Summary
TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) è un plugin ImageJ open source per l'analisi 3D dell'imaging del calcio che esamina il movimento sull'asse z e identifica il valore massimo di ogni z-stack per rappresentare l'intensità di una cella nel punto temporale corrispondente. Può separare i neuroni che si sovrappongono nella direzione laterale (x / y) ma su diversi piani z.
Abstract
La ricerca nelle neuroscienze si è evoluta per utilizzare complessi strumenti di imaging e computazionali per estrarre informazioni complete dai set di dati. L'imaging del calcio è una tecnica ampiamente utilizzata che richiede un software sofisticato per ottenere risultati affidabili, ma molti laboratori faticano ad adottare metodi computazionali quando aggiornano i protocolli per soddisfare gli standard moderni. Le difficoltà sorgono a causa della mancanza di conoscenze di programmazione e paywall per il software. Inoltre, le cellule di interesse mostrano movimenti in tutte le direzioni durante l'imaging del calcio. Sono stati sviluppati molti approcci per correggere il movimento nella direzione laterale (x/y).
Questo documento descrive un flusso di lavoro che utilizza un nuovo plug-in ImageJ, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), per esaminare il movimento sull'asse z nell'imaging 3D del calcio. Questo software identifica il valore massimo di fluorescenza da tutte le posizioni z in cui appare un neurone e lo utilizza per rappresentare l'intensità del neurone nella posizione t corrispondente. Pertanto, questo strumento può separare i neuroni che si sovrappongono nella direzione laterale (x / y) ma appaiono su piani z distinti. Come plug-in ImageJ, TACI è uno strumento computazionale open source e facile da usare per l'analisi 3D dell'imaging del calcio. Abbiamo convalidato questo flusso di lavoro utilizzando neuroni termosensibili larvali di mosca che mostravano movimenti in tutte le direzioni durante la fluttuazione della temperatura e un set di dati di imaging del calcio 3D acquisito dal cervello del moscerino.
Introduction
Il livello di calcio intracellulare è un marcatore preciso di eccitabilità neuronale. L'imaging del calcio misura i cambiamenti nel calcio intracellulare per comprendere l'attività neuronale1. Gli studi nelle neuroscienze hanno sempre più utilizzato questo metodo a causa dello sviluppo di tecniche per misurare la concentrazione intracellulare di calcio, compresi gli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI), come GCaMP2,3, che possono essere espressi in modo non invasivo in specifici gruppi di neuroni attraverso approcci genetici. I minori costi dei laser e dei componenti del microscopio hanno anche aumentato l'uso dell'imaging del calcio4. È importante sottolineare che l'imaging del calcio consente di registrare e studiare contemporaneamente singoli neuroni e grandi popolazioni di neuroni in animali che si muovono liberamente5.
Tuttavia, l'analisi dei dati di imaging del calcio è impegnativa perché (1) comporta il monitoraggio dei cambiamenti nella fluorescenza delle singole cellule nel tempo, (2) il segnale di fluorescenza scompare o riappare in modo intermittente con risposte neuronali e (3) i neuroni possono muoversi in tutte le direzioni, in particolare dentro e fuori da un piano focale o apparire su più piani4, 6. L'analisi manuale richiede molto tempo e diventa poco pratica con l'aumentare della lunghezza delle registrazioni e del numero di neuroni. Sono stati sviluppati vari programmi software per accelerare il processo di analisi dell'imaging del calcio. In precedenza, il software era stato progettato in un contesto sperimentale limitato, rendendo difficile per altri laboratori adottarlo. I recenti sforzi per soddisfare i moderni standard per la condivisione del software hanno portato allo sviluppo di diversi strumenti in grado di analizzare costantemente i dati di imaging del calcio in diversi gruppi 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Tuttavia, la maggior parte di questi strumenti richiede conoscenze di programmazione e / o dipende da software commerciali. La mancanza di conoscenze di programmazione e paywall software scoraggiano i ricercatori dall'adottare questi metodi. Inoltre, molti di questi strumenti si concentrano sulla correzione del movimento x/y, sebbene anche il movimento sull'asse z debba essere esplicitamente diagnosticato e corretto6. C'è bisogno di uno strumento computazionale per analizzare l'imaging 3D del calcio che si concentra sui neuroni che mostrano z-drift e appaiono su più piani z. Idealmente, questo strumento dovrebbe utilizzare software open source e non richiedere conoscenze di programmazione per consentire ad altri laboratori di adottarlo prontamente.
