Summary
TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) er en åpen kildekode ImageJ plugin for 3D kalsium imaging analyse som undersøker bevegelse på z-aksen og identifiserer den maksimale verdien av hver z-stack å representere en celle intensitet på tilsvarende tidspunkt. Det kan skille nevroner som overlapper i lateral (x / y) retning, men på forskjellige z-plan.
Abstract
Forskning innen nevrovitenskap har utviklet seg til å bruke komplekse bildebehandlings- og beregningsverktøy for å trekke ut omfattende informasjon fra datasett. Kalsiumavbildning er en mye brukt teknikk som krever sofistikert programvare for å oppnå pålitelige resultater, men mange laboratorier sliter med å vedta beregningsmetoder når de oppdaterer protokoller for å oppfylle moderne standarder. Vanskeligheter oppstår på grunn av mangel på programmeringskunnskap og betalingsmurer for programvare. I tillegg viser celler av interesse bevegelser i alle retninger under kalsiumavbildning. Mange tilnærminger har blitt utviklet for å korrigere bevegelsen i lateral (x / y) retning.
Dette papiret beskriver en arbeidsflyt ved hjelp av en ny ImageJ-plugin, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), for å undersøke bevegelse på z-aksen i 3D-kalsiumavbildning. Denne programvaren identifiserer den maksimale fluorescensverdien fra alle z-posisjonene et nevron vises i, og bruker det til å representere nevronets intensitet ved den tilsvarende t-posisjonen. Derfor kan dette verktøyet skille nevroner som overlapper i lateral (x / y) retning, men vises på forskjellige z-plan. Som et ImageJ-plugin er TACI et brukervennlig, åpen kildekode-beregningsverktøy for 3D-kalsiumbildeanalyse. Vi validerte denne arbeidsflyten ved hjelp av fluelarver termosensitive nevroner som viste bevegelser i alle retninger under temperatursvingninger og et 3D kalsiumavbildningsdatasett anskaffet fra fluehjernen.
Introduction
Nivået av intracellulært kalsium er en presis markør for neuronal excitability. Kalsiumavbildning måler endringene i intracellulært kalsium for å forstå nevronaktivitet1. Studier i nevrovitenskap har i økende grad brukt denne metoden på grunn av utviklingen av teknikker for måling av intracellulær kalsiumkonsentrasjon, inkludert genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECI), som GCaMP2,3, som kan uttrykkes ikke-invasivt i spesifikke sett med nevroner gjennom genetiske tilnærminger. De lavere kostnadene for lasere og mikroskopkomponenter har også økt bruken av kalsiumavbildning4. Det er viktig at kalsiumavbildning gjør det mulig å registrere og studere enkeltnevroner så vel som store nevronpopulasjoner samtidig i fritt bevegelige dyr5.
Likevel er analysen av kalsiumavbildningsdata utfordrende fordi (1) det innebærer å spore endringene i fluorescens av individuelle celler over tid, (2) fluorescenssignalet forsvinner periodisk eller dukker opp igjen med nevronresponser, og (3) nevronene kan bevege seg i alle retninger, spesielt inn og ut av et fokalplan eller vises på flere plan4, 6. Manuell analyse er tidkrevende og blir upraktisk ettersom lengden på opptak og antall nevroner øker. Ulike programmer er utviklet for å akselerere prosessen med å analysere kalsiumavbildning. Tidligere ble programvare utviklet i en begrenset eksperimentell sammenheng, noe som gjorde det vanskelig for andre laboratorier å ta den i bruk. Nylige anstrengelser for å møte moderne standarder for programvaredeling har ført til utvikling av flere verktøy som konsekvent kan analysere kalsiumavbildningsdata på tvers av ulike grupper: 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Imidlertid krever de fleste av disse verktøyene programmeringskunnskap og / eller er avhengige av kommersiell programvare. Mangel på programmeringskunnskap og betalingsmurer for programvare avskrekker forskere fra å ta i bruk disse metodene. Videre fokuserer mange av disse verktøyene på å korrigere x / y-bevegelsen, selv om bevegelse på z-aksen også må diagnostiseres og korrigeres eksplisitt6. Det er behov for et beregningsverktøy for å analysere 3D-kalsiumavbildning som fokuserer på nevroner som viser z-drift og vises på flere z-plan. Ideelt sett bør dette verktøyet bruke åpen kildekode-programvare og ikke kreve programmeringskunnskap for å tillate andre laboratorier å lett vedta det.
Her utviklet vi en ny ImageJ-plugin, TACI, for å analysere 3D-kalsiumavbildningsdata. Først endrer programvaren navn, om nødvendig, og organiserer 3D-kalsiumavbildningsdataene etter z-posisjoner. De interessante cellene spores i hver z-posisjon, og fluorescensintensiteten ekstraheres av TrackMate eller andre beregningsverktøy. TACI brukes deretter for å undersøke bevegelsen på z-aksen. Den identifiserer maksimumsverdien for en z-stakk og bruker den til å representere en celles intensitet på det tilsvarende tidspunktet. Denne arbeidsflyten er egnet til å analysere 3D kalsiumavbildning med bevegelse i alle retninger og/eller med nevroner som overlapper i lateral (x/y) retning, men som opptrer i forskjellige z-posisjoner. For å validere denne arbeidsflyten ble 3D kalsiumavbildningsdatasett fra fluelarver termosensitive nevroner og soppnevroner i hjernen brukt. Merk at TACI er et åpen kildekode ImageJ-plugin og krever ingen programmeringskunnskap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kalsium avbildning
- Fly larver forberedelse
MERK: Fluer og larver holdes ved 25 °C under en 12 t:12 h lys:mørk syklus.- Bedøv fluene med CO2. Sorter 20-45 hanner og 20-45 hunner i hvert flueglass, og gi dem minst 24 timer til 48 timer for å komme seg etter CO2 -eksponeringen.
MERK: Flueeksponering for CO2 bør vare i kortest mulig tid. - For å synkronisere larvenes alder, bank over fluene i nye hetteglass med gjærgranulat, og la dem 4-8 timer legge egg. Fjern fluene ved å vippe dem inn i nye hetteglass.
- Samle larvene ved 72 timer ved bruk av 10 ml 20% w/v sukroseoppløsning.
- Bedøv fluene med CO2. Sorter 20-45 hanner og 20-45 hunner i hvert flueglass, og gi dem minst 24 timer til 48 timer for å komme seg etter CO2 -eksponeringen.
- Oppsett av mikroskop og temperaturkontroll
- Utfør avbildningen på et konfokalmikroskop (se materialfortegnelsen) og et z-akset piezotrinn med en sceneinnsats ved hjelp av følgende innstillinger: laser, Argon; skannemodus, ramme; rammestørrelse, 512 x 512; hastighet, maksimum; kanaler / bitdybde, 1/8 bit; zoom, 1.5; z-stack, skive = 15, Keep = skive; fokus enheter og strategi, bestemt fokus; fokus, