Summary
TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) is een open-source ImageJ-plug-in voor 3D-calciumbeeldvormingsanalyse die beweging op de z-as onderzoekt en de maximale waarde van elke z-stack identificeert om de intensiteit van een cel op het overeenkomstige tijdstip weer te geven. Het kan neuronen scheiden die elkaar overlappen in de laterale (x / y) richting, maar op verschillende z-vlakken.
Abstract
Onderzoek in de neurowetenschappen is geëvolueerd om complexe beeldvormings- en computationele hulpmiddelen te gebruiken om uitgebreide informatie uit datasets te extraheren. Calciumbeeldvorming is een veelgebruikte techniek die geavanceerde software vereist om betrouwbare resultaten te verkrijgen, maar veel laboratoria hebben moeite om computationele methoden toe te passen bij het bijwerken van protocollen om aan moderne normen te voldoen. Problemen ontstaan door een gebrek aan programmeerkennis en paywalls voor software. Bovendien vertonen interessante cellen bewegingen in alle richtingen tijdens calciumbeeldvorming. Er zijn veel benaderingen ontwikkeld om de beweging in de laterale (x/y) richting te corrigeren.
Dit artikel beschrijft een workflow met behulp van een nieuwe ImageJ-plug-in, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), om beweging op de z-as in 3D-calciumbeeldvorming te onderzoeken. Deze software identificeert de maximale fluorescentiewaarde van alle z-posities waarin een neuron verschijnt en gebruikt deze om de intensiteit van het neuron op de overeenkomstige t-positie weer te geven. Daarom kan deze tool neuronen scheiden die elkaar overlappen in de laterale (x / y) richting, maar verschijnen op verschillende z-vlakken. Als ImageJ-plug-in is TACI een gebruiksvriendelijke, open-source computationele tool voor 3D-calciumbeeldvormingsanalyse. We hebben deze workflow gevalideerd met behulp van thermosensitieve neuronen van vlieglarven die bewegingen in alle richtingen vertoonden tijdens temperatuurschommelingen en een 3D-calciumbeeldvormingsdataset verkregen van het vliegenbrein.
Introduction
Het niveau van intracellulair calcium is een precieze marker van neuronale prikkelbaarheid. Calciumbeeldvorming meet de veranderingen in intracellulair calcium om neuronale activiteitte begrijpen 1. Studies in de neurowetenschappen hebben deze methode in toenemende mate gebruikt vanwege de ontwikkeling van technieken voor het meten van intracellulaire calciumconcentratie, waaronder genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECIs), zoals GCaMP2,3, die niet-invasief kunnen worden uitgedrukt in specifieke sets neuronen via genetische benaderingen. De lagere kosten van lasers en microscoopcomponenten hebben ook het gebruik van calciumbeeldvorming4 verhoogd. Belangrijk is dat calciumbeeldvorming het mogelijk maakt om afzonderlijke neuronen en grote neuronpopulaties tegelijkertijd te registreren en te bestuderen in vrij bewegende dieren5.
Niettemin is de analyse van calciumbeeldvormingsgegevens een uitdaging omdat (1) het gaat om het volgen van de veranderingen in fluorescentie van individuele cellen in de loop van de tijd, (2) het fluorescentiesignaal met tussenpozen verdwijnt of opnieuw verschijnt met neuronale reacties, en (3) de neuronen in alle richtingen kunnen bewegen, met name in en uit een brandpuntsvlak of verschijnen op meerdere vlakken4, 6. Handmatige analyse is tijdrovend en wordt onpraktisch naarmate de lengte van opnames en het aantal neuronen toeneemt. Er zijn verschillende softwareprogramma's ontwikkeld om het proces van het analyseren van calciumbeeldvorming te versnellen. Voorheen werd software ontworpen in een beperkte experimentele context, waardoor het voor andere laboratoria moeilijk was om het te adopteren. Recente inspanningen om te voldoen aan moderne normen voor het delen van software hebben geleid tot de ontwikkeling van verschillende tools die consistent calciumbeeldvormingsgegevens kunnen analyseren in verschillende groepen 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . De meeste van deze tools vereisen echter programmeerkennis en/of zijn afhankelijk van commerciële software. Een gebrek aan programmeerkennis en software paywalls weerhouden onderzoekers ervan om deze methoden toe te passen. Bovendien richten veel van deze tools zich op het corrigeren van de x/y-beweging, hoewel beweging op de z-as ook expliciet moet worden gediagnosticeerd en gecorrigeerd6. Er is behoefte aan een computationeel hulpmiddel om 3D-calciumbeeldvorming te analyseren die zich richt op neuronen die z-drift vertonen en op meerdere z-vlakken verschijnen. Idealiter zou deze tool open-source software moeten gebruiken en geen programmeerkennis vereisen om andere laboratoria in staat te stellen het gemakkelijk te adopteren.
Hier hebben we een nieuwe ImageJ-plug-in, TACI, ontwikkeld om 3D-calciumbeeldvormingsgegevens te analyseren. Eerst hernoemt de software, indien nodig, en organiseert de 3D-calciumbeeldvormingsgegevens op z-posities. De cellen van belang worden gevolgd in elke z-positie en hun fluorescentie-intensiteiten worden geëxtraheerd door TrackMate of andere computationele hulpmiddelen. TACI wordt vervolgens toegepast om de beweging op de z-as te onderzoeken. Het identificeert de maximale waarde van een z-stack en gebruikt deze om de intensiteit van een cel op het overeenkomstige tijdstip weer te geven. Deze workflow is geschikt voor het analyseren van 3D-calciumbeeldvorming met beweging in alle richtingen en / of met neuronen die elkaar overlappen in de laterale (x / y) richting, maar in verschillende z-posities verschijnen. Om deze workflow te valideren, werden 3D-calciumbeeldvormingsdatasets van thermosensitieve neuronen van vliegenlarven en paddenstoelneuronen in de hersenen gebruikt. Van belang is dat TACI een open-source ImageJ-plug-in is en geen programmeerkennis vereist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Calciumbeeldvorming
- Voorbereiding van vliegenlarven
OPMERKING: Vliegen en larven worden bij 25 °C gehouden onder een licht-donkercyclus van 12 uur:12 uur.- Verdoof de vliegen met CO2. Sorteer 20-45 mannetjes en 20-45 vrouwtjes in elke vliegenflacon en geef ze ten minste 24 uur tot 48 uur om te herstellen van de CO2-blootstelling .
OPMERKING: Blootstelling van vliegen aan CO2 moet zo kort mogelijk duren. - Om de leeftijd van de larven te synchroniseren, tikt u over de vliegen in nieuwe flacons met gistkorrels en laat u ze 4-8 uur eieren leggen. Verwijder de vliegen door ze in nieuwe injectieflacons te draaien.
- Verzamel de larven na 72 uur met behulp van 10 ml 20% m/v sucrose-oplossing.
- Verdoof de vliegen met CO2. Sorteer 20-45 mannetjes en 20-45 vrouwtjes in elke vliegenflacon en geef ze ten minste 24 uur tot 48 uur om te herstellen van de CO2-blootstelling .
- Microscoop en temperatuurregeling setup
- Voer de beeldvorming uit op een confocale microscoop (zie de materiaaltabel) en een z-as piëzotrap met een podiuminzet met behulp van de volgende instellingen: laser, Argon; scanmodus, frame; framegrootte, 512 x 512; snelheid, maximum; kanalen / bitdiepte, 1/8 bit; zoom, 1,5; z-stack, slice = 15, Keep = slice; focusapparaten en strategie, Definitieve focus; focus, Duidelijke focus op.
- Bevestig een Peltier-koelmodule aan een koellichaam door de warmteoverdrachtsverbinding om een thermo-elektrische koeler te bouwen. De Peltier wordt gevoed door een 2 A voeding.
- Bevestig een thermokoppelmicroprobe aan een data-acquisitieapparaat om de temperatuur te registreren.
- Calcium beeldvorming
- Spoel de larven 3x af in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Pipetteer 75 μL van 1x PBS op het midden van een glasplaat.
- Zet een of twee larven in 1x PBS en plaats de thermokoppel microprobe in de buurt van de larven.
OPMERKING: De afstand tussen de larven en de microprobe moet ~ 5 mm zijn. De larven kunnen bewegen als de microprobe te dicht bij hen wordt geplaatst. Een grote afstand kan leiden tot onnauwkeurige temperatuurmetingen. - Bedek de larven en het thermokoppel met een glazen dekplaat. Sluit de coverslip af met nagellak.
- Plaats de dia op het microscooppodium, zoek de focus met behulp van een 25x-objectief en plaats de thermo-elektrische koeler op de dia.
OPMERKING: De Peltier wordt direct op de glijbaan geplaatst waar de larven de temperatuurprikkels moeten afgeven. - In confocale software, focus op de fluorescerende cellen van belang. Pas het laservermogen aan om oververzadiging te voorkomen. Stel de eerste en laatste segmentpositie in de instelling z-stack in.
OPMERKING: Gebruik het laagst mogelijke laservermogen voordat u opneemt om fotobleken te voorkomen. - Start het scannen van de z-stack en de temperatuurregistratie tegelijkertijd.
- Regel de voeding die de Peltier van stroom voorziet om de oppervlaktetemperatuur van Peltier te wijzigen. Schakel de voeding in om de temperatuur te verlagen en schakel deze uit om de temperatuur te verhogen.
- Stop het scannen en de temperatuurregistratie van de z-stack.
2. Analyse van de 3D calcium imaging data
- Exporteer de calciumafbeeldingsgegevens naar TIFF-bestanden en sla ze op in een map met dezelfde naam als de basisnaam van de TIFF-bestanden erin.
OPMERKING: De bestandsnaam mag geen komma's bevatten.- Gebruik de volgende parameters om de calciumbeeldgegevens van ZEN (zwarte editie) te exporteren: bestandstype, TIFF; compressie, LZW; kanalen, 2; Z-positie, alle; tijd, allemaal; fase, 1; regio, vol.
- Installatie
- Download TACI-Calcium_Imaging.jar van Github (https://github.com/niflylab/TACI_CalciumImagingPlugin/releases).
- Installeer de plug-in in FIJI door in de menubalk op Plug-ins te klikken en vervolgens op Installeren in het vervolgkeuzemenu (Plug-ins | Installeren). Start vervolgens FIJI opnieuw op.
OPMERKING: Gebruik GEEN plug-ins | Plug-in installeren. - Voer de plug-in uit door op Plug-ins te klikken en vervolgens TACI-Calcium Imaging (Plug-ins | TACI-Calcium beeldvorming).
- Gebruik de functie RENAME om de TIFF-bestandsnamen naar de gewenste structuur te converteren.
OPMERKING: Het hulpprogramma gebruikt filename_h#t#z#c#.tif als standaardstructuur (h# en c# zijn optioneel; #: een positief geheel getal). Als de bestandsnamen van de afbeelding zich niet in de standaardstructuur bevinden, moet de functie NAAM worden uitgevoerd.- Kies de map waarin de TIFF-afbeeldingen moeten worden hernoemd door op Bladeren door mappen te klikken.
- Vul de parameterinformatie in. Er worden vijf parameters weergegeven, waaronder Bestandsnaam, Fase, Max T-Positie, Max Z-Positie en Kanaal. Elke parameter heeft drie waarden: Voorafgaande tekst, Parameterwaarde en Volgorde.
OPMERKING: De informatie is hoofdlettergevoelig. Als de bestandsnamen van de afbeelding een woordgroep vóór een parameter bevatten, vult u de zin in als de voorgaande tekst van de bijbehorende parameter. Als de bestandsnamen van de afbeelding na alle parameters een zin bevatten, vult u de zin in als de posttekst.- Zorg ervoor dat u Bestandsnaam, Max T-positie en Max Z-positie invoert en dat de parameterwaarden voor Max T-positie en Max Z-positie alle cijfers bevatten.
- Wacht tot de bestandsnaam automatisch wordt ingevuld met de mapnaam .
- Als de TIFF-bestandsnamen de fase en het kanaal niet bevatten, laat u de bijbehorende parameterwaarde leeg en kiest u Na in volgorde.
- Klik op Naam wijzigen om een map met dezelfde naam en _r te maken. Merk op dat in de map de TIFF-bestandsnamen zijn geherstructureerd om compatibel te zijn met de functie ORGANISEREN .
OPMERKING: _r is toegevoegd aan de bestandsnamen van de TIFF-afbeeldingen.
- Gebruik de functie ORGANISEREN om de TIFF-afbeeldingen van dezelfde z-positie in één map op te slaan.
OPMERKING: De mapnaam moet dezelfde naam hebben als de basisnaam van de TIFF-bestanden in de map en mag GEEN komma's hebben.- Kies de map waarin de TIFF-afbeeldingen moeten worden geordend door op Bladeren door mappen te klikken.
- Als de parameter CSV-bestand (param.csv) bestaat, wacht u totdat de parameterwaarden automatisch zijn ingevuld.
OPMERKING: Het param.csv-bestand heeft een vereiste indeling. De parameters, waaronder bestandsnaam, fase, position_t, position_z, kanaal en is_gray, moeten in rij 1 van links naar rechts worden ingevuld vanaf kolom A. Overeenkomstige waarden voor elke parameter moeten worden ingevuld in rij 2. - Als de parameter CSV-bestand (param.csv) niet bestaat, vult u de parameterwaarden handmatig in. Zorg ervoor dat de parameterwaarden van Fase en Kanaal letters bevatten, terwijl de parameterwaarden van T-positie en Z-positie de grootste getallen van de t- en z-posities moeten zijn. Als de bestandsnamen van de afbeelding de fase of het kanaal niet bevatten, voert u Na in.
- Maak indien nodig TIFF-afbeeldingen in grijswaarden. Laat het selectievakje Zijn afbeeldingen grijs? uitgeschakeld om de afbeeldingen grijswaarden te geven.
- Klik op Organiseren om een map met dezelfde naam en _gray_stacks te maken en om mappen met dezelfde naam en _# (#: z-posities) in de map te genereren. Merk op dat de TIFF-bestanden worden gesorteerd in overeenkomstige mappen op z-posities en dat een bestand met de naam param.csv wordt gegenereerd, waarin de parameters en hun waarden kunnen worden gevonden.
- Gebruik TrackMate in FIJI om de fluorescentie-intensiteiten van de cellen van belang uit elke z-positie te extraheren.
OPMERKING: Deze stap kan ook worden uitgevoerd door andere beeldbewerkingssoftware.- Open de TIFF-afbeeldingen in een z-position map van FIJI.
- Voer TrackMate uit door op Plug-ins | Traceren | TrackMate en pas indien nodig de volgende parameters aan.
- Gebruik DoG- of LoG-detectoren.
- Wijzig de blobdiameter, drempel en mediaanfilter. Pas de blobdiameter aan zodat deze vergelijkbaar is met de diameter van de cellen. Als de cellen ovaal zijn, past u de blobdiameter aan zodat deze vergelijkbaar is met de secundaire as.
OPMERKING: Het verhogen van de drempel helpt voorkomen dat achtergrondruis wordt opgepikt als signalen zonder de signaalintensiteiten te beïnvloeden (aanvullende figuur 1). Een verhoging van de drempel kan echter echte signalen missen (aanvullende figuur 1). Als de signalen sterk zijn, gebruikt u het mediane filter om de zout- en peperruis te verminderen. - Stel de filters in om sommige, zo niet alle, irrelevante signalen te verwijderen. Filters X en Y zijn ruimtelijke filters. Gebruik filters X en Y om de irrelevante signalen te verwijderen die ver van de echte signalen verwijderd zijn.
OPMERKING: Wanneer filters op één afbeelding zijn ingesteld, is het van cruciaal belang om alle andere afbeeldingen te controleren om ervoor te zorgen dat de echte signalen niet worden verwijderd. - Stel de maximale afstand van de koppeling, de maximale afstand van de opening en de maximale framekloof voor het sluiten van de opening in. Stel de maximale afstand van de koppeling en de maximale afstand tot het sluiten van de opening in op 3x-5x de blobdiameter, vooral wanneer de monsters in de loop van de tijd aanzienlijk bewegen, om het aantal sporen te verminderen. Stel de gap-closing max frame gap in op het aantal afbeeldingen in de stapel.