Qui, abbiamo sviluppato un nuovo plug-in ImageJ, TACI, per analizzare i dati di imaging 3D del calcio. Innanzitutto, il software rinomina, se necessario, e organizza i dati di imaging del calcio 3D per posizioni z. Le celle di interesse sono tracciate in ogni posizione z e le loro intensità di fluorescenza sono estratte da TrackMate o altri strumenti computazionali. TACI viene quindi applicato per esaminare il movimento sull'asse z. Identifica il valore massimo di uno z-stack e lo utilizza per rappresentare l'intensità di una cella nel punto temporale corrispondente. Questo flusso di lavoro è adatto all'analisi dell'imaging 3D del calcio con movimento in tutte le direzioni e / o con neuroni sovrapposti nella direzione laterale (x / y) ma che appaiono in diverse posizioni z. Per convalidare questo flusso di lavoro, sono stati utilizzati set di dati di imaging del calcio 3D da neuroni termosensibili larvali di mosca e neuroni di funghi nel cervello. Da notare che TACI è un plugin ImageJ open source e non richiede alcuna conoscenza di programmazione.
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Protocol
1. Imaging del calcio
- Preparazione delle larve di mosca
NOTA: Le mosche e le larve sono mantenute a 25 °C in un ciclo luce:buio di 12 ore:12 ore.- Anestetizzare le mosche con CO2. Ordinare 20-45 maschi e 20-45 femmine in ogni fiala di mosca e dare loro almeno 24 ore a 48 ore per riprendersi dall'esposizione a CO2 .
NOTA: L'esposizione della mosca alla CO2 dovrebbe durare per il minor tempo possibile. - Per sincronizzare l'età delle larve, picchiettare le mosche in nuove fiale contenenti granuli di lievito e consentire loro 4-8 ore per deporre le uova. Rimuovere le mosche capovolgendoli in nuove fiale.
- Raccogliere le larve a 72 h utilizzando 10 ml di soluzione di saccarosio al 20% p/v.
- Anestetizzare le mosche con CO2. Ordinare 20-45 maschi e 20-45 femmine in ogni fiala di mosca e dare loro almeno 24 ore a 48 ore per riprendersi dall'esposizione a CO2 .
- Configurazione del microscopio e del controllo della temperatura
- Eseguire l'imaging su un microscopio confocale (vedere la tabella dei materiali) e uno stadio piezoelettrico sull'asse z con un inserto di palcoscenico utilizzando le seguenti impostazioni: laser, Argon; modalità di scansione, fotogramma; dimensione del fotogramma, 512 x 512; velocità, massimo; canali/profondità di bit, 1/8 bit; zoom, 1,5; z-stack, fetta = 15, Keep = fetta; dispositivi di messa a fuoco e strategia, messa a fuoco definita; messa a fuoco, Focus definitivo su.
- Collegare un modulo di raffreddamento Peltier a un dissipatore di calore dal composto di trasferimento del calore per costruire un dispositivo di raffreddamento termoelettrico. Il Peltier è alimentato da un alimentatore da 2 A.
- Collegare una microsonda a termocoppia a un dispositivo di acquisizione dati per registrare la temperatura.
- Imaging del calcio
- Risciacquare le larve 3 volte in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Pipettare 75 μL di 1x PBS al centro di un vetrino.
- Metti una o due larve in 1x PBS e posiziona la microsonda della termocoppia vicino alle larve.
NOTA: La distanza tra le larve e la microsonda deve essere ~ 5 mm. Le larve possono muoversi se la microsonda è posizionata troppo vicino a loro. Una grande distanza potrebbe comportare letture di temperatura imprecise. - Coprire le larve e la microsonda della termocoppia con un vetrino. Sigillare la copertina con lo smalto.
- Posizionare il vetrino sul palco del microscopio, trovare la messa a fuoco utilizzando un obiettivo 25x e posizionare il dispositivo di raffreddamento termoelettrico sul vetrino.
NOTA: Il Peltier viene posizionato direttamente sul vetrino dove le larve devono erogare gli stimoli di temperatura. - Nel software confocale, concentrarsi sulle cellule fluorescenti di interesse. Regolare la potenza del laser per evitare la sovrasaturazione. Impostate la prima e l'ultima posizione della sezione nell'impostazione z-stack.
NOTA: utilizzare la potenza laser più bassa possibile prima della registrazione per evitare lo sbiancamento fotografico. - Avviare contemporaneamente la scansione z-stack e la registrazione della temperatura.
- Controllare l'alimentatore che alimenta il Peltier per modificare la temperatura superficiale Peltier. Accendere l'alimentatore per diminuire la temperatura e spegnerlo per aumentare la temperatura.
- Interrompere la scansione z-stack e la registrazione della temperatura.
2. Analisi dei dati di imaging del calcio 3D
- Esportare i dati di imaging del calcio in file TIFF e salvarli in una cartella con lo stesso nome del nome di base dei file TIFF all'interno.
Nota : il nome del file non deve contenere virgole.- Utilizzare i seguenti parametri per esportare i dati di imaging del calcio da ZEN (edizione nera): tipo di file, TIFF; compressione, LZW; canali, 2; Posizione Z, tutti; tempo, tutto; fase, 1; regione, pieno.
