Summary
여기에서는 다양한 세포 유형의 세포 표면 프로테옴의 특성화를 위한 프로테오믹스 워크플로우를 설명합니다. 이 워크플로우에는 세포 표면 단백질 농축, 후속 시료 전처리, LC-MS/MS 플랫폼을 사용한 분석, 특수 소프트웨어를 사용한 데이터 처리가 포함됩니다.
Abstract
지난 10년 동안 질량 분석 기반 단백질체학은 광범위한 응용 분야에서 생물학적 시스템의 심층적인 특성 분석을 가능하게 했습니다. 원형질막 단백질은 대부분의 임상적으로 승인된 치료제의 주요 표적일 뿐만 아니라 병든 세포를 건강한 조직과 진단적으로 구별하는 핵심 기능이기 때문에 인간 질병에서 세포 표면 프로테옴("surfaceome")은 상당한 관심을 받고 있습니다. 그러나 세포의 막 및 표면 단백질에 대한 집중적인 특성 분석은 주로 다른 고농도 단백질에 의해 관심 단백질을 가리는 세포 용해물의 복잡성으로 인해 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 이러한 기술적 장벽을 극복하고 질량분석법 단백질체학을 사용하여 다양한 세포 유형의 세포 표면 단백질체를 정확하게 정의하려면 질량분석기에서 분석하기 전에 세포 표면 단백질에 대한 세포 용해물을 농축해야 합니다. 이 논문은 암세포에서 세포 표면 단백질을 표지하고, 세포 용해물에서 이러한 단백질을 농축하고, 질량 분석 분석을 위한 후속 샘플 준비에 대한 자세한 워크플로우를 제시합니다.
Introduction
단백질은 대부분의 세포 기능이 수행되는 기본 단위 역할을 합니다. 관련 단백질의 구조와 기능을 특성화하는 것은 생물학적 과정을 이해하는 데 필수적인 단계입니다. 지난 10년 동안 질량 분석 기술, 분석 소프트웨어 및 데이터베이스의 발전으로 단백질을 단백질 전체 규모로 정확하게 검출하고 측정할 수 있게 되었습니다1. 질량분석법 기반 단백질체학은 생화학적 경로의 기초 과학 분석부터 번역 환경에서의 새로운 약물 표적 식별, 클리닉의 질병 진단 및 모니터링에 이르기까지 다양한 응용 분야에서 활용될 수 있습니다2. 새로운 약물 표적을 스크리닝할 때 세포 표면 단백질체의 특성 분석이 특히 중요하며, 현재 승인된 인체 약물의 65% 이상이 세포 표면 단백질을 표적으로 합니다3. 암 면역요법 분야는 또한 종양 세포를 표적으로 삼고 특이적으로 제거하기 위해 암 특이적 세포 표면 항원에 전적으로 의존한다4. 따라서 질량 분석 기반 단백질체학은 치료 개입을 위한 새로운 세포 표면 단백질을 식별하는 유망한 도구 역할을 할 수 있습니다.
그러나 새로운 세포 표면 단백질 표적에 대해 종양 세포를 조사하기 위해 기존의 단백질체학 방법을 사용할 때 몇 가지 한계가 있습니다. 주요 관심사는 표면 단백질이 세포의 전체 단백질 분자 중 매우 작은 부분을 구성한다는 것입니다. 그러므로, 이들 단백질의 단편은 전체 세포 용해물5의 질량 분석 분석을 수행할 때 높은 농도의 세포내 단백질에 의해 가려진다. 이러한 한계로 인해 기존의 단백질체학 워크플로우로 세포 표면 단백질체를 정확하게 특성화하는 것이 어렵습니다. 이 문제를 해결하려면 질량분석기에서 분석하기 전에 전체 세포 용해물에서 세포 표면 단백질을 풍부하게 하는 방법을 개발해야 합니다. 그러한 방법 중 하나는 손상되지 않은 세포에서 글리코실화된 세포 표면 단백질의 산화 및 비오틴 표지, 그리고 뉴트라비딘 풀다운을 사용하여 용해물에서 이러한 비오티닐화된 단백질을 농축하는 것을 포함하며, 이 과정을 "세포 표면 포획"이라고 합니다6. 포유류 세포 표면 단백질의 ~85%가 글리코실화(glycosylation)된 것으로 생각되기 때문에7, 이는 전체 세포 용해물에서 세포 표면 프로테옴을 풍부하게 하는 효과적인 방법으로 작용한다. 이 백서는 배양된 세포부터 시작하여 세포 표면 비오틴 라벨링과 질량분석법 분석을 위한 후속 시료 전처리의 전체 워크플로우에 대해 설명합니다(그림 1). 여러 번의 반복에 걸쳐, 이 방법은 특정 샘플의 세포 표면 프로테옴에 대한 강력한 커버리지를 제공합니다. 종양 및 건강한 세포 모두의 세포 표면 프로테옴을 특성화하기 위해 이 방법을 활용하면 잠재적인 면역치료 표적을 식별하기 위한 새로운 세포 표면 항원의 발견을 용이하게 할 수 있다8.
