Summary
ここでは、様々な細胞型の細胞表面プロテオームの特性評価のためのプロテオミクスワークフローについて説明します。このワークフローには、細胞表面タンパク質の濃縮、その後のサンプル調製、LC-MS/MSプラットフォームを使用した分析、および専用ソフトウェアによるデータ処理が含まれます。
Abstract
過去10年間、質量分析ベースのプロテオミクスは、幅広いアプリケーションにわたる生物学的システムの詳細な特性評価を可能にしてきました。ヒト疾患における細胞表面プロテオーム(「表面形成」)は、原形質膜タンパク質が臨床的に承認されたほとんどの治療薬の主要な標的であり、疾患細胞と健康な組織を診断的に区別するための重要な特徴であるため、非常に興味深いものです。しかし、細胞の膜タンパク質および表面タンパク質の焦点を絞った特性評価は、主に他の高存在量タンパク質によって目的のタンパク質をマスクする細胞溶解物の複雑さのために、依然として困難でした。この技術的障壁を克服し、質量分析プロテオミクスを使用してさまざまな細胞タイプの細胞表面プロテオームを正確に定義するには、質量分析計で分析する前に、細胞表面タンパク質の細胞ライセートを濃縮する必要があります。この論文では、がん細胞由来の細胞表面タンパク質を標識し、細胞ライセートからこれらのタンパク質を濃縮し、その後の質量分析のためのサンプル調製を行うための詳細なワークフローを示します。
Introduction
タンパク質は、細胞機能の大部分が実行される基本単位として機能します。関連するタンパク質の構造と機能を特徴付けることは、生物学的プロセスを理解するために不可欠なステップです。過去10年間で、質量分析技術、分析ソフトウェア、およびデータベースの進歩により、プロテオーム全体のスケールでタンパク質の正確な検出と測定が可能になりました1。質量分析ベースのプロテオミクスは、生化学的経路の基礎科学分析から、トランスレーショナル環境での新規創薬標的の同定、臨床における疾患の診断とモニタリングまで、さまざまな用途に利用できます2。新規創薬標的をスクリーニングする場合、細胞表面プロテオームの特性評価は特に重要であり、現在承認されているヒト薬剤の65%以上が細胞表面タンパク質を標的としています3。がん免疫療法の分野も、腫瘍細胞を標的とし、特異的に排除するために、がん特異的な細胞表面抗原に完全に依存しています4。したがって、質量分析ベースのプロテオミクスは、治療的介入に向けて新しい細胞表面タンパク質を同定するための有望なツールとして役立ちます。
しかし、従来のプロテオミクス法を利用して腫瘍細胞を調査する際には、いくつかの限界があります。主な懸念事項は、表面タンパク質が細胞内の全タンパク質分子のごく一部を占めることです。したがって、これらのタンパク質の断片は、全細胞ライセート5の質量分析を行う際に高存在量の細胞内タンパク質によってマスキングされる。この制限により、従来のプロテオミクスワークフローで細胞表面プロテオームを正確に特性評価することが困難になります。この課題に対処するには、質量分析計で分析する前に、全細胞ライセートから細胞表面タンパク質を濃縮する方法を開発する必要があります。そのような方法の1つとして、無傷の細胞におけるグリコシル化細胞表面タンパク質の酸化とビオチン標識、およびその後のニュートラアビジンプルダウンによるライセートからのこれらのビオチン化タンパク質の濃縮(このプロセス)は「細胞表面捕捉」6と呼ばれています。哺乳類の細胞表面タンパク質の~85%がグリコシル化されていると考えられているため7、これは細胞ライセート全体から細胞表面プロテオームを濃縮する効果的な方法となります。この論文では、培養細胞から始まり、細胞表面ビオチン標識、およびその後の質量分析のためのサンプル調製の完全なワークフローについて説明します(図1)。この方法は、数回の反復にわたって、特定のサンプルの細胞表面プロテオームの堅牢なカバレッジを提供します。この方法を利用して、腫瘍細胞および健常細胞の両方の細胞表面プロテオームを特徴付けることにより、潜在的な免疫療法標的を同定するための新規な細胞表面抗原の発見を容易にすることができる8。
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Protocol
注:AMO1形質細胞腫細胞は、この細胞表面プロテオーム実験に使用されました。同じプロトコルを、幅広い懸濁細胞株および接着細胞株9、ならびに様々なタイプの一次サンプル10を含む他の細胞タイプにも使用することができる。ただし、細胞数(実験の出発物質)は、通常、同等のプロテオームカバレッジに最適化する必要があります。材料および機器の詳細については、 材料表を参照してください。バッファーおよび試薬溶液およびそれらの組成に関する詳細は、 表1を参照されたい。