- Installazione
- Scarica TACI-Calcium_Imaging.jar da Github (https://github.com/niflylab/TACI_CalciumImagingPlugin/releases).
- Installa il plugin in FIJI facendo clic su Plugin nella barra dei menu e quindi facendo clic su Installa nel menu a discesa (Plugin | Installare). Quindi, riavviare FIJI.
NOTA: NON utilizzare plugin | Installa plugin. - Esegui il plugin facendo clic su Plugins e quindi scegliendo TACI-Calcium Imaging (Plugin | TACI-Calcio Imaging).
- Utilizzare la funzione RENAME per convertire i nomi di file TIFF nella struttura richiesta.
Nota : lo strumento utilizza filename_h#t#z#c#.tif come struttura predefinita (h# e c# sono facoltativi; #: un numero intero positivo). Se i nomi dei file di immagine non sono nella struttura predefinita, è necessario eseguire la funzione RENAME .- Scegliere la cartella in cui è necessario rinominare le immagini TIFF facendo clic su Sfoglia cartelle.
- Immettere le informazioni sul parametro. Sono elencati cinque parametri, tra cui Nome file, Fase, Max T-Position, Max Z-Position e Canale. Ogni parametro ha tre valori: Testo precedente, Valore parametro e Ordine.
Nota : le informazioni fanno distinzione tra maiuscole e minuscole. Se i nomi dei file di immagine contengono una frase prima di un parametro, inserire la frase come testo precedente del parametro corrispondente. Se i nomi dei file immagine contengono una frase dopo tutti i parametri, inserisci la frase come testo del post.- Assicurarsi di immettere Nome file, Max T-Position e Max Z-Position e che i valori dei parametri per Max T-Position e Max Z-Position includano tutte le cifre.
- Attendere che il nome del file venga riempito automaticamente utilizzando il nome della cartella.
- Se i nomi dei file TIFF non includono la fase e il canale, lasciate vuoto il valore del parametro corrispondente e scegliete Na in Ordine.
- Fare clic su Rinomina per creare una cartella con lo stesso nome e lo stesso _r. Si noti che nella cartella, i nomi dei file TIFF sono stati ristrutturati per essere compatibili con la funzione ORGANIZZA .
NOTA: _r è stato aggiunto ai nomi dei file delle immagini TIFF.
- Utilizzare la funzione ORGANIZZA per salvare le immagini TIFF dalla stessa posizione z in una cartella.
Nota : il nome della cartella deve avere lo stesso nome del nome di base dei file TIFF all'interno e NON deve avere virgole.- Scegliere la cartella in cui è necessario organizzare le immagini TIFF facendo clic su Sfoglia cartelle.
- Se il file CSV dei parametri (param.csv) esiste, attendere che i valori dei parametri vengano compilati automaticamente.
Nota : il file param.csv ha un formato richiesto. I parametri, inclusi nome file, fase, position_t, position_z, canale e is_gray, devono essere compilati nella riga 1 da sinistra a destra a partire dalla colonna A. I valori corrispondenti per ciascun parametro devono essere compilati nella riga 2. - Se il file CSV del parametro (param.csv) non esiste, inserire manualmente i valori dei parametri. Assicurarsi che i valori dei parametri di Fase e Canale includano lettere, mentre i valori dei parametri di Posizione T e Posizione Z dovrebbero essere i numeri più grandi delle posizioni T e Z. Se i nomi dei file di immagine non includono la fase o il canale, immettete Na.
- Crea immagini TIFF in scala di grigi quando necessario. Lascia deselezionata la casella Le immagini sono grigie? per ridimensionare le immagini.
- Fare clic su Organizza per creare una cartella con lo stesso nome e _gray_stacks e per generare cartelle con lo stesso nome e _# (#: posizioni z) nella cartella. Osservare che i file TIFF sono ordinati nelle cartelle corrispondenti da z-positions e che viene generato un file denominato param.csv, in cui è possibile trovare i parametri e i loro valori.
- Usa TrackMate nelle FIJI per estrarre le intensità di fluorescenza delle celle di interesse da ogni posizione z.
NOTA: questo passaggio può essere eseguito anche da altri software di imaging.- Aprire le immagini TIFF in una cartella z-position di FIJI.
- Esegui TrackMate facendo clic su Plugin | Monitoraggio | TrackMate e regolare i seguenti parametri, se necessario.
- Utilizzare rilevatori DoG o LoG.
- Modificare il diametro del BLOB, la soglia e il filtro mediano. Regolare il diametro del BLOB in modo che sia simile al diametro delle celle. Se le celle sono ovali, regolare il diametro del BLOB in modo che sia simile all'asse secondario.