- Exporteer de fluorescentie-intensiteiten van de interessante regio's (ROI's) naar een CSV-bestand. Als een oude TrackMate-versie wordt gebruikt, kiest u Alle spotstatistieken exporteren in het actievenster Selecteer een actie . Als de TrackMate-versie 7.6.1 of hoger is, kiest u de Spots in het venster Weergaveopties . Exporteer of sla op als de interactieve bestanden naar CSV-bestanden.
OPMERKING: Beide bestanden zijn interactief met het afbeeldingsvenster; als u een ROI markeert, wordt de bijbehorende ROI weergegeven in het afbeeldingsvenster. Deze bestanden omvatten de gemiddelde intensiteiten (MEAN_INTENSITY of MEAN_INTENSITY_CH1) van de cellen van belang op overeenkomstige tijdstippen (POSITION_T). Dezelfde TRACK_IDs moet dezelfde ROI's op verschillende tijdstippen vertegenwoordigen. Dit is echter niet altijd waar en moet mogelijk handmatig worden gecorrigeerd, indien nodig. Als TrackMate de ROI's op bepaalde tijdstippen niet herkent, worden die tijdstippen niet weergegeven.
- Extraheer de achtergrondfluorescentie-intensiteit en maak het Background_list.csv bestand.
OPMERKING: In deze studie werd de achtergrondintensiteit voor elke z-positie geschat met behulp van de gemiddelde waarde van drie tot vijf naburige blobs van dezelfde grootte die geen fluorescentiesignalen bevatten en van verschillende tijdstippen waren.- Het Background_list.csv bestand heeft een vereist formaat: elke kolom bevat de informatie van één neuron, beginnend bij Neuron 0. Vul de neuronnummers, zoals Neuron 0, in rij 1 in. Geef vervolgens de achtergrondintensiteit op voor elke geanalyseerde z-positie - als vijf z-posities worden geanalyseerd voor Neuron 0, vul dan vijf achtergrondintensiteitswaarden in onder Neuron 0.
OPMERKING: Het Background_list.csv bestand is vereist voor de functie TACI EXTRACT . Als de achtergrond verwaarloosbaar is, moet de Background_list.csv met de nul-achtergrondintensiteit van elk neuron worden verstrekt.
- Het Background_list.csv bestand heeft een vereist formaat: elke kolom bevat de informatie van één neuron, beginnend bij Neuron 0. Vul de neuronnummers, zoals Neuron 0, in rij 1 in. Geef vervolgens de achtergrondintensiteit op voor elke geanalyseerde z-positie - als vijf z-posities worden geanalyseerd voor Neuron 0, vul dan vijf achtergrondintensiteitswaarden in onder Neuron 0.
- Gebruik de functie EXTRACT om de maximale fluorescentie-intensiteiten op elke t-positie te bepalen en bereken ΔF/F0 zoals weergegeven in vergelijking (1).
(1)- Maak een map en geef deze een naam met behulp van het neuronnummer, beginnend bij Neuron 0. Sla de CSV-bestanden met de fluorescentie-informatie van het overeenkomstige neuron op in de map. Elk CSV-bestand bevat de informatie van één z-positie, dus het aantal CSV-bestanden is gelijk aan het aantal geanalyseerde z-posities. Geef de CSV-bestanden de naam Mean_Intensity#.csv (# staat voor de z-positie) en elk CSV-bestand bevat ten minste twee kolommen: POSITION_T en MEAN_INTENSITY of MEAN_INTENSITY_CH1.
OPMERKING: Maak een map voor elke cel van belang. - Sla het Background_list.csv bestand en de mappen die in stap 2.7.1 zijn gemaakt op in één map. Kies deze map door op Bladeren door bestanden te klikken.
OPMERKING: Het aantal achtergrondwaarden in het Background_list.csv bestand moet overeenkomen met het aantal Mean_Intensity#.csv-bestanden voor elk neuron. - Het achtergrondbestand wordt automatisch ingevuld. Vul het grootste aantal t-posities in voor het aantal T-posities.
- Klik op Uitpakken om een resultatenmap te maken, inclusief de CSV-bestanden en -plots voor elk neuron. De CSV-bestanden bevatten informatie over de maximale fluorescentie-intensiteit en ΔF / F0 op elke t-positie. De plots zijn lijndiagrammen van ΔF/F0 over t-posities.
OPMERKING: In deze studie werd ΔF/F0 berekend met behulp van vergelijking (1). De eerste waarde van elke z-positie werd gebruikt als F0. Als deze F0 niet geschikt is20, biedt de plug-in bestanden met onbewerkte gegevens voor elk neuron in de map python_files.
- Maak een map en geef deze een naam met behulp van het neuronnummer, beginnend bij Neuron 0. Sla de CSV-bestanden met de fluorescentie-informatie van het overeenkomstige neuron op in de map. Elk CSV-bestand bevat de informatie van één z-positie, dus het aantal CSV-bestanden is gelijk aan het aantal geanalyseerde z-posities. Geef de CSV-bestanden de naam Mean_Intensity#.csv (# staat voor de z-positie) en elk CSV-bestand bevat ten minste twee kolommen: POSITION_T en MEAN_INTENSITY of MEAN_INTENSITY_CH1.
- Gebruik de MERGE-functie om het gemiddelde van de ΔF/F 0 van elk neuron te berekenen, de SEM te berekenen en de gemiddelde ΔF/F0 over t-posities uit te zetten.
- Kies de resultatenmap die is gemaakt door de functie EXTRACT door op Bladeren door bestanden te klikken.