1. ビオチンによる細胞表面標識
- 培養細胞をカウントし、遠心分離(500 × g、24°Cで5分間)により約3.5×10 7生細胞をペレット化した。
注:AMO1形質細胞腫細胞は、回収前に3日ごとに新鮮な培地で継代しました。 - 上清を吸引し、冷(4°C)ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(D-PBS)(カルシウムなし、マグネシウムなし)1 mLを加えてペレットを再懸濁し、穏やかに上下にピペッティングします。
- 細胞を再度ペレット化し(ステップ1.1のように)、洗浄ステップ(ステップ1.2)をもう一度繰り返します(合計2回の洗浄)。
- 2回目の洗浄後、細胞をペレット化し(ステップ1.1と同様)、穏やかにピペッティングして990 μLの冷D-PBSに再懸濁します。
- 160 mMメタ過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)のストック溶液を事前に準備してください。50 μLのアリコートに分割し、-20°Cで最大6か月間保存します。ステップ1.4で10 μLの160 mMメタペルシエートナトリウム溶液を細胞懸濁液に加え、十分に混合し、エンドツーエンドローター上で4°Cで20分間インキュベートします。
- インキュベーションが完了したら、細胞をペレット化し(ステップ1.1と同様)、上清をデカントし、1 mLの冷D-PBSに再懸濁します。この洗浄手順を2回繰り返します(合計3回の洗浄)。3回目の洗浄後、細胞を989 μLのD-PBSに再懸濁します。
- 100 mMバイオシチンヒドラジドのストック溶液を事前に準備してください。50 μLのアリコートに分割し、-20°Cで最大6か月間保存します。ステップ1.6で1 μLのアニリンと10 μLの100 mMバイオシチンヒドラジドを細胞懸濁液に加え、十分に混合し、エンドツーエンドローター上で4°Cで60分間インキュベートします。
- インキュベーションが完了したら、細胞をペレット化し(ステップ1.1と同様)、上清をデカントし、1 mLの冷D-PBSに再懸濁します。この洗浄手順を2回繰り返します(合計3回の洗浄)。
- 3回目の洗浄後、上清をピペットで注意深く吸引し、チューブを液体N2に入れて細胞ペレットを急速凍結した。凍結ペレットを-80°Cに置き、溶解とプルダウンを進める準備ができるまで置きます。
2. 細胞溶解とビオチンプルダウン
- 凍結した細胞ペレットを氷上で解凍します。
- 500 μLの2x溶解バッファーをペレットに加え、十分に混合し、30秒間ボルテックスします。
注:ペレットを完全に溶解するには、激しいピペッティングとボルテックスが必要になる場合があります。いくつかの不溶性破片(すなわち、DNA)は、その後の超音波処理ステップで除去されるので、許容される。 - 氷上で細胞溶解物を超音波処理する(3バースト、各20秒、60%デューティサイクル)。
- ライセートを遠心分離して、残っている破片をペレット化します(4°Cで17,200 × g で10分間)。
- ライセートが遠心分離されている間に、100 μLのニュートラアビジンアガロース樹脂ビーズをろ過カラムに加えます。カラムを真空マニホールドに取り付け、穏やかな真空をかけ、3 mLの洗浄バッファー1をビーズの上に流してビーズを洗浄します。
- 真空マニホールドからろ過カラムを取り外し、底部にキャップをして、清澄化された細胞ライセートをビーズ付きのカラムに加えます。カラムの上部にキャップをキャップし、ビーズとともにライセートをエンドツーエンドローター上で4°Cで120分間インキュベートします。
注:カラムの上部をキャッピングするときは、下部キャップを所定の位置にしっかりと保持してください。 - 洗浄バッファー1、2、および3(サンプルあたり約5 mLの各洗浄バッファー、 表1を参照)を調製し、42°Cの水浴に入れます
- ライセートのインキュベーションが終了したら、ろ過カラムを真空マニホールドに戻し、穏やかな真空をかけ、5 mLの洗浄バッファー1をビーズに流してビーズを洗浄します。
注:5mLを超える洗浄バッファーを洗浄に使用できます。余分な洗浄は、ビーズへのバックグラウンド、非特異的結合を減少させる可能性があります。 - 5 mLの洗浄バッファー2で洗浄ステップを繰り返します。
- 5 mLの洗浄バッファー3で洗浄ステップを繰り返します。