NOTA: l'aumento della soglia consente di evitare che il rumore di fondo venga rilevato come segnale senza influire sull'intensità del segnale (Figura supplementare 1). Tuttavia, un aumento della soglia può mancare di segnali reali (figura supplementare 1). Se i segnali sono forti, utilizzare il filtro mediano per ridurre il rumore sale e pepe. - Impostare i filtri per rimuovere alcuni, se non tutti, i segnali irrilevanti. I filtri X e Y sono filtri spaziali. Utilizzare i filtri X e Y per rimuovere i segnali irrilevanti che sono distanti dai segnali reali.
NOTA: quando i filtri sono impostati su un'immagine, è fondamentale controllare tutte le altre immagini per assicurarsi che i segnali reali non vengano rimossi. - Impostate la distanza massima di collegamento, la distanza massima di chiusura dello spazio e la distanza massima di fotogramma di chiusura della fessura. Impostare la distanza massima di collegamento e la distanza massima di chiusura del gap su 3x-5x il diametro del blob, soprattutto quando i campioni si spostano in modo significativo nel tempo, per ridurre il numero di tracce. Impostate lo spazio massimo tra fotogrammi che chiude lo spazio sul numero di immagini nella pila.
- Esportare le intensità di fluorescenza delle regioni di interesse (ROI) in un file CSV. Se viene utilizzata una versione precedente di TrackMate, scegli Esporta tutte le statistiche degli spot nella finestra Seleziona un'azione . Se la versione di TrackMate è 7.6.1 o successiva, scegli Spot nella finestra Opzioni di visualizzazione . Esporta o salva come file interattivi in file CSV.
NOTA: entrambi i file sono interattivi con la finestra immagine; evidenziando un ROI viene visualizzato il ROI corrispondente nella finestra dell'immagine. Questi file includono le intensità medie (MEAN_INTENSITY o MEAN_INTENSITY_CH1) delle celle di interesse nei corrispondenti punti temporali (POSITION_T). La stessa TRACK_IDs dovrebbe rappresentare gli stessi ROI in momenti diversi. Tuttavia, questo non è sempre vero e potrebbe essere necessario correggerlo manualmente, quando necessario. Se TrackMate non riconosce i ROI in alcuni punti temporali, tali punti temporali non vengono visualizzati.
- Estrarre l'intensità della fluorescenza di fondo e creare il file Background_list.csv.
NOTA: In questo studio, l'intensità di fondo per ogni posizione z è stata stimata utilizzando il valore medio di tre o cinque blob vicini della stessa dimensione che non contenevano segnali di fluorescenza e provenivano da punti temporali diversi.- Il file Background_list.csv ha un formato richiesto: ogni colonna contiene le informazioni di un neurone, a partire dal neurone 0. Inserisci i numeri dei neuroni, ad esempio Neurone 0, nella riga 1. Quindi, fornire l'intensità di fondo per ogni posizione z analizzata: se vengono analizzate cinque posizioni z per il neurone 0, compilare cinque valori di intensità di sfondo sotto il neurone 0.
Nota : il file di Background_list.csv è necessario per la funzione TACI EXTRACT . Se lo sfondo è trascurabile, deve essere fornito il Background_list.csv con l'intensità di fondo zero di ogni neurone.
- Il file Background_list.csv ha un formato richiesto: ogni colonna contiene le informazioni di un neurone, a partire dal neurone 0. Inserisci i numeri dei neuroni, ad esempio Neurone 0, nella riga 1. Quindi, fornire l'intensità di fondo per ogni posizione z analizzata: se vengono analizzate cinque posizioni z per il neurone 0, compilare cinque valori di intensità di sfondo sotto il neurone 0.
- Utilizzare la funzione EXTRACT per identificare le intensità massime di fluorescenza in ciascuna posizione t e calcolare ΔF/F0 come mostrato nell'equazione (1).
(1)- Creare una cartella e assegnarle un nome utilizzando il numero del neurone, a partire dal neurone 0. Salvare i file CSV contenenti le informazioni sulla fluorescenza del neurone corrispondente nella cartella. Ogni file CSV contiene le informazioni di una posizione z, quindi il numero di file CSV è uguale al numero di posizioni z analizzate. Assegna ai file CSV il nome Mean_Intensity#.csv (# rappresenta la posizione z) e ogni file CSV include almeno due colonne: POSITION_T e MEAN_INTENSITY o MEAN_INTENSITY_CH1.
NOTA: creare una cartella per ogni cella di interesse. - Salvare il file Background_list.csv e le cartelle create nel passaggio 2.7.1 in un'unica cartella. Scegli questa cartella facendo clic su Sfoglia file.
Nota : il numero di valori di sfondo nel file Background_list.csv deve corrispondere al numero dei file Mean_Intensity#.csv per ogni neurone. - Il file di sfondo viene compilato automaticamente. Compila il maggior numero di posizioni T per il numero di posizioni T.
- Fare clic su Estrai per creare una cartella dei risultati, inclusi i file CSV e i grafici per ciascun neurone. I file CSV includono informazioni sulla massima intensità di fluorescenza e ΔF/F0 in ogni posizione t. I grafici sono grafici a linee di ΔF/F0 su posizioni t.