- Vul het aantal T-posities in met het grootste aantal t-posities.
- Klik op Samenvoegen om een merged_data map te maken, inclusief een merged_data.csv-bestand en een Average_dF_F0.png plot. Het CSV-bestand bevat de informatie over het gemiddelde en SEM ΔF/F0 op elke t-positie. De grafiek is een lijndiagram van de gemiddelde ΔF/F0 over t-posities.
(1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Workflow van 3D calcium imaging analyse
In deze studie ontwikkelden we een nieuwe ImageJ-plug-in, TACI, en beschreven we een workflow om z-drift te volgen en 3D-calciumbeeldvorming te analyseren die de reacties van individuele cellen in meerdere z-posities aangeeft (figuur 1). Deze tool heeft vier functies: RENAME, ORGANIZE, EXTRACT en MERGE. Ten eerste, als de afbeeldingsnamen niet compatibel zijn met de functie ORGANISEREN, kan de functie RENAME de afbeeldingsnamen converteren naar de vereiste structuur. Vervolgens wordt de functie ORGANISEREN grijswaarden weergegeven (indien nodig) en worden de TIFF-gegevens van 3D-calciumbeeldvorming georganiseerd op z-posities. Afbeeldingen van dezelfde z-positie worden opgeslagen in één map. Vervolgens kunnen verschillende beeldanalysetools worden gebruikt om de ROI's te detecteren en te volgen en hun fluorescentie-intensiteiten in de loop van de tijd voor elke z-positie te extraheren. Een ImageJ-plug-in, TrackMate, werd gebruikt om deze stap te volbrengen. TrackMate is een open-source ImageJ-plug-in voor het volgen van enkele deeltjes21. Het is op grote schaal gebruikt om deeltjes te volgen in verschillende biologische studies met levende celbeeldvorming, waaronder calciumbeeldvorming 11,21,22,23. TrackMate volgt op een geautomatiseerde manier cellen in de laterale (x / y) richting, detecteert ROIs en extraheert signalen uit een live-imaging dataset 4,12. Voor elke cel van belang sorteert de EXTRACT-functie de fluorescentie-intensiteiten van alle z-posities op t-posities, identificeert de maximale waarden van elke t-positie, trekt de achtergrond af en berekent en plot ΔF / F0. Ten slotte berekent en plot de functie MERGE het gemiddelde van ΔF/F0 van meerdere cellen.
Calciumreacties van vliegenlarvale koele neuronen op temperatuurveranderingen
We hebben deze methode gevalideerd met behulp van de calciumveranderingen als reactie op temperatuurschommelingen in koele neuronen van vlieglarven. Een genetisch gecodeerde calciumindicator, GCaMP6m 24, werd uitgedrukt in larvale koele neuronen door Ir21a-Gal425. Bij blootstelling aan ongeveer 27 °C hadden de neuronen lage intracellulaire calciumspiegels (figuur 2A en figuur 3). Wanneer de temperatuur werd verlaagd tot ongeveer 10 °C en daar werd gehouden, namen de intracellulaire calciumspiegels snel toe en hielden ze aan (figuur 2B en figuur 3). De calciumspiegels daalden snel wanneer de temperatuur werd verhoogd (figuur 3).
Het analyseren van een vliegenbrein 3D calcium imaging dataset
We hebben deze methode ook gevalideerd met behulp van een 3D-calciumbeeldvormingsdataset van vliegenhersenen11. De afgebeelde transgene vliegen (VT50339-Gal4; UAS-GCaMP6f) bracht GCaMP6f tot expressie in het paddenstoellichaam in de hersenen11. Gegevens van 45 z-posities (met intervallen van 1,5 μm) werden verzameld bij 50 Hz gedurende 225 s (250 tijdpunten) en de eerste helft van de dataset (125 tijdpunten) werd geanalyseerd. Toen de opname begon, hadden zeven neuronen duidelijke fluorescentie en vier van hen werden geanalyseerd (figuur 4A). De intensiteiten in deze neuronen namen in de loop van de tijd af (figuur 4B). Wanneer octanol werd toegepast (figuur 4C), werden meerdere neuronen helderder. De fluorescentie van 10 neuronen bleek gelijktijdig toe te nemen op tijdstip 92 (figuur 4D), wat suggereert dat deze paddenstoelneuronen reageren op octanolgeur. Hoewel octanol gedurende 5 s werd toegepast, werd hoge fluorescentie in deze neuronen waargenomen in slechts één tijdspunt (0,9 s) en daalde vervolgens snel, wat suggereert dat de respons fasisch en van voorbijgaande aard is.
Scheiding van overlappende cellen
Figuur 5A toont een maximaal projectiebeeld van drie neuronen. De witte pijlpunt wijst naar twee neuronen die elkaar overlapten in het x/y-vlak, maar gescheiden waren in de orthoweergave (blauwe en oranje pijlpunten in figuur 5B), wat aangeeft dat deze neuronen in verschillende z-posities verschenen; de oranje cel had het sterkste signaal op z7 (figuur 5C), terwijl de blauwe cel het sterkste signaal had op z10 (figuur 5D). De tool onderscheidde deze twee cellen en onthulde de vertraagde maar sterke activering van de oranje cel (figuur 5E).