- 最終洗浄バッファーがビーズ全体に流れたら、カラムをマニホールドから取り出します。ビーズに100 μLの「Lyse」溶液を加え、ピペットで1.7 mLの低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに移します。チューブを短時間回転させてビーズを沈殿させ、沈殿したビーズを乱すことなく50μLの溶液を除去します。
注:本ステップおよび以降のすべてのステップの試薬は、市販のプロテオミクスサンプル調製キットを使用します。このキットは、最適化されたシンプルなサンプル調製ワークフローを提供します。しかしながら、これらのステップは、Vermaらに記載されているような従来のプロテオミクスワークフローを用いて、キットとは独立して実行することもできる9。ビーズがカラムの側面または底部に付着したままの場合は、チューブに移されたビーズを沈降させ、チューブ内の余分な「Lyse」溶液を使用して残りのビーズを転写します。 - チューブを65°Cのヒートブロック/シェーカーに置き、1,000rpmで10分間振とうします。
注:このステップは、消化前のシステイン残基の還元とアルキル化に必要です。
3.タンパク質消化
- 乾燥したトリプシン(「ダイジェスト」チューブ、キットでは-20°Cで保存)を210μLの「再懸濁」溶液を加えて再懸濁します。溶液を数回上下にピペットして、乾燥したすべてのトリプシンが再懸濁されるようにします。
- インキュベーションが完了したら、50 μLの再懸濁したトリプシン溶液をビーズに加えます。チューブを37°Cでインキュベートし、500 rpmで少なくとも90分間振とうしてタンパク質を消化します。
- 消化が完了したら、ビーズを含む溶液をスピンカラムに移し、カラムを1.7 mLの低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに挿入します。チューブを回転させ(500 × g 、室温[RT]で5分間)、消化したペプチド溶液をビーズから分離します。
注:この段階では、ビーズをペプチド溶液から分離した後、PNGase処理を実行して、ストレプトアビジンビーズからビオチン化ペプチドフラグメントを溶出することができます。その後、このペプチドサンプルは、別個の二次ペプチドサンプルとしてワークフローの残りの部分に持ち越され、分析してビーズ上トリプシン処理の一次サンプルと比較することができます。PNGaseアプローチは、MSで検出可能な側鎖修飾に基づいて捕捉されたN-グリコシル化アスパラギンに対する追加の特異性を考えると、ビーズ上のトリプシン処理に補完的なデータを提供する可能性があります12。ただし、このシーケンシャル溶出アプローチの欠点は、サンプル分析ごとに質量分析計の装置の2倍の時間が必要になることです。 - 100 μLの「停止」溶液を加えて消化反応を停止し、ペプチド溶液を酸性化します。
4.ペプチド脱塩
- チューブアダプターを使用して、脱塩カラムを1.7 mLの低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに入れます。酸性化ペプチド溶液全体をカラムに加えます。カラムを回転させ(3,800 × g で3分間)、溶液がカラム内を流れるようにします。これでペプチドがカラムに結合しました。フロースルーを破棄します。
- 200 μLの「ウォッシュ1」溶液をカラムに加え、スピンします(3,800 × g で3分間、RT)。フロースルーを破棄します。
- 200 μLの「ウォッシュ2」溶液をカラムに加え、スピンします(3,800 × g で3分間、RT)。フロースルーを破棄します。
- カラムをラベル付きの新しい1.7 mL低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに移します。100 μLの「溶出」溶液をカラムに加え、スピンします(3,800 × g で3分間、RT)。さらに100 μLの「溶出」溶液をカラムに加え、スピンします(3,800 × g で3分間、RT)。ペプチドはカラムからチューブに溶出されます。
- ペプチド溶液を真空遠心分離機に入れ、一晩乾燥させます。乾燥したペプチドを定量の準備ができるまで-80°Cで置き、質量分析計で分析します。
5. ペプチドの再懸濁と定量
- 乾燥したペプチドを20 μLの溶媒A(0.1%ギ酸、2%アセトニトリル)に再懸濁します。
- 再懸濁したペプチド(17,200 × g 、10分間)を遠心分離して、不溶性の破片をペレット化します。
- 比色ペプチド定量アッセイ用のペプチド標準物質を調製します。
- 5 μLの1,000 mg/mLペプチドストック溶液を96ウェルプレートの1ウェルに入れます。