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Protocol
참고: AMO1 형질세포종 세포가 이 세포 표면 프로테옴 실험에 사용되었습니다. 동일한 프로토콜이 다양한 종류의 1차 샘플(10)뿐만 아니라 다양한 종류의 현탁액(suspension) 및 부착성 세포주(ad부착 세포주)9를 포함한 다른 세포 유형에도 사용될 수 있다. 그러나, 세포 수(실험을 위한 출발 물질)는 전형적으로 동등한 프로테옴 커버리지에 대해 최적화되어야 한다. 재료 및 장비와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 완충액과 시약 용액 및 그 조성에 대한 자세한 내용은 표 1을 참조하십시오.
1. 비오틴을 이용한 세포 표면 표지
- 배양된 세포를 원심분리(500 × g, 24°C에서 5분)× 약 3.5 7개의 살아있는 세포를 펠렛으로 계수한다.
참고: AMO1 형질세포종 세포는 수확 전 3일마다 새로운 배지로 계대배양되었습니다. - 상층액을 흡인하고 1mL의 저온(4°C) Dulbecco's phosphate-buffered saline(D-PBS)(칼슘 없음, 마그네슘 없음)을 추가하고 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 재현탁합니다.
- 세포를 다시 펠렛화하고(단계 1.1에서와 같이) 세척 단계(단계 1.2)를 한 번 더 반복합니다(총 2회 세척).
- 2차 세척 후, 세포를 펠렛화하고(단계 1.1에서와 같이) 부드럽게 피펫팅하여 990μL의 차가운 D-PBS에 재현탁합니다.
- 미리 160mM 나트륨 메타 페리 에이트 (NaIO4)의 원액을 준비하십시오. 50 μL 분취량으로 분할하고 -20 °C에서 최대 6개월 동안 보관합니다. 1.4 단계의 세포 현탁액에 160 mM 나트륨 메타페리오데이트 용액 10 μL를 첨가하고, 완전히 혼합하고, 4°C에서 20분 동안 종단 간 로터에서 인큐베이션한다.
- 인큐베이션이 완료된 후, 세포를 펠렛화하고(단계 1.1에서와 같이), 상층액을 경사 제거하고, 차가운 D-PBS 1 mL에 재현탁한다. 이 세척 단계를 두 번 반복합니다(총 3회 세척). 3차 세척 후, 세포를 989 μL의 D-PBS에 재현탁시켰다.
- 미리 100 mM 바이오 시틴 히드라 지드의 원액을 준비하십시오. 50μL 분취량으로 분할하고 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관합니다. 1.6 단계의 세포 현탁액에 아닐린 1 μL과 100 mM 바이오 시틴 히드라 지드를 첨가하고, 완전히 혼합하고, 4 °C에서 60 분 동안 종단 간 로터에서 배양한다.
- 인큐베이션이 완료된 후, 세포를 펠렛화하고(단계 1.1에서와 같이), 상층액을 경사 제거하고, 차가운 D-PBS 1 mL에 재현탁한다. 이 세척 단계를 두 번 반복합니다(총 3회 세척).
- 3차 세척 후, 상청액을 피펫으로 조심스럽게 흡인하고, 튜브를 액체N2에 넣어 세포 펠릿을 스냅-동결시킨다. 냉동 펠릿을 -80 °C에 놓습니다., 용해 및 풀다운을 진행할 준비가 될 때까지.
2. 세포 용해 및 비오틴 풀다운
- 얼어 붙은 세포 펠릿을 얼음 위에서 해동하십시오.
- 500μL의 2x 용해 완충액을 펠릿에 넣고 완전히 혼합한 다음 30초 동안 소용돌이칩니다.
알림: 펠릿을 완전히 용해하기 위해 격렬한 피펫팅 및 와류가 필요할 수 있습니다. 일부 불용성 파편 (즉, DNA)은 후속 초음파 처리 단계에서 제거되기 때문에 허용됩니다. - 얼음 위에서 세포 용해물을 초음파 처리합니다 (3 회 버스트, 각각 20 초, 60 % 듀티 사이클).
- 용해물을 원심분리하여 남아 있는 파편을 펠릿화합니다(4°C에서 17,200g에서 10 분×).
- 용해물이 원심분리되는 동안 100μL의 뉴트라비딘 아가로스 수지 비드를 여과 컬럼에 추가합니다. 컬럼을 진공 매니폴드에 부착하고 부드러운 진공을 적용한 다음 세척 버퍼 1 3mL를 그 위에 흘려 비드를 세척합니다.