Figuur 1: Workflow met TACI om 3D-calciumbeeldvorming te analyseren. TACI heeft vier functies: RENAME, ORGANIZE, EXTRACT en MERGE. Ten eerste, als de TIFF-namen niet compatibel zijn met de functie ORGANISEREN, kan de functie NAAM de afbeeldingsnamen converteren naar de vereiste structuur. Vervolgens wordt de functie ORGANISEREN grijswaarden weergegeven (indien nodig) en worden de TIFF-gegevens van 3D-calciumbeeldvorming georganiseerd op z-posities. Afbeeldingen van dezelfde z-positie worden opgeslagen in één map. Vervolgens kunnen verschillende beeldanalysetools worden gebruikt om de ROI's te detecteren en te volgen en hun fluorescentie-intensiteiten in elke z-positie te extraheren. Voor elke cel van belang sorteert de EXTRACT-functie de fluorescentie-intensiteiten op de overeenkomstige tijdpunten, identificeert de maximale waarden van elke t-positie, trekt de achtergrond af en berekent en plot ΔF / F0. Ten slotte berekent en plot de functie MERGE het gemiddelde van ΔF/F0 van meerdere cellen. Afkortingen: TACI = TrackMate Analysis of Calcium Imaging; ROIs = interessante regio's; ΔF/F0 = verhouding tussen verandering in fluorescentie en initiële fluorescentie-intensiteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Calciumbeeldvorming van vliegenlarvale koelcellen in inactieve en actieve toestand. (A) De cellen zijn nauwelijks zichtbaar in de inactieve toestand. (B) De cellen zijn sterk fluorescerend in de actieve toestand. Verschillende kleur pijlpunten geven verschillende cellen aan. Het genotype is Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. Z5-13: beelden op Z-posities van 5 tot 13. In B wordt de cel aangegeven door de witte pijlpunten weergegeven op z5 tot en met z8; De cellen aangegeven met oranje en blauwe pijlpunten worden weergegeven op Z8 tot en met Z13. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Kwantificering van fluorescentie als de verandering in fluorescentie-intensiteit (F) ten opzichte van de beginintensiteit (F0). Het genotype is Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. n = 7 cellen van drie dieren. Sporen = gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Analyse van een 3D calciumbeeldvormingsdataset van het vliegenbrein. (A) Het maximale projectiebeeld op tijdstip 1 (t1). De getallen 0-3 geven de vier geanalyseerde neuronen aan. (B) Fluorescentieveranderingen van neuronen 0-3 in A gedurende de tijdpunten 0 tot 125. (C) Het maximale projectiebeeld op tijdstip 92 (t92). De getallen 0-9 geven de 10 geanalyseerde neuronen aan. (D) Fluorescentieveranderingen van neuronen 0-9 in C gedurende tijdspunten 0 tot 125. Er werden 5 s lucht of 5 s octanol aangebracht, zoals grijs weergegeven. Schaalbalk = 10.000 eenheden ruwe fluorescentie-intensiteit. Afkorting: OCT = octanol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Scheiding van overlappende cellen op basis van de maximale waarde. (A) Twee neuronen overlappen elkaar (witte pijlpunt) in een maximaal projectiebeeld (m). Het genotype is Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. (B) Deze neuronen zijn gescheiden in de orthoweergave (blauwe en oranje pijlpunten). (C,D) De oranje cel verschijnt op z7 (C), terwijl de blauwe cel op z10 (D) verschijnt. Schaalbalk = 10 μm. (E) De fluorescentieveranderingen van de oranje en blauwe cellen worden gekwantificeerd met behulp van de maximumwaarden van individuele z-posities. Afkorting: ΔF/F0 = verhouding van verandering in fluorescentie tot initiële fluorescentie-intensiteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Twee neuronen met zwakke calciumsignalen worden geanalyseerd met behulp van DoG- en LoG-detectoren bij verschillende drempels. (A-C) Het eerste neuron (Ir21a-Gal80 26/UAS-GCaMP6;Ir93a-Gal427) wordt geanalyseerd door DoG en LoG bij verschillende drempels. (A) De drempel is vastgesteld op 0,1. Zowel DoG als LoG detecteren alle 36 tijdpunten. B) De drempel is vastgesteld op 0,3. Van de 36 tijdstippen detecteert DoG er 36 en LoG 35. C) De drempel is vastgesteld op 1,0. Van de 36 tijdstippen detecteert DoG er 34 en LoG 15. (D-F) Het tweede neuron (UAS-GCaMP6;Ir68a-Gal428) wordt geanalyseerd door DoG en LoG op verschillende drempels. D) De drempel is vastgesteld op 0,1. DoG detecteert alle 36 tijdpunten en LoG detecteert 34. E) De drempel is vastgesteld op 0,3. Van de 36 tijdstippen detecteert DoG er 33 en LoG 18. F) De drempel is vastgesteld op 1,0. Van de 36 tijdstippen detecteert DoG er 14 en LoG slechts één. Van belang is dat het verhogen van de drempel geen invloed heeft op de intensiteitsmeting als een ROI wordt herkend. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: De maximale waarde is een goede weergave van de intensiteit van een cel. (A) Z-stacks met verschillende z-afstanden worden gesimuleerd. (B) Z-stacks met verschillende z-posities worden gesimuleerd. (C) Z-stacks worden gemaakt van gesimuleerde cellen met verschillende intensiteiten. Afkortingen: max = de maximale waarde van een z-stack; ground_truth = het product van het volume van de gesimuleerde cel en de gevulde intensiteit ervan. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Vergelijking tussen TACI- en 3D-ROI-methoden. (A) Fluorescentieveranderingen in twee cellen aangegeven door oranje en blauw worden gekwantificeerd met behulp van TACI en een aangepaste software geschreven in IGOR Pro. Het genotype type is R11F02-Gal429; UAS-GCaMP6m. (B) Fluorescentieveranderingen in twee cellen aangegeven door oranje en blauw worden gekwantificeerd met behulp van TACI en IMARIS. Het genotype type is Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. Afkorting: ΔF/F0 = verhouding van verandering in fluorescentie tot initiële fluorescentie-intensiteit. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze studie ontwikkelde een nieuwe ImageJ-plug-in, TACI, en beschreef een workflow die 3D-calciumbeeldvorming analyseert. Veel momenteel beschikbare tools richten zich op het corrigeren van de x/y-beweging, hoewel beweging op de z-as ook expliciet moet worden gediagnosticeerd of gecorrigeerd6. Tijdens beeldacquisitie in een levend organisme is beweging op de z-as onvermijdelijk, zelfs wanneer het organisme is geïmmobiliseerd, en sommige stimuli, zoals temperatuurverandering, veroorzaken vaak aanzienlijke z-drift. Het verhogen van de hoogte van de z-stacks maakt het mogelijk om de cellen van belang tijdens het hele beeldvormingsproces vast te leggen; Het is echter niet triviaal om beweging op de z-as te analyseren, vooral wanneer individuele cellen in meerdere z-posities verschijnen. Als een dergelijke beweging wordt genegeerd, zullen onderzoekers niet de precieze calciumresponsen van deze cellen verkrijgen. TACI corrigeert de z-drift door de fluorescentiesignalen uit elke z-positie te extraheren. Een cruciale stap van TACI is om de maximale waarde op elk tijdstip te sorteren en deze te gebruiken om de intensiteit van een cel weer te geven. Daarom is het belangrijk om alle z-posities van de cellen van belang tijdens het beeldvormingsproces op te nemen. Daarnaast raden we aan om een cel in vijf of meer z-posities te laten verschijnen, zodat de z-afstanden en z-posities geen invloed hebben op de maximale waarde (aanvullende figuur 2A,B). Bovendien zorgt TACI voor de scheiding van cellen die elkaar overlappen in de laterale (x / y) richting, maar in verschillende z-posities verschijnen.
Z-drift kan ook worden gecorrigeerd door fluorescentie-intensiteiten te extraheren uit 3D ROIs 8,11,29. We vergeleken TACI met twee 3D-ROI-methoden. Ten eerste creëerden Klein et al. een aangepaste software geschreven in IGOR Pro die de helderste 100 pixels in elke 3D ROI gebruikt om het onbewerkte signaal29 te genereren. Deze methode en TACI leverden vergelijkbare resultaten op (aanvullende figuur 3A). Ten tweede hebben we IMARIS (versie 9.8.2), een commerciële software, toegepast om de 3D-ROI's te modelleren en hun gemiddelde intensiteiten te extraheren. Hoewel de resultaten van TACI en IMARIS vergelijkbare trends vertoonden, waren de vouwveranderingen verschillend (aanvullende figuur 3B). Deze discrepantie kan te wijten zijn aan algoritmen. Van belang is dat de maximale waarde die door TACI wordt geëxtraheerd evenredig is met de intensiteit van de grondwaarheid (aanvullende figuur 2C).
Hoewel deze workflow semi-automatisch is en nog steeds handmatige inspanningen van onderzoekers vereist, biedt het een computationele benadering voor 3D-calciumbeeldvormingsanalyse. Belangrijk is dat deze workflow is gebaseerd op ImageJ en geen commerciële software of programmeerkennis vereist. De beperkingen en mogelijke oplossingen voor deze workflow zijn als volgt. Ten eerste accepteert TACI alleen TIFF-bestanden en een specifieke bestandsnaamstructuur: filename_h#t#z#c#.tif (h# en c# zijn optioneel). Andere bestandsindelingen die compatibel zijn met ImageJ kunnen echter eenvoudig worden geconverteerd naar TIFF-bestanden door ImageJ. Bovendien heeft de plug-in een RENAME-functie die de afbeeldingsnamen converteert naar de vereiste structuur, zodat deze compatibel is met calciumbeeldvormingsgegevens die uit verschillende systemen zijn verkregen.
Ten tweede is de plug-in ontworpen voor calciumbeeldvormingsgegevens met constante achtergronden. Het aftrekken van de bijbehorende achtergrondinformatie van de ROI-intensiteiten op elk tijdstip is een manier om fluctuerende achtergronden te corrigeren. De tool biedt ROI-intensiteiten op elk tijdstip in de python_files map. De achtergrondintensiteiten kunnen worden weergegeven door (1) de gemiddelde intensiteiten van de beelden of (2) de gemiddelde intensiteiten van de ROI's zonder actieve cellen. ImageJ biedt methoden om de gemiddelde intensiteiten van de afbeeldingen te verkrijgen (door op Afbeelding | Stapelen | Stack meten) en de gemiddelde intensiteiten van willekeurige ROI's (door te klikken op Analyseren | Hulpmiddelen | ROI-manager | Multi Maat). Als fotobleaching optreedt tijdens calciumbeeldvorming, de bleekcorrectiefunctie (door op afbeelding | Aanpassen | Bleekcorrectie) kan vóór TrackMate worden uitgevoerd.