- プレート内で脱イオン(DI)水で、ウェルあたり5 μLの各標準物質(1,000 mg/mL、500 mg/mL、250 mg/mL、125 mg/mL、62.5 mg/mL、31.25 mg/mL、および15.625 mg/mL)で7段階の段階段階希釈を行います。ブランク用の8番目のウェルに5 μLのDI水を入れます。
- 4 μLのDI水を96ウェルプレートの3つの別々のウェルに入れます。再懸濁したペプチド溶液1 μLを各ウェルに加え、総容量を5 μLにします。
注:定量のためにペプチド溶液をピペッティングする場合は、沈殿した破片が邪魔にならないように、溶液の上から慎重にピペットで移してください。 - 必要な作業試薬の量を計算します(ウェルあたり45 μLが必要です)。必要量の比色アッセイ作業試薬を調製する。成分の適切な混合を確実にするために、作業試薬を渦巻く。
- 45 μLの作業試薬を各標準ウェルとサンプルウェルに加えます。
注:標準物質を二重に作成し、マルチチャンネルピペットを使用して、試薬がウェルに添加されるタイミングの違いを最小限に抑えます。 - プレートをアルミホイルで覆い、37°Cで15分間インキュベートします。
- 自動プレートリーダーでプレートを分析します。標準サンプルについて記録された吸光度値を使用して、線形検量線を生成します。標準曲線の式とR2値を求める。R2値が妥当(≥0.95)である場合は、比色アッセイプレートでの5倍希釈を考慮して、標準曲線を使用して再懸濁ペプチドの濃度を決定します。
6. 消化ペプチドの液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)分析
- 溶媒Aを加えてペプチドサンプルの濃度を0.2 μg/μLに調整し、10 μLを0.6 mL低タンパク質結合チューブに移します。
- チューブをLCオートサンプラーに入れます。
- LCおよびMS/MSパラメータを図2および図3に従って設定します。
- 分析のために 5 μL (1 μg) のペプチドサンプルを LC-MS/MS セットアップに注入します。
注: ここに示す LC-MS/MS 設定は、図の代表的な設定にすぎません。LCおよびMS装置の可用性に応じて、LCグラジエントおよびMS/MSパラメーターの設定を変更して、深いプロテオームカバレッジを得ることができます。この論文では、MaxQuant https://www.maxquant.org/ を使用してMSデータ解析を実行し、Perseus https://maxquant.net/perseus/ を使用して二次データ解析を実行し、https://reactome.org/ を使用してパスウェイ解析を実行しました。
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Representative Results
この実験では、無傷細胞のN-グリコシル化膜タンパク質をビオチンで標識し、全細胞ライセートからこれらの標識タンパク質をニュートラアビジンプルダウンで濃縮することにより、腫瘍細胞株の細胞表面プロテオームの特性評価を行いました(図1)。さらに、LC-MS/MSを用いたプロテオーム解析を行い、濃縮された細胞表面タンパク質の特性評価を行いました。全細胞プロテオーム解析とは異なり、ここでは細胞表面タンパク質のみを特徴付けることが目的でした。したがって、我々は3.5×107 AMO-1形質細胞腫細胞のサンプルインプットから始めました。比色ペプチド定量アッセイに基づいて~630 ng/μLの最終ペプチド濃度が得られ、総収量はペプチドの~12.6 μg(20 μL中)でした(図2A)。次に、1 μgのペプチドサンプルをLC-MS/MSシステムに注入し、技術的な複製のために注入を3回繰り返しました。使用したLCおよびMSパラメータは、以前の実験に基づいて最適化されました(図2Cおよび図3A)。最大のカバレッジを確保するために、4時間の長いLC勾配を利用しました。
LC-MS/MSデータはMaxQuantを用いて解析しました。3つの反復すべてにおいて、少なくとも1つの固有のペプチドを持つ2,221のタンパク質と、少なくとも2つの固有のペプチドを持つ1,764のタンパク質を同定することができました。合計で、12,307のユニークなペプチドが同定されました。MaxQuantから得られた結果を細胞表面タンパク質のいくつかの確立されたデータセットと比較するPythonスクリプト(使用した正確なスクリプトは 補足図S1にあります)を利用して、サンプル中の細胞表面タンパク質の濃縮を決定しました。これらのデータセットには、以前に報告された 「in silico surfaceome」3 と、UniProt13 で膜局在としてアノテーションされたタンパク質から確立されたデータセットが含まれます(データセットは 補足表S1で入手できます)。この分析により、サンプル中に601の表面タンパク質(同定された全タンパク質の約27%)が得られました(図4A)。遺伝子オントロジーアノテーション(http://geneontology.org/)が行われ、タンパク質の約30%が原形質膜に標準的に局在することが示されました。リアクトーム経路解析(https://reactome.org/)はまた、膜貫通輸送および細胞表面相互作用に関与する膜タンパク質の相対的な濃縮を示した(図5 および 補足表S2)。