NOTA: In questo studio, ΔF/F0 è stato calcolato utilizzando l'equazione (1). Il primo valore di ogni posizione z è stato utilizzato come F0. Se questo F0 non è appropriato20, il plugin fornisce file che includono dati grezzi per ciascun neurone nella cartella python_files.
- Creare una cartella e assegnarle un nome utilizzando il numero del neurone, a partire dal neurone 0. Salvare i file CSV contenenti le informazioni sulla fluorescenza del neurone corrispondente nella cartella. Ogni file CSV contiene le informazioni di una posizione z, quindi il numero di file CSV è uguale al numero di posizioni z analizzate. Assegna ai file CSV il nome Mean_Intensity#.csv (# rappresenta la posizione z) e ogni file CSV include almeno due colonne: POSITION_T e MEAN_INTENSITY o MEAN_INTENSITY_CH1.
- Utilizzare la funzione MERGE per calcolare la media del ΔF/F0 di ciascun neurone, calcolare il SEM e tracciare il ΔF/F0 medio sulle posizioni t.
- Scegliere la cartella dei risultati creata dalla funzione EXTRACT facendo clic su Sfoglia file.
- Compila il numero di posizioni T con il maggior numero di posizioni T .
- Fare clic su Unisci per creare una cartella merged_data, inclusi un file di merged_data.csv e un grafico Average_dF_F0.png. Il file CSV include le informazioni sulla media e SEM ΔF/F0 in ogni posizione t. Il grafico è un grafico a linee della media ΔF/F0 sulle posizioni t.
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Representative Results
Flusso di lavoro di analisi 3D di imaging del calcio
In questo studio, abbiamo sviluppato un nuovo plug-in ImageJ, TACI, e descritto un flusso di lavoro per tracciare la deriva z e analizzare l'imaging 3D del calcio che individua le risposte delle singole cellule che appaiono in più posizioni z (Figura 1). Questo strumento ha quattro funzioni: RENAME, ORGANIZE, EXTRACT e MERGE. Innanzitutto, se i nomi delle immagini non sono compatibili con la funzione ORGANIZZA, la funzione RENAME può convertire i nomi delle immagini nella struttura richiesta. Quindi, la funzione ORGANIZE scala i grigi (se necessario) e organizza i dati TIFF di imaging del calcio 3D in base alle posizioni z. Le immagini della stessa posizione z vengono salvate in una cartella. Successivamente, è possibile utilizzare diversi strumenti di analisi delle immagini per rilevare e tracciare i ROI ed estrarre le loro intensità di fluorescenza nel tempo per ogni posizione z. Per eseguire questo passaggio è stato utilizzato un plug-in ImageJ, TrackMate. TrackMate è un plugin ImageJ open source per tracciare singole particelle21. È stato ampiamente utilizzato per tracciare le particelle in vari studi biologici che coinvolgono l'imaging di cellule vive, tra cui l'imaging del calcio 11,21,22,23. TrackMate, in modo automatico, traccia le celle nella direzione laterale (x/y), rileva i ROI ed estrae i segnali da un set di dati di imaging live 4,12. Per ogni cella di interesse, la funzione EXTRACT ordina le intensità di fluorescenza da tutte le posizioni z per posizioni t, identifica i valori massimi di ciascuna posizione t, sottrae lo sfondo e calcola e traccia ΔF/F0. Infine, la funzione MERGE calcola e traccia la media di ΔF/F0 di più celle.
Risposte del calcio dei neuroni freddi larvali di mosca ai cambiamenti di temperatura
Abbiamo convalidato questo metodo utilizzando i cambiamenti di calcio in risposta alle fluttuazioni di temperatura nei neuroni freddi larvali della mosca. Un indicatore di calcio geneticamente codificato, GCaMP6m 24, è stato espresso nei neuroni freddi larvali da Ir21a-Gal425. Quando esposti a circa 27 °C, i neuroni avevano bassi livelli di calcio intracellulare (Figura 2A e Figura 3). Quando la temperatura è stata ridotta a circa 10 °C e mantenuta lì, i livelli di calcio intracellulare sono aumentati rapidamente e sono stati sostenuti (Figura 2B e Figura 3). I livelli di calcio sono diminuiti rapidamente quando la temperatura è stata aumentata (Figura 3).