Ten slotte moet celregistratie over z-posities in deze workflow worden opgenomen als TACI wordt gebruikt om een groot aantal neuronen tegelijkertijd te analyseren. Dienovereenkomstig moet een extra functie worden ontwikkeld die de informatie over fluorescentie-intensiteiten organiseert in de gegevensstructuur die vereist is voor de MERGE-functie .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
Een Zeiss LSM 880 in het Fralin Imaging Center werd gebruikt om de calciumbeeldvormingsgegevens te verzamelen. We erkennen Dr. Michelle L Olsen en Yuhang Pan voor hun hulp met de IMARIS-software. We erkennen Dr. Lenwood S. Heath voor constructieve opmerkingen over het manuscript en Steven Giavasis voor opmerkingen over het GitHub README-bestand. Dit werk werd ondersteund door NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) en NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) aan L.N. De financiers hadden geen rol in het studieontwerp, de gegevensverzameling en -analyse, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt Fill Needel | BD | 303129 | |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Fly food ingredient |
| Carbon dioxide | Airgas | UN1013 | Size 200 High Pressure Steel Cylinder |
| CO2 bubbler kit | Genesee | 59-180 | |
| Confocal microscope LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2. |
| DAQami software | Measurement Computing | ||
| Dextrose | Genesee | 62-113 | Fly food ingredient |
| Drosophila Agar | Genesee | 66-111 | Fly food ingredient |
| Ethanol | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | Fly food ingredient |
| Fly line: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni lab | ||
| Fly line: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| General purpose forged brass regulator | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| Green Drosophila tubing | Genesee | 59-124 | |
| Heat transfer compound | MG Chemicals | 860-60G | |
| Heatsink | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | Resize to 12.9 x 5.5 cm |
| Illuminator | AmScope | LED-6W | |
| Inactive Dry Yeast | Genesee | 62-108 | Fly food ingredient |
| Incubator | Pervical | DR-41VL | Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH. |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Thermo Scientific | 126965000 | Fly food ingrediete |
| Micro cover glass | VWR | 48382-126 | 22 x 40 mm |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| Nail polish | Kleancolor | ||
| Narrow Drosophila vials | Genesee | 32-113RL | |
| Objective | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| Peltier cooling module | TE Technology | TE-127-1.0-0.8 | 30 x 30 mm |
| Plugs | Genesee | 49-102 | |
| Power Supply | Circuit Specialists | CSI1802X | 10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply |
| Princeton Artist Brush Nepture | Princeton Artist Brush Co. | Series 4750, size 2 | |
| Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate | Thermo Scientific | 033241-36 | Fly food ingredient |
| Stage insert | Wienecke and Sinske | 432339-9030-000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | Any stereo microscope works |
| T-Fitting | Genesee | 59-123 | |
| Thermocouple data acquisition device | Measurement Computing | USB-2001-TC | Single channel |
| Thermocouple microprobe | Physitemp | IT-24P | |
| Yellow Cornmeal | Genesee | 62-101 | Fly food ingredient |
| Z-axis piezo stage | Wienecke and Sinske | 432339-9000-000 |
References
- Grienberger, C., Konnerth, A.
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Zhang, Y., et al. jGCaMP8 fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
- Robbins, M., Christensen, C. N., Kaminski, C. F., Zlatic, M. Calcium imaging analysis - How far have we come. F1000Research. 10, 258 (2021).
- Oh, J., Lee, C., Kaang, B. K. Imaging and analysis of genetically encoded calcium indicators linking neural circuits and behaviors. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 23 (4), 237-249 (2019).
- Stringer, C., Pachitariu, M. Computational processing of neural recordings from calcium imaging data. Current Opinion in Neurobiology. 55, 22-31 (2019).
- Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
- Nguyen, J. P., Linder, A. N., Plummer, G. S., Shaevitz, J. W., Leifer, A. M. Automatically tracking neurons in a moving and deforming brain. PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005517 (2017).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. EMC2: A versatile algorithm for robust tracking of calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. bioRxiv. , (2021).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
- Delestro, F., et al. In vivo large-scale analysis of Drosophila neuronal calcium traces by automated tracking of single somata. Scientific Reports. 10, 7153 (2020).
- Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).
- Eglen, S. J., et al. Toward standard practices for sharing computer code and programs in neuroscience. Nature Neuroscience. 20 (6), 770-773 (2017).
- Pachitariu, M., et al. Suite2p: Beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy. bioRxiv. , (2017).
- Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. Tracking calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. PLoS Computational Biology. 17 (10), 1009432 (2021).
- Kolar, K., Dondorp, D., Zwiggelaar, J. C., Høyer, J., Chatzigeorgiou, M. Mesmerize is a dynamically adaptable user-friendly analysis platform for 2D and 3D calcium imaging data. Nature Communications. 12, 6569 (2021).
- Moein, M., et al. CaSiAn: A Calcium Signaling Analyzer tool. Bioinformatics. 34 (17), 3052-3054 (2018).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
- Neugornet, A., O'Donovan, B., Ortinski, P. I. Comparative effects of event detection methods on the analysis and interpretation of Ca(2+) imaging data. Frontiers in Neuroscience. 15, 620869 (2021).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Fazeli, E., et al. Automated cell tracking using StarDist and TrackMate. F1000Research. 9, 1279 (2020).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Ni, L., et al. The ionotropic receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
- Omelchenko, A. A., et al. Cool and warm ionotropic receptors control multiple thermotaxes in Drosophila larvae. Frontiers in Molecular Neuroscience. , (2022).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nature Communications. 9 (1), 4252 (2018).
- Hernandez-Nunez, L., et al. Synchronous and opponent thermosensors use flexible cross-inhibition to orchestrate thermal homeostasis. Science Advances. 7 (35), (2021).
- Klein, M., et al. Sensory determinants of behavioral dynamics in Drosophila thermotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (2), 220-229 (2015).