図1:細胞表面標識とその後の質量分析のためのサンプル調製のワークフロー。 まず、所望の細胞サンプルの表面にあるタンパク質をビオチンで標識する。次に、これらの細胞を溶解し、ビオチン標識タンパク質に結合するニュートラアビジンビーズとインキュベートします。その後、ビーズを繰り返し洗浄して、細胞内タンパク質やその他の汚染物質を除去します。次に、タンパク質サンプルは、トリプシンを添加してビーズ上で消化されます。得られたペプチド断片のサンプルは、洗浄および消化ステップから汚染物質を除去するために脱塩を受ける。その後、最終的なペプチドサンプルは乾燥され、質量分析を受ける準備が整います。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:比色ペプチド定量標準曲線およびLCグラジエント 。 (A)処理されたサンプル中のペプチド濃度を決定するために使用される比色ペプチド定量アッセイによって生成された8点標準曲線。(B)サンプルの処理に使用されるLC-MS/MSシステムの説明図。(C)質量分析計へのサンプルの注入に使用される液体クロマトグラフィーの勾配と流速。略語:LC-MS/MS =液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:質量分析パラメータと代表的なクロマトグラム 。 (A)Orbitrap質量分析計を用いた本実験に用いたパラメータ。(B)4時間グラジエントの「細胞表面キャプチャ」プロトコルに従った質量分析分析によって生成された代表的なクロマトグラム。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:細胞表面タンパク質濃縮分析とテクニカルレプリケートの比較。これらのデータセットには、以前に報告された 「in silico surfaceome」3 と、UniProt13で膜局在としてアノテーションされたタンパク質から確立されたデータセットが含まれます。(A)夾雑物を除去した後に異なるカットオフで同定されたタンパク質およびペプチドの数、逆タンパク質、およびq値が0.05>。(B)プロットは、同定されたタンパク質およびアンドロメダスコア14の分布を表す。(C)散布図は、サンプル間の相関を示しています。スピアマンの順位相関は、2つのランク付けされた変数間の関連性の強さと方向を測定します。(D)実行間のバリエーションを表す箱ひげ図。(E)反復のデータ品質を表すサンプルごとの分布プロット。略称:LFQ = ラベルフリー定量。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:パスウェイ解析。 パスウェイ解析は、Reactomeバージョン8222を用いて実施した。血管壁における細胞表面相互作用の例示的な描写であって、内皮との血小板および白血球相互作用に関与する重要な相互作用に対する細胞表面プロテオームの富化を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 試薬名 | 組成 | 貯蔵 | |||||
| 100 mM バイオシチン ヒドラジド | 粉末状のバイオシチンヒドラジドをDMSOに溶解 | 50 μLのアリコートに分割し、-20°Cで最大6か月間保存します。 | |||||
| 160 mM メタペルヨウ素酸ナトリウム (NaIO4) | 固体NaIO4 をDI水に溶解 | 50 μLのアリコートに分割し、-20°Cで最大6か月間保存します。 | |||||
| 2x RIPA 溶解バッファー | 2x RIPA 溶解バッファー、1.25 mM EDTA、シングルユースプロテアーゼインヒビターカクテル | 10x RIPA溶解バッファーを使用する前に、毎回新鮮な準備をしてください。 | |||||
| ペプチド比色アッセイ作業試薬 | 50% 試薬 A, 48% 試薬 B, 2% 試薬 C | 使用前に毎回新鮮な準備をしてください。コンポーネントは4°Cで保管してください。 | |||||
| 溶剤A | 0.1%ギ酸、2%アセトニトリル | 事前に準備し、室温で保存できます | |||||