Analisi di un set di dati di imaging del calcio 3D del cervello di mosca
Abbiamo anche convalidato questo metodo utilizzando un set di dati di imaging del calcio 3D del cervello di mosca11. Le mosche transgeniche ritratte (VT50339-Gal4; UAS-GCaMP6f) ha espresso GCaMP6f nel corpo del fungo nel cervello11. I dati provenienti da 45 posizioni z (distanziate a intervalli di 1,5 μm) sono stati raccolti a 50 Hz per 225 s (250 punti temporali) ed è stata analizzata la prima metà del set di dati (125 punti temporali). Quando è iniziata la registrazione, sette neuroni avevano un'evidente fluorescenza e quattro di loro sono stati analizzati (Figura 4A). Le intensità in questi neuroni sono diminuite nel tempo (Figura 4B). Quando è stato applicato l'ottanolo (Figura 4C), più neuroni si sono illuminati. È stato scoperto che la fluorescenza di 10 neuroni aumenta simultaneamente nel punto temporale 92 (Figura 4D), suggerendo che questi neuroni dei funghi rispondono all'odore di ottanolo. Sebbene l'ottanolo sia stato applicato per 5 s, l'alta fluorescenza in questi neuroni è stata osservata in un solo punto temporale (0,9 s) e poi è rapidamente diminuita, suggerendo che la risposta è fasica e transitoria.
Separazione delle celle sovrapposte
La figura 5A presenta un'immagine di proiezione massimale di tre neuroni. La punta della freccia bianca indica due neuroni che si sovrapponevano nel piano x/y ma erano separati nella vista ortografica (punte di freccia blu e arancioni nella Figura 5B), indicando che questi neuroni apparivano in diverse posizioni z; la cella arancione aveva il segnale più forte su z7 (Figura 5C), mentre la cella blu aveva il segnale più forte su z10 (Figura 5D). Lo strumento ha distinto queste due cellule e ha rivelato l'attivazione ritardata ma forte della cellula arancione (Figura 5E).
Figura 1: Flusso di lavoro che utilizza TACI per analizzare l'imaging 3D del calcio. TACI ha quattro funzioni: RENAME, ORGANIZE, EXTRACT e MERGE. Innanzitutto, se i nomi TIFF non sono compatibili con la funzione ORGANIZZA, la funzione RENAME può convertire i nomi delle immagini nella struttura richiesta. Quindi, la funzione ORGANIZE scala i grigi (se necessario) e organizza i dati TIFF di imaging del calcio 3D in base alle posizioni z. Le immagini della stessa posizione z vengono salvate in una cartella. Successivamente, è possibile utilizzare diversi strumenti di analisi delle immagini per rilevare e tracciare i ROI ed estrarre le loro intensità di fluorescenza in ogni posizione z. Per ogni cella di interesse, la funzione EXTRACT ordina le intensità di fluorescenza in base ai corrispondenti punti temporali, identifica i valori massimi di ciascuna posizione t, sottrae lo sfondo e calcola e traccia ΔF/F0. Infine, la funzione MERGE calcola e traccia la media di ΔF/F0 di più celle. Abbreviazioni: TACI = TrackMate Analysis of Calcium Imaging; ROI = regioni di interesse; ΔF/F0 = rapporto tra la variazione della fluorescenza e l'intensità iniziale della fluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Imaging del calcio delle cellule fredde larvali di mosca in stati inattivi e attivi . (A) Le cellule sono appena visibili nello stato inattivo. (B) Le cellule sono fortemente fluorescenti allo stato attivo. Le punte delle frecce di colore diverso indicano celle diverse. Il genotipo è Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. Z5-13: immagini in posizioni z da 5 a 13. In B, la cella indicata dalle punte di freccia bianche è mostrata da z5 a z8; Le celle indicate da punte di freccia arancioni e blu sono mostrate da Z8 a Z13. Barra della scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Quantificazione della fluorescenza come variazione dell'intensità di fluorescenza (F) rispetto all'intensità iniziale (F0). Il genotipo è Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. n = 7 cellule di tre animali. Tracce = media ± SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Analisi di un set di dati di imaging 3D del calcio del cervello di mosca. (A) L'immagine di proiezione massima nel punto temporale 1 (t1). I numeri 0-3 indicano i quattro neuroni analizzati. (B) Variazioni di fluorescenza dei neuroni 0-3 in A durante i punti temporali da 0 a 125. (C) L'immagine di proiezione massimale nel punto temporale 92 (t92). I numeri 0-9 indicano i 10 neuroni analizzati. (D) Variazioni di fluorescenza dei neuroni 0-9 in C durante i punti temporali da 0 a 125. Sono stati applicati 5 s di aria o 5 s di ottanolo, come mostrato in grigio. Barra di scala = 10.000 unità di intensità di fluorescenza grezza. Abbreviazione: OCT = ottanolo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Separazione delle celle sovrapposte in base al valore massimo. (A) Due neuroni si sovrappongono (punta di freccia bianca) in un'immagine di proiezione massimale (m). Il genotipo è Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. (B) Questi neuroni sono separati nella vista ortografica (punte di freccia blu e