- 진공 매니폴드에서 여과 컬럼을 제거하고, 바닥을 덮고, 정화된 세포 용해물을 비드가 있는 컬럼에 추가합니다. 컬럼의 상단을 캡핑하고 4°C에서 120분 동안 종단 간 로터에서 비드와 함께 용해물을 배양합니다.
알림: 컬럼 상단을 캡핑할 때 하단 캡을 제자리에 단단히 고정하십시오., 그렇지 않으면 배양 중에 제거되어 세포 용해물이 누출될 수 있습니다. - 세척 완충액 1, 2 및 3(시료당 각 세척 완충액 약 5mL, 표 1 참조)을 준비하고 42°C 수조에 넣습니다
- 용해물이 배양을 마친 후 여과 컬럼을 진공 매니폴드에 다시 놓고 부드러운 진공을 적용한 다음 5mL의 세척 완충액 1을 그 위에 흘려 비드를 세척합니다.
알림: 5mL 이상의 세척 버퍼를 세척에 사용할 수 있습니다. 추가 세척은 비드에 대한 배경, 비특이적 결합을 줄일 수 있습니다. - 5mL의 세척 완충액 2로 세척 단계를 반복합니다.
- 5mL의 세척 완충액 3으로 세척 단계를 반복합니다.
- 최종 세척 버퍼가 비드를 통해 완전히 흐르면 매니폴드에서 컬럼을 제거합니다. 100μL의 "Lyse" 용액을 비드에 넣고 피펫이 있는 1.7mL 저단백질 결합 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브를 짧게 돌려 비드를 침전시키고 침전된 비드를 방해하지 않고 용액 50μL를 제거합니다.
참고: 이 단계와 모든 후속 단계의 시약은 상업적으로 이용 가능한 프로테오믹스 샘플 준비 키트를 사용합니다. 이 키트는 최적화되고 단순화된 시료 전처리 워크플로우를 제공합니다. 그러나 이러한 단계는 Verma et al.9에 설명된 대로 기존 단백질체학 워크플로우를 사용하여 키트와 독립적으로 수행할 수도 있습니다. 비드가 컬럼의 측면이나 바닥에 붙어 있는 경우 튜브로 옮겨진 비드가 가라앉도록 하고 튜브에 여분의 "용해" 용액을 사용하여 나머지 비드를 옮깁니다. - 튜브를 65°C의 히트 블록/셰이커에 놓고 1,000rpm에서 10분 동안 흔들어 줍니다.
참고: 이 단계는 소화 전에 시스테인 잔기의 환원 및 알킬화에 필요합니다.
3. 단백질 소화
- 건조된 트립신(키트 내의 "다이제스트" 튜브, -20°C에서 보관)을 210 μL의 "재현탁" 용액에 첨가하여 재현탁한다. 건조된 모든 트립신이 재현탁되도록 용액을 여러 번 위아래로 피펫팅합니다.
- 배양이 완료된 후 재현탁된 트립신 용액 50μL를 비드에 추가합니다. 튜브를 37°C에서 인큐베이션하고, 단백질을 소화하기 위해 적어도 90분 동안 500rpm에서 진탕한다.
- 분해가 완료되면 비드가 포함된 용액을 스핀 컬럼으로 옮기고 컬럼을 1.7mL 저단백질 결합 미세 원심분리 튜브에 삽입합니다. 튜브(실온[RT]에서 5분 동안 500 × g )를 회전시켜 비드로부터 분해된 펩타이드 용액을 분리한다.
참고: 이 단계에서 펩타이드 용액에서 분리된 비드에 대해 PNGase 처리를 수행하여 스트렙타비딘 비드에서 비오티닐화된 펩타이드 단편을 용출할 수 있습니다. 그런 다음 이 펩타이드 샘플은 비드 트립신 처리의 1차 샘플과 분석 및 비교할 수 있는 별도의 2차 펩타이드 샘플로 워크플로우의 나머지 부분을 통해 이월될 수 있습니다. PNGase 접근법은 MS-검출 가능한 측쇄 변형을 기반으로 포획된 N-글리코실화 아스파라긴에 대한 추가 특이성을 고려할 때 비드 트립신 처리에 대한 보완적인 데이터를 제공할 가능성이 높습니다12. 그러나 이 순차적 용리 접근법의 단점은 샘플 분석당 질량 분석기 기기 시간의 두 배가 필요하다는 것입니다. - "Stop" 용액 100μL를 추가하여 소화 반응을 중지하고 펩타이드 용액을 산성화합니다.
4. 펩타이드 탈염
- 튜브 어댑터를 사용하여 탈염 컬럼을 1.7mL 저단백질 결합 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다. 산성화된 펩타이드 용액 전체를 컬럼에 추가합니다. 용액이 컬럼을 통해 흐르도록 컬럼을 회전시킵니다(3분 동안 3,800× g ). 펩티드는 이제 컬럼에 결합됩니다. 플로우 스루를 폐기하십시오.