| 洗浄バッファー 1 | 1x RIPA 溶解バッファー、1 mM EDTA | 事前に大量のバッチを準備し、室温で保存できます | |||||
| 洗浄バッファー 2 | 1x PBS, 1 M NaCl | 事前に大量のバッチを準備し、室温で保存できます | |||||
| 洗浄バッファー 3 | 2 M尿素、50 mM重炭酸アンモニウム | 尿素は時間の経過とともに急速に劣化するため、毎回新鮮な準備をしてください。 | |||||
表1:このプロトコルで使用したバッファーおよび試薬溶液。
補足図S1:MaxQuantから得られた結果を細胞表面タンパク質のいくつかの確立されたデータセットと比較するためのPythonスクリプト。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表S1:細胞表面タンパク質のデータセット。 これらのデータセットには、以前に報告された 「in silico surfaceome」3 と、UniProt13で膜局在としてアノテーションされたタンパク質から確立されたデータセットが含まれます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表S2:最も関連性の高い10の経路( p 値でソート)をここに示します。 略語:FDR =誤発見率。SLC = 溶質担体;TCR = T細胞受容体。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
質量分析ベースのプロテオミクスは、これまで不可能だった数千の未知のタンパク質の偏りのない特性評価を可能にした強力なツールです。このアプローチにより、特定のサンプルに存在するさまざまなタンパク質を特徴付けることにより、タンパク質を同定および定量し、細胞や組織の構造およびシグナル伝達能力に関するさまざまな洞察を収集することができます。質量分析により、サンプル中のグローバルなタンパク質プロファイリングを超えて、これらのタンパク質のさまざまな翻訳後修飾(PTM)を特徴付けることができ、DNAまたはRNAレベル1での分析では利用できないシグナル伝達経路とタンパク質ダイナミクスの段階をさらに深く垣間見ることができます。新しいがん治療薬の開発に向けて、質量分析ベースのプロテオミクスにより、悪性腫瘍細胞と健康な組織のタンパク質プロファイルを比較して、潜在的な創薬可能な標的を特定することができます。
急速に成長しているがん免疫療法の分野は、悪性細胞の表面に発現する抗原に依存して、腫瘍を識別し、選択的に破壊します。新規がん免疫療法の開発は、健康な組織には存在しない固有のがん特異的抗原の欠如によって制限されているため、腫瘍細胞に特異的な新規抗原をさらに特定することが重要です15。腫瘍特異的抗原は、腫瘍細胞に特有の全タンパク質である必要はなく、健康な組織には存在しない特異的タンパク質立体構造またはPTMであることもできる16、17。腫瘍細胞と健常細胞の両方における細胞表面タンパク質のプロテオーム解析は、新しいがん特異的抗原標的をもたらすことができます。細胞表面プロテオミクスでは、サンプルの複雑さを軽減し、高発現細胞内タンパク質による目的の膜タンパク質(多くの場合低存在量)のイオン抑制を回避するために、質量分析分析の前に全細胞ライセートから表面タンパク質を濃縮する必要があります18。ここで採用されている細胞表面捕捉戦略は、細胞表面プロテオミクスで最も一般的に使用される濃縮アプローチの1つですが、細胞膜の選択的超遠心、表面リジンのNHS-ビオチン標識、細胞表面タンパク質の酵素媒介ビオチン化など、質量分析ワークフローと統合された細胞表面タンパク質濃縮のための他の方法があります19。20.直接比較すると、細胞表面捕捉アプローチは、細胞内タンパク質のバックグラウンド標識が最も低く、細胞表面タンパク質の使いやすさと成功した比較的偏りのない濃縮の最適なバランスを提供することが示唆されています20。
この論文では、細胞表面の標識とプルダウンの手順を最適化されたプロテオミクスサンプル調製ワークフローと統合することにより、細胞表面プロテオミクスワークフローの効果的かつ時間効率の高いプロトコルを紹介します(図1)。培養細胞の採取から質量分析計での分析まで、3日間で完了しました。表面プロテオームの最も堅牢なカバレッジを得るには、使用する細胞の種類に基づいて細胞の初期入力を最適化する必要がある場合があります。最大のカバレッジを確保するために、数百万セルから5,000万セルまで、さまざまな細胞入力でパイロット実験を実行することをお勧めします。さらに、細胞内タンパク質の高発現が大量に観察された場合、ライセートとのインキュベーション後にニュートラアビジンビーズの洗浄を増やすことで、ビーズへのタンパク質の非特異的結合を最小限に抑えることができます。