arancioni). (C,D) La cella arancione appare su z7 (C), mentre la cella blu appare su z10 (D). Barra della scala = 10 μm. (E) Le variazioni di fluorescenza delle celle arancioni e blu sono quantificate utilizzando i valori massimi delle singole posizioni z. Abbreviazione: ΔF/F0 = rapporto tra la variazione della fluorescenza e l'intensità iniziale della fluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare 1: Due neuroni con deboli segnali di calcio vengono analizzati utilizzando rivelatori DoG e LoG a soglie diverse. (A-C) Il primo neurone (Ir21a-Gal80 26/UAS-GCaMP6;Ir93a-Gal427) viene analizzato da DoG e LoG a soglie diverse. (A) La soglia è fissata a 0,1. Sia DoG che LoG rilevano tutti i 36 punti temporali. (B) La soglia è fissata a 0,3. Tra i 36 punti temporali, DoG ne rileva 36 e LoG ne rileva 35. (C) La soglia è fissata a 1,0. Tra i 36 punti temporali, DoG ne rileva 34 e LoG ne rileva 15. (D-F) Il secondo neurone (UAS-GCaMP6;Ir68a-Gal428) viene analizzato da DoG e LoG a diverse soglie. (D) La soglia è fissata a 0,1. DoG rileva tutti i 36 punti temporali e LoG ne rileva 34. (E) La soglia è fissata a 0,3. Tra i 36 punti temporali, DoG ne rileva 33 e LoG ne rileva 18. (F) La soglia è fissata a 1,0. Tra i 36 punti temporali, DoG ne rileva 14 e LoG ne rileva solo uno. Da notare che l'aumento della soglia non influisce sulla sua lettura dell'intensità se viene riconosciuto un ROI. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2: Il valore massimo è un buon rappresentante dell'intensità di una cella. (A) Vengono simulati stack Z con diverse distanze z. (B) Vengono simulati stack Z con diverse posizioni z. (C) Gli Z-stack sono creati da celle simulate con intensità diverse. Abbreviazioni: max = il valore massimo di uno z-stack; ground_truth = il prodotto del volume della cella simulata e della sua intensità riempita. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 3: Confronto tra i metodi TACI e 3D-ROI. (A) Le variazioni di fluorescenza in due celle indicate dall'arancione e dal blu sono quantificate utilizzando TACI e un software personalizzato scritto in IGOR Pro. Il tipo di genotipo è R11F02-Gal429; UAS-GCaMP6m. (B) Le variazioni di fluorescenza in due cellule indicate dall'arancione e dal blu sono quantificate utilizzando TACI e IMARIS. Il tipo di genotipo è Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. Abbreviazione: ΔF/F0 = rapporto tra la variazione della fluorescenza e l'intensità iniziale della fluorescenza. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Questo studio ha sviluppato un nuovo plug-in ImageJ, TACI, e ha descritto un flusso di lavoro che analizza l'imaging 3D del calcio. Molti strumenti attualmente disponibili si concentrano sulla correzione del movimento x/y, sebbene anche il movimento sull'asse z debba essere esplicitamente diagnosticato o corretto6. Durante l'acquisizione di immagini in un organismo vivo, il movimento sull'asse z è inevitabile anche quando l'organismo è immobilizzato e alcuni stimoli, come il cambiamento di temperatura, spesso causano una significativa deriva z. L'aumento dell'altezza degli z-stack consentirà di registrare le celle di interesse durante l'intero processo di imaging; Tuttavia, non è banale analizzare il movimento sull'asse Z, specialmente quando le singole celle appaiono in più posizioni Z. Se tale movimento viene ignorato, i ricercatori non otterranno le risposte precise del calcio di queste cellule. TACI corregge la deriva z estraendo i segnali di fluorescenza da ogni posizione z. Un passaggio critico di TACI è quello di ordinare il valore massimo in ogni punto temporale e usarlo per rappresentare l'intensità di una cella. Pertanto, è fondamentale includere tutte le posizioni z delle cellule di interesse durante il processo di imaging. Inoltre, si consiglia di consentire che una cella appaia in cinque o più posizioni z in modo che le distanze z e le posizioni z non influiscano sul valore massimo (Figura supplementare 2A,B). Inoltre, TACI consente la separazione delle celle che si sovrappongono nella direzione laterale (x / y) ma appaiono in diverse posizioni z.
La deriva dello Z può anche essere corretta estraendo intensità di fluorescenza dai ROI 3D 8,11,29. Abbiamo confrontato TACI con due metodi 3D-ROI. In primo luogo, Klein et al. hanno creato un software personalizzato scritto in IGOR Pro che utilizza i 100 pixel più luminosi in ogni ROI 3D per generare il segnale grezzo29. Questo metodo e TACI hanno prodotto risultati simili (figura supplementare 3A). In secondo luogo, abbiamo applicato IMARIS (versione 9.8.2), un software commerciale, per modellare i ROI 3D ed estrarre le loro intensità medie. Sebbene i risultati di TACI e IMARIS abbiano mostrato tendenze simili, le variazioni di piega sono state diverse (figura supplementare 3B). Questa discrepanza può essere dovuta agli algoritmi. Da notare che il valore massimo estratto da TACI è proporzionale all'intensità di verità al suolo (Figura supplementare 2C).