- 200 μL의 "Wash 1" 용액을 컬럼에 넣고 회전시킵니다(3분 동안 3,800 × g , RT). 플로우 스루를 폐기합니다.
- 200 μL의 "Wash 2" 용액을 컬럼에 넣고 회전시킵니다(3분 동안 3,800 × g , RT). 플로우 스루를 폐기합니다.
- 컬럼을 라벨이 붙은 새로운 1.7mL 저단백질 결합 미세원심분리기 튜브로 옮깁니다. 100 μL의 "용리" 용액을 컬럼에 넣고 스핀합니다(3분 동안 3,800 × g , RT). 또 다른 100 μL의 "용리" 용액을 컬럼에 추가하고 스핀합니다(3분 동안 3,800 × g , RT). 펩타이드는 이제 컬럼에서 튜브로 용출됩니다.
- 펩타이드 용액을 진공 원심분리기에 넣고 밤새 건조시킵니다. 정량화할 준비가 될 때까지 건조된 펩타이드를 -80°C에 놓고 질량분석기에서 분석합니다.
5. 펩타이드 재현탁 및 정량화
- 건조된 펩타이드를 20μL의 용매 A(0.1% 포름산, 2% 아세토니트릴)에 재현탁합니다.
- 재현탁된 펩타이드(10분 동안 17,200× g )를 원심분리하여 불용성 파편을 펠릿화합니다.
- 비색 펩타이드 정량 분석을 위한 펩타이드 표준물질을 준비합니다.
- 1,000mg/mL 펩타이드 원액 5μL를 96웰 플레이트의 한 웰에 넣습니다.
- 플레이트에서 웰당 각 표준물질 5μL(1,000mg/mL, 500mg/mL, 250mg/mL, 125mg/mL, 62.5mg/mL, 31.25mg/mL 및 15.625mg/mL)로 탈이온수(DI)를 사용하여 7단계 연속 희석을 수행합니다. 블랭크의 여덟 번째 우물에 5μL의 DI 물을 넣습니다.
- 4μL의 DI 물을 96웰 플레이트의 3개의 개별 웰에 넣습니다. 재현탁된 펩타이드 용액 1μL를 각 웰에 추가하여 총 부피가 5μL가 되도록 합니다.
참고: 정량화를 위해 펩타이드 용액을 피펫팅할 때 침전된 파편이 방해받지 않도록 용액 상단에서 조심스럽게 피펫팅합니다. - 필요한 작업 시약의 양을 계산합니다(웰당 45μL 필요). 비색 분석 작업 시약의 필요한 부피를 준비합니다. 구성 요소의 적절한 혼합을 보장하기 위해 작업 시약을 소용돌이.
- 45 μL의 작업 시약을 각 표준물질 및 샘플 웰에 추가합니다.
알림: 표준물질을 이중으로 만들고 다중 채널 피펫을 사용하여 시약이 웰에 추가되는 타이밍의 차이를 최소화합니다. - 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
- 자동 플레이트 리더에서 플레이트를 분석합니다. 표준 샘플에 대해 기록된 흡광도 값을 사용하여 선형 표준 곡선을 생성합니다. 표준 곡선과R2 값의 방정식을 구한다. R2 값이 합리적인 경우(≥0.95), 표준 곡선을 사용하여 비색 분석 플레이트에서 5배 희석을 차지하는 재현탁 펩타이드의 농도를 결정합니다.
6. 분해된 펩타이드의 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법(LC-MS/MS) 분석
- 용매 A를 첨가하여 펩타이드 샘플의 농도를 0.2μg/μL로 조정하고 10μL를 0.6mL 저단백질 결합 튜브에 옮깁니다.
- 튜브를 LC 자동 시료 주입기에 넣습니다.
- 그림 2 및 그림 3에 따라 LC 및 MS/MS 매개변수를 설정합니다.
- 분석을 위해 펩타이드 샘플 5μL(1μg)을 LC-MS/MS 설정에 주입합니다.
알림: 여기에 표시된 LC-MS/MS 설정은 그림의 대표용일 뿐입니다. LC 및 MS 기기 가용성에 따라 사용자는 LC 그래디언트 및 MS/MS 파라미터에 대한 설정을 수정하여 심층적인 프로테옴 커버리지를 얻을 수 있습니다. 본 논문에서는 MS 데이터 분석은 MaxQuant https://www.maxquant.org/ 을, 2차 데이터 분석은 Perseus https://maxquant.net/perseus/ 을, 경로 분석은 https://reactome.org/ 를 이용하여 수행하였다.