同定された細胞表面マーカーが実際に大部分の細胞に存在するという信頼性を高めるために、条件ごとに少なくとも3つの生物学的複製と3つの技術的複製を使用して実験を実行することをお勧めします。さらに、新しいサンプルタイプの細胞表面捕捉ワークフローを実行する場合、従来のショットガンプロテオミクスアプローチ21を使用して全細胞ライセートを分析し、細胞表面捕捉結果と比較することが有用であり得る。生質量分析データの分析は、様々なデータベース検索およびソフトウェアパッケージによって行うことができる−ここでは、我々はMaxQuantを用いて、同定されたタンパク質のリスト22、23を得た。このリストを、表面タンパク質の様々な既知のデータベース3、24 に対してフィルタリングして、単一の実験で同定された細胞表面タンパク質のリストを確立することができる。細胞表面タンパク質のリストが確立されると、それらは、関連する生化学的経路25 または薬物標的候補26におけるそれらの役割についてさらに分析され得る。このワークフローは、懸濁細胞株や接着細胞株(接着細胞の場合、細胞表面タンパク質の切断を避けるために、サンプル調製前にトリプシンを使用せずに細胞を持ち上げることをお勧めします)、一次サンプルなど、さまざまな種類の細胞に適用できます。
このワークフローを使用して、特定の細胞株の細胞表面プロテオームを確実に特徴付けることができました。腫瘍細胞株の表面プロテオームを健康な細胞と比較し、正常組織のRNAシーケンシングデータベースと相互参照することにより、潜在的な免疫療法標的のリストを確立することができます8,13。この方法の限界は、標準的な全細胞ライセート実験と比較して細胞表面タンパク質の有意な濃縮にもかかわらず、このワークフローにおける質量分析分析によって同定されたタンパク質の大部分が依然として細胞内としてアノテーションされていることです。使用される表面タンパク質データベースの厳密性にもよるが、同定されたタンパク質の約25%〜30%が細胞表面からのものである。非表面バックグラウンドの大部分は、ビーズに非特異的に結合したバックグラウンドタンパク質(例えば、CRAPome27分析によって特徴付けられる)から生じる可能性が高いが、他の部分は、小胞体、ゴルジ体、または他の細胞内コンパートメント内のN-グリコシル化タンパク質と反応する標識試薬の細胞浸透を表す。
PNGase処理などの代替ペプチド溶出法では、分析された全ペプチドの中で N-グリコサイトの濃縮がはるかに大きくなりますが、このアプローチでは個々のグリコシル化ペプチドの同定のみが可能になり、プルダウンされたタンパク質配列の非グリコシル化の残りの部分から貴重な情報が失われます12。この追加情報は、このオンビーズトリプシン化アプローチで取得できますが、質量分析計で分析された N-グリコシル化タンパク質の特異性が低下するというトレードオフの可能性があります。さらに、PNGase溶出でも細胞内グリコシル化タンパク質を標識するという課題を克服できず、PNGase溶出は通常、タンパク質ごとに1つのペプチドしか得られません。これは、私たちの研究室の経験によると、タンパク質の同定に大きなばらつきをもたらしますが、ここで説明するビーズ上での消化は、捕捉されたタンパク質ごとに複数のペプチドにつながります。したがって、実験の目的に応じて、細胞表面捕捉戦略を採用するための異なる戦略を選択する可能性があります。これらの戦略には、小さなサンプル入力28 のための細胞表面捕捉プロトコルの小型化および自動化、および用途に応じて様々な結合能のストレプトアビジンビーズ29 の利用が含まれる。ここに示す方法とワークフローは、細胞表面タンパク質濃縮のための堅牢で実行が容易な一般的な戦略として機能します。
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Disclosures
著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。
Acknowledgments
