloma cells suggests potential immunotherapeutic strategies and protein markers of drug resistance. Nature Communications. 13 (1), 4121 (2022).
- Karcini, A., Lazar, I. M. The SKBR3 cell-membrane proteome reveals telltales of aberrant cancer cell proliferation and targets for precision medicine applications. Scientific Reports. 12 (1), 10847 (2022).
- Köhnke, T., et al. Integrated multiomic approach for identification of novel immunotherapeutic targets in AML. Biomarker Research. 10 (1), 43 (2022).
- Verma, A., Kumar, V., Ghantasala, S., Mukherjee, S., Srivastava, S. Comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples. Journal of Visualized Experiments. (177), e61786 (2021).
- Leung, K. K., et al. Broad and thematic remodeling of the surfaceome and glycoproteome on isogenic cells transformed with driving proliferative oncogenes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (14), 7764-7775 (2020).
- Nix, M. A., et al. Surface proteomics reveals CD72 as a target for in vitro-evolved nanobody-based CAR-T cells in KMT2A/MLL1-rearranged B-ALL. Cancer Discovery. 11 (8), 2032-2049 (2021).
- Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
- Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
- Hosen, N., et al. The activated conformation of integrin β7 is a novel multiple myeloma-specific target for CAR T cell therapy. Nature Medicine. 23 (12), 1436-1443 (2017).
- Costa, A. F., Campos, D., Reis, C. A., Gomes, C. Targeting glycosylation: A new road for cancer drug discovery. Trends in Cancer. 6 (9), 757-766 (2020).
- Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface. Proteomics. Clinical Applications. 2 (6), 892-903 (2008).
- Itzhak, D. N., et al. A mass spectrometry-based approach for mapping protein subcellular localization reveals the spatial proteome of mouse primary neurons. Cell Reports. 20 (11), 2706-2718 (2017).
- Kirkemo, L. L., et al. Cell-surface tethered promiscuous biotinylators enable comparative small-scale surface proteomic analysis of human extracellular vesicles and cells. eLife. 11, 73982 (2022).
- Wojtkiewicz, M., Berg Luecke, L., Kelly, M. I., Gundry, R. L. Facile preparation of peptides for mass spectrometry analysis in bottom-up proteomics workflows. Current Protocols. 1 (3), 85 (2021).
- Välikangas, T., Suomi, T., Elo, L. L. A comprehensive evaluation of popular proteomics software workflows for label-free proteome quantification and imputation. Briefings in Bioinformatics. 19 (6), 1344-1355 (2018).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Bausch-Fluck, D., et al. A mass spectrometric-derived cell surface protein atlas. PLoS One. 10 (3), 0121314 (2015).
- Griss, J., et al. ReactomeGSA-efficient multi-omics comparative pathway analysis. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (12), 2115-2125 (2020).
- Waas, M., et al. SurfaceGenie: a web-based application for prioritizing cell-type-specific marker candidates. Bioinformatics. 36 (11), 3447-3456 (2020).
- Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).
- van Oostrum, M., et al. Classification of mouse B cell types using surfaceome proteotype maps. Nature Communications. 10 (1), 5734 (2019).
- Berg Luecke, L., Gundry, R. L. Assessment of streptavidin bead binding capacity to improve quality of streptavidin-based enrichment studies. Journal of Proteome Research. 20 (2), 1153-1164 (2021).