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Representative Results
이 실험을 위해 우리는 온전한 세포의 N-글리코실화된 막 단백질을 비오틴으로 표지하고 뉴트라비딘 풀다운으로 전체 세포 용해물에서 이러한 표지된 단백질을 농축하여 종양 세포주의 세포 표면 프로테옴을 특성화했습니다(그림 1). 또한, 풍부한 세포 표면 단백질을 특성화하기 위해 LC-MS/MS를 사용하여 프로테옴 분석을 수행했습니다. 전체 세포 프로테옴 분석과 달리 여기서는 세포 표면 단백질만을 특성화하는 것이 목표였습니다. 따라서 우리는 3.5 × 107 AMO-1 형질세포종 세포의 샘플 입력으로 시작했습니다. 비색 펩타이드 정량 분석에 기초하여 ~630 ng/μL의 최종 펩타이드 농도를 얻었고, 총 수율은 ~12.6 μg의 펩타이드(20 μL)였습니다(그림 2A). 그런 다음 1μg의 펩타이드 샘플을 LC-MS/MS 시스템에 주입하고 기술 복제를 위해 주입을 세 번 반복했습니다. 사용된 LC 및 MS 파라미터는 이전 실험을 기반으로 최적화되었습니다(그림 2C 및 그림 3A). 최대 커버리지를 보장하기 위해 4시간의 긴 LC 그래디언트를 활용했습니다.
LC-MS/MS 데이터는 MaxQuant를 사용하여 분석되었습니다. 우리는 3개의 복제물 모두에서 적어도 하나의 고유한 펩타이드를 가진 2,221개의 단백질과 적어도 2개의 고유한 펩타이드를 가진 1,764개의 단백질을 식별할 수 있었습니다. 총 12,307개의 고유한 펩타이드가 확인되었습니다. MaxQuant에서 얻은 결과를 세포 표면 단백질의 여러 확립된 데이터 세트와 비교하는 Python 스크립트(우리가 사용한 정확한 스크립트는 보충 그림 S1에서 찾을 수 있음)를 활용하여 샘플에서 세포 표면 단백질 농축을 결정했습니다. 이러한 데이터 세트에는 이전에 보고된 "인실리코 서피스톰(in silico surfaceome)"3 과 UniProt13 에서 막 국소화로 주석이 달린 단백질에서 설정된 데이터 세트가 포함됩니다(데이터 세트는 보충 표 S1에서 사용 가능). 이 분석은 샘플에서 601개의 표면 단백질(확인된 모든 단백질의 약 27%)을 산출했습니다(그림 4A). 유전자 온톨로지 주석(http://geneontology.org/)이 수행되었으며, 이는 단백질의 약 30%가 원형질막에 정식으로 국한됨을 나타냅니다. 반응기 경로 분석(https://reactome.org/)은 또한 막횡단 수송 및 세포 표면 상호작용에 관여하는 막 단백질의 상대적 농축을 나타냈습니다(그림 5 및 보충 표 S2).
그림 1: 질량 분석 분석을 위한 세포 표면 라벨링 및 후속 시료 전처리를 위한 워크플로우. 먼저, 원하는 세포 샘플의 표면에 있는 단백질에 비오틴이 표지됩니다. 그런 다음 이 세포를 용해한 다음 비오틴 표지 단백질에 결합하는 뉴트라비딘 비드로 배양합니다. 그런 다음 비드를 반복적으로 세척하여 세포 내 단백질 및 기타 오염 물질을 제거합니다. 그런 다음 단백질 샘플은 트립신을 첨가하여 비드 분해를 거칩니다. 펩타이드 단편의 생성 된 샘플은 세척 및 소화 단계에서 오염 물질을 제거하기 위해 탈염을 거칩니다. 그런 다음 최종 펩타이드 샘플을 건조하고 질량 분석 분석을 수행할 준비가 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 비색 펩타이드 정량 표준 곡선 및 LC 그래디언트. (A) 처리된 샘플에서 펩타이드 농도를 결정하는 데 사용되는 비색 펩타이드 정량 분석에 의해 생성된 8점 표준 곡선. (B) 샘플 처리에 사용되는 LC-MS/MS 시스템의 그림. (C) 질량 분석기에 샘플을 주입하는 데 사용되는 액체 크로마토그래피 구배 및 유속. 약어: LC-MS/MS = 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 질량분석법 파라미터 및 대표 크로마토그램 . (A) Orbitrap 질량분석기를 사용한 이 실험에 사용된 파라미터. (B) 4시간 구배에 대한 "세포 표면 캡처" 프로토콜에 따른 질량 분석 분석에 의해 생성된 대표적인 크로마토그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 세포 표면 단백질 농축 분석 및 기술 복제물 비교. 이러한 데이터 세트에는 이전에 보고된 "인실리코 서피스톰(in silico surfaceome)"3 과 UniProt13에서 막 국소화(membrane-localed)로 주석이 달린 단백질로 설정된 데이터 세트가 포함됩니다. (A) 오염 물질, 역 단백질 및 q-값을 제거한 후 다른 컷오프로 확인된 단백질 및 펩타이드의 수는 0.05>. (B) 플롯은 확인된 단백질의 분포와 안드로메다 점수14를 나타냅니다. (C) 산점도는 표본 간 상관 관계를 보여줍니다. Spearman의 순위 상관 계수는 순위가 매겨진 두 변수 간의 연관 강도와 방향을 측정합니다. (D) 런 투 런(run-to-run) 변동을 묘사하는 상자 그림. (E) 반복실험의 데이터 품질을 나타내는 표본별 분포도. 약어: LFQ = label-free quantitation. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 경로 분석. 경로 분석은 Reactome version 8222를 사용하여 수행하였다. 혈소판 및 백혈구와 내피 상호 작용에 관련된 주요 상호 작용에 대한 세포 표면 프로테옴의 농축을 나타내는 혈관벽에서의 세포 표면 상호 작용의 예시 묘사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시약 이름 | 구성 | 보관 | |||||
| 100mM 바이오시틴 히드라지드 | DMSO에 용해된 분말 형태의 바이오시틴 히드라지드 | 50 μL 분취량으로 분할하고 -20 °C에서 최대 6개월 동안 보관합니다. | |||||
| 160mM 나트륨 메타 페리 에이트 (NaIO4) | DI 물에 용해된 고체 NaIO4 | 50 μL 분취량으로 분할하고 -20 °C에서 최대 6개월 동안 보관합니다. | |||||
| 2x RIPA 용해 버퍼 | 2x RIPA 용해 완충액, 1.25mM EDTA, 일회용 프로테아제 억제제 칵테일 | 10x RIPA 용해 버퍼를 사용하기 전에 매번 신선하게 준비하십시오. | |||||
| 펩타이드 비색 분석 작업 시약 | 50% 시약 A, 48% 시약 B, 2% 시약 C | 사용하기 전에 매번 신선하게 준비하십시오. 구성품을 4°C에서 보관하십시오. | |||||
| 용매 A | 0.1% 포름산, 2% 아세토니트릴 | 미리 준비하고 실온에서 보관할 수 있습니다. | |||||
| 세척 버퍼 1 | 1x RIPA 용해 버퍼, 1mM EDTA | 미리 대량 배치를 준비하고 실온에서 보관할 수 있습니다. | |||||
| 세척 버퍼 2 | PBS 1개, NaCl 1개 | 미리 대량 배치를 준비하고 실온에서 보관할 수 있습니다. | |||||
| 세척 버퍼 3 | 2 M 요소, 50 mM 중탄산암모늄 | 요소는 시간이 지남에 따라 빠르게 분해되므로 매번 신선하게 준비하십시오. | |||||
표 1: 이 프로토콜에 사용된 버퍼 및 시약 용액.
보충 그림 S1: MaxQuant에서 얻은 결과를 세포 표면 단백질의 여러 확립된 데이터 세트와 비교하기 위한 Python 스크립트입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 S1: 세포 표면 단백질의 데이터 세트. 이러한 데이터 세트에는 이전에 보고된 "인실리코 서피스톰(in silico surfaceome)"3 과 UniProt13에서 막 국소화(membrane-localed)로 주석이 달린 단백질로 설정된 데이터 세트가 포함됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 S2: 가장 관련성이 높은 10가지 경로( p 값으로 정렬)가 여기에 제시되어 있습니다. 약어: FDR = 거짓 발견률; SLC = 용질 담체; TCR = T 세포 수용체. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
질량분석법 기반 단백질체학은 이전에는 불가능했던 규모로 수천 개의 알려지지 않은 단백질을 편견 없이 특성화할 수 있는 강력한 도구입니다. 이 접근법을 통해 단백질을 식별하고 정량화할 수 있을 뿐만 아니라 특정 샘플에 존재하는 다양한 단백질을 특성화하여 세포 및 조직의 구조적 및 신호 전달 능력에 대한 다양한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 시료의 글로벌 단백질 프로파일링을 넘어 질량분석법을 통해 이러한 단백질에 대한 다양한 번역 후 변형(PTM)을 특성화할 수 있으며, DNA 또는 RNA 레벨1에서 분석할 때 사용할 수 없는 신호 전달 경로 및 단백질 역학의 단계를 훨씬 더 깊이 엿볼 수 있습니다. 새로운 암 치료제 개발을 위해 질량 분석 기반 단백질체학을 통해 악성 종양 세포와 건강한 조직의 단백질 프로필을 비교하여 잠재적인 약물 치료 가능한 표적을 식별할 수 있습니다.
빠르게 성장하는 암 면역 요법 분야는 악성 세포 표면에 발현되는 항원에 의존하여 종양을 식별하고 선택적으로 파괴합니다. 새로운 암 면역요법의 개발은 건강한 조직에는 존재하지 않는 독특한 암 특이적 항원의 부족으로 인해 제한되기 때문에 종양 세포에 특이적인 더 많은 새로운 항원을 식별하는 것이 중요합니다15. 종양 특이적 항원은 종양 세포에 고유한 전체 단백질일 필요는 없지만, 건강한 조직에는 없는 특이적 단백질 형태 또는 PTM일 수도 있다16,17. 종양 세포와 건강한 세포 모두에서 세포 표면 단백질의 단백질체 분석은 새로운 암 특이적 항원 표적을 산출할 수 있습니다. 세포 표면 단백질체학은 시료의 복잡성을 줄이고 고도로 발현된 세포내 단백질에 의한 원하는 막 단백질(종종 낮은 존재비)의 이온 억제를 피하기 위해 질량분석법 분석 전에 전체 세포 용해물에서 표면 단백질을 농축해야 한다18. 여기에 사용된 세포 표면 포획 전략은 세포 표면 단백질체학에 가장 일반적으로 사용되는 농축 접근법 중 하나이지만, 세포막의 선택적 초원심분리, 표면 라이신의 NHS-비오틴 라벨링, 세포 표면 단백질의 효소 매개 비오티닐화를 포함하여 질량 분석 워크플로우와 통합된 세포 표면 단백질 농축을 위한 다른 방법도 있습니다19. 20. 일대일 비교는 세포 표면 포획 접근법이 세포 내 단백질의 배경 표지가 가장 낮게 사용 편의성과 성공적이고 상대적으로 편향되지 않은 세포 표면 단백질 농축 사이의 최적의 균형을 제공한다는 것을 시사한다20.
이 백서는 세포 표면 라벨링 및 풀다운 절차를 최적화된 단백질체학 시료 전처리 워크플로우와 통합하여 세포 표면 단백질체학 워크플로우를 위한 효과적이고 시간 효율적인 프로토콜을 제시합니다(그림 1). 배양된 세포 수확에서 질량 분석기 분석에 이르기까지 전체 절차를 3일 동안 수행할 수 있습니다. 표면 프로테옴의 가장 강력한 커버리지를 얻으려면 사용 중인 세포 유형에 따라 세포의 초기 입력을 최적화해야 할 수 있습니다. 최대 커버리지를 보장하기 위해 수백만 개의 셀에서 최대 5천만 개의 셀에 이르는 다양한 셀 입력으로 파일럿 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 또한, 다량의 고도로 발현되는 세포내 단백질이 관찰되는 경우, 용해물과 함께 배양한 후 뉴트라비딘 비드의 세척을 증가시키면 비드에 대한 단백질의 비특이적 결합을 최소화할 수 있습니다.
식별된 세포 표면 마커가 실제로 대부분의 세포에 존재한다는 확신을 높이기 위해 조건당 최소 3개의 생물학적 복제물과 3개의 기술적 복제로 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 또한 새로운 샘플 유형에 대한 세포 표면 포획 워크플로우를 수행할 때 기존의 샷건 프로테오믹스 접근법21을 사용하여 전체 세포 용해물을 분석하여 세포 표면 포획 결과와 비교하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 원시 질량 분광분석 데이터의 분석은 다양한 데이터베이스 검색 및 소프트웨어 패키지에 의해 수행될 수 있다 - 여기서, 우리는 MaxQuant를 사용하여 확인된 단백질 목록을 산출하였다22,23. 이 리스트는 단일 실험에서 확인된 세포 표면 단백질의 리스트를 확립하기 위해 표면 단백질의 다양한 공지된 데이터베이스(3,24)에 대해 필터링될 수 있다. 일단 세포 표면 단백질의 리스트가 확립되면, 이들은 관련 생화학적 경로(25) 또는 약물 표적 후보(26)에서의 역할에 대해 추가로 분석될 수 있다. 이 워크플로우는 1차 시료뿐만 아니라 현탁액 및 부착성 세포주(부착 세포의 경우 세포 표면 단백질의 절단을 방지하기 위해 시료 전처리 전에 트립신을 사용하지 않고 세포를 리프팅하는 것이 좋습니다)를 포함한 다양한 세포 유형에 적용할 수 있습니다.