Sebbene questo flusso di lavoro sia semi-automatico e richieda ancora sforzi manuali da parte dei ricercatori, fornisce un approccio computazionale per l'analisi 3D dell'imaging del calcio. È importante sottolineare che questo flusso di lavoro è basato su ImageJ e non richiede software commerciale o conoscenze di programmazione. Le limitazioni e le potenziali soluzioni per questo flusso di lavoro sono le seguenti. Innanzitutto, TACI accetta solo file TIFF e una struttura specifica del nome file: filename_h#t#z#c#.tif (h# e c# sono facoltativi). Tuttavia, altri formati di file compatibili con ImageJ possono essere facilmente convertiti in file TIFF da ImageJ. Inoltre, il plugin ha una funzione RENAME che converte i nomi delle immagini nella struttura richiesta in modo che sia compatibile con i dati di imaging del calcio ottenuti da diversi sistemi.
In secondo luogo, il plugin è progettato per i dati di imaging del calcio con sfondi costanti. Sottrarre le corrispondenti informazioni di base dalle intensità del ROI in ogni punto temporale è un modo per correggere gli sfondi fluttuanti. Lo strumento fornisce intensità di ROI in ogni punto temporale nella cartella python_files. Le intensità di fondo potrebbero essere rappresentate da (1) le intensità medie delle immagini o (2) le intensità medie dei ROI senza celle attive. ImageJ fornisce metodi per ottenere le intensità medie delle immagini (cliccando su Image | Pila | Measure Stack) e le intensità medie dei ROI casuali (cliccando su Analizza | Strumenti | Responsabile ROI | Multi misura). Se il fotosbiancamento avviene durante l'imaging del calcio, la funzione Bleach Correction (cliccando su Immagine | Regola | Bleach Correction) può essere eseguito prima di TrackMate.
Infine, la registrazione cellulare attraverso le posizioni z deve essere inclusa in questo flusso di lavoro se si utilizza TACI per analizzare un gran numero di neuroni contemporaneamente. Di conseguenza, è necessario sviluppare una funzione aggiuntiva che organizzi le informazioni sulle intensità di fluorescenza nella struttura dati richiesta dalla funzione MERGE .
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Uno Zeiss LSM 880 nel Fralin Imaging Center è stato utilizzato per raccogliere i dati di imaging del calcio. Ringraziamo la dottoressa Michelle L Olsen e Yuhang Pan per la loro assistenza con il software IMARIS. Riconosciamo il Dr. Lenwood S. Heath per i commenti costruttivi sul manoscritto e Steven Giavasis per i commenti sul file README di GitHub. Questo lavoro è stato supportato da NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) e NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) a L.N. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt Fill Needel | BD | 303129 | |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Fly food ingredient |
| Carbon dioxide | Airgas | UN1013 | Size 200 High Pressure Steel Cylinder |
| CO2 bubbler kit | Genesee | 59-180 | |
| Confocal microscope LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2. |
| DAQami software | Measurement Computing | ||
| Dextrose | Genesee | 62-113 | Fly food ingredient |
| Drosophila Agar | Genesee | 66-111 | Fly food ingredient |
| Ethanol | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | Fly food ingredient |
| Fly line: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni lab | ||
| Fly line: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| General purpose forged brass regulator | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| Green Drosophila tubing | Genesee | 59-124 | |
| Heat transfer compound | MG Chemicals | 860-60G | |
| Heatsink | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | Resize to 12.9 x 5.5 cm |
| Illuminator | AmScope | LED-6W | |
| Inactive Dry Yeast | Genesee | 62-108 | Fly food ingredient |
| Incubator | Pervical | DR-41VL | Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH. |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Thermo Scientific | 126965000 | Fly food ingrediete |
| Micro cover glass | VWR | 48382-126 | 22 x 40 mm |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| Nail polish | Kleancolor | ||
| Narrow Drosophila vials | Genesee | 32-113RL | |
| Objective | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| Peltier cooling module | TE Technology | TE-127-1.0-0.8 | 30 x 30 mm |
| Plugs | Genesee | 49-102 | |
| Power Supply | Circuit Specialists | CSI1802X | 10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply |
| Princeton Artist Brush Nepture | Princeton Artist Brush Co. | Series 4750, size 2 | |
| Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate | Thermo Scientific | 033241-36 | Fly food ingredient |
| Stage insert | Wienecke and Sinske | 432339-9030-000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | Any stereo microscope works |
| T-Fitting | Genesee | 59-123 | |
| Thermocouple data acquisition device | Measurement Computing | USB-2001-TC | Single channel |
| Thermocouple microprobe | Physitemp | IT-24P | |
| Yellow Cornmeal | Genesee | 62-101 | Fly food ingredient |
| Z-axis piezo stage | Wienecke and Sinske | 432339-9000-000 |
References
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