LC-MS/MSランのセットアップにご協力いただいたカマル・マンダル博士(UCSF検査医学科)、データ分析にご協力いただいたDeeptarup Biswas(BSBE、IITボンベイ)、データ分析にご協力いただいたオードリー・リーブス博士(UCSF臨床検査医学科)に感謝します。A.P.W.ラボでの関連作業は、NIH R01 CA226851とChan Zuckerberg Biohubによってサポートされています。図 1 と 図2B は BioRender.com を使用して作成されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| 96X iST Sample Preparation Kit | PreOmics | P.O.00027 | Proteomics sample preparation kit. Includes reagents for reduction, alkylation, and digestion. Also include desalting columns and reagents. |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo | 23275 | Peptide quantification kit. Includes peptide standards and components of working reagents. |
| Reagents | |||
| Acetonitrile | Fisher | A955-1 | |
| Ammonium bicarbonate | Millipore Sigma | 09830-1KG | |
| Biocytin hydrazide | Biotium | 90060 | |
| D-PBS (w/o Calcium and Magnesium Salts) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003-225B01 | |
| Formic Acid | Honeywell | 94318 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Single-Use Cocktail | Thermo | 1861280 | |
| High Capacity Neutravidin Agarose Resin | Thermo | 29204 | |
| Phosphate Buffered Saline | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001-22J01 | |
| RIPA Lysis Buffer, 10x | Millipore Sigma | 20-188 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Sodium metaperiodate | Alfa Aesar | 13798 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | |
| Urea (Proteomics Grade) | VWR | M123-1KG | |
| Equipment | |||
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | |
| PrismR Microcentrifuge | Labnet International | C2500-R-230V | |
| Sonicator | VWR | Branson Sonifier 240 | |
| Vacuum Manifold | Promega | Promega Vac-Man | |
| Shaking Heatblock | Eppendorf | Eppendorf Thermomixer C | |
| End-to-End rotator | Labnet | Revolver Adjustable Rotator | |
| LC | Thermo | Ultimate 3000 HPLC and UHPLC | |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrapole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| Microplate Reader | Biotek | Biotek Synergy 2 | |
| Vacuum Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| Supplies | |||
| 1.5 mL Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | |||
| Filtration Columns | Bio-Rad | 7326008 | |
| Spin Columns | Thermo | 69725 |
References
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