이 워크플로우를 사용하여 특정 세포주의 세포 표면 프로테옴을 자신 있게 특성화할 수 있었습니다. 종양 세포주의 표면 프로테옴을 건강한 세포와 비교하고 정상 조직에 대한 RNA 시퀀싱 데이터베이스와 상호 참조함으로써 잠재적인 면역치료 표적 목록을 설정할 수 있습니다 8,13. 이 방법의 한계는 표준 전체 세포 용해물 실험에 비해 세포 표면 단백질이 상당히 풍부함에도 불구하고 이 워크플로우에서 질량 분석 분석으로 식별된 대부분의 단백질이 여전히 세포 내로 주석이 달려 있다는 것입니다. 사용된 표면 단백질 데이터베이스의 엄격성에 따라 확인된 단백질의 약 25%-30%가 세포 표면에서 나온 것입니다. 우리는 비표면 배경의 상당 부분이 비드에 비특이적으로 결합된 배경 단백질에서 나올 가능성이 있는 반면(예: CRAPome27 분석에 의해 특성화됨), 다른 것들은 소포체, 골지 또는 기타 세포 내 구획에서 N-글리코실화된 단백질과 반응하기 위한 표지 시약의 세포 침투를 나타냅니다.
PNGase 처리와 같은 대체 펩티드 용출 방법은 분석된 전체 펩티드 중에서 N-글리코사이트를 훨씬 더 풍부하게 하는 반면, 이 접근법은 개별 글리시오실화된 펩티드의 식별만을 허용하고, 풀다운된 단백질 서열12의 비당화되지 않은 나머지로부터 귀중한 정보를 잃는다. 이 추가 정보는 이 비드 트립신화 접근법으로 캡처할 수 있지만, 질량분석기에서 분석된 N-글리코실화 단백질에 대한 특이성 감소의 잠재적인 절충안이 있습니다. 또한, PNGase 용출조차도 세포 내 당화 단백질을 표지하는 문제를 극복하지 못하며, PNGase 용출은 일반적으로 단백질 당 단일 펩타이드 만 유도합니다. 이것은 우리 실험실의 경험에 따라 단백질 식별에 상당한 가변성을 초래하는 반면, 여기에 설명된 비드 내 소화는 포획된 단백질당 여러 펩타이드를 생성합니다. 따라서 실험의 목적에 따라 세포 표면 포획 전략을 채택하기 위한 다른 전략을 잠재적으로 선택할 수 있습니다. 이러한 전략에는 소량 샘플 투입(28 )에 대한 세포 표면 포획 프로토콜의 소형화 및 자동화와 용도에 따라 다양한 결합 용량(29 )의 스트렙타비딘 비드를 활용하는 것이 포함된다. 여기에 설명된 방법과 워크플로우는 세포 표면 단백질 농축을 위한 강력하고 수행하기 쉬운 일반 전략으로 사용됩니다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
LC-MS/MS 실행 설정에 도움을 주신 Kamal Mandal 박사(UCSF 진단검사의학과), 데이터 분석에 도움을 주신 Deeptarup Biswas(BSBE, IIT 봄베이), 데이터 분석에 도움을 주신 Audrey Reeves 박사(UCSF 진단검사의학과)에게 감사드립니다. A.P.W. 연구실의 관련 연구는 NIH R01 CA226851 및 Chan Zuckerberg Biohub에 의해 지원됩니다. 그림 1 과 그림 2B 는 BioRender.com 를 사용하여 만들어졌습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| 96X iST Sample Preparation Kit | PreOmics | P.O.00027 | Proteomics sample preparation kit. Includes reagents for reduction, alkylation, and digestion. Also include desalting columns and reagents. |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo | 23275 | Peptide quantification kit. Includes peptide standards and components of working reagents. |
| Reagents | |||
| Acetonitrile | Fisher | A955-1 | |
| Ammonium bicarbonate | Millipore Sigma | 09830-1KG | |
| Biocytin hydrazide | Biotium | 90060 | |
| D-PBS (w/o Calcium and Magnesium Salts) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003-225B01 | |
| Formic Acid | Honeywell | 94318 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Single-Use Cocktail | Thermo | 1861280 | |
| High Capacity Neutravidin Agarose Resin | Thermo | 29204 | |
| Phosphate Buffered Saline | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001-22J01 | |
| RIPA Lysis Buffer, 10x | Millipore Sigma | 20-188 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Sodium metaperiodate | Alfa Aesar | 13798 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | |
| Urea (Proteomics Grade) | VWR | M123-1KG | |
| Equipment | |||
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | |
| PrismR Microcentrifuge | Labnet International | C2500-R-230V | |
| Sonicator | VWR | Branson Sonifier 240 | |
| Vacuum Manifold | Promega | Promega Vac-Man | |
| Shaking Heatblock | Eppendorf | Eppendorf Thermomixer C | |
| End-to-End rotator | Labnet | Revolver Adjustable Rotator | |
| LC | Thermo | Ultimate 3000 HPLC and UHPLC | |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrapole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| Microplate Reader | Biotek | Biotek Synergy 2 | |
| Vacuum Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| Supplies | |||
| 1.5 mL Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | |||
| Filtration Columns | Bio-Rad | 7326008 | |
| Spin Columns | Thermo | 69725 |
References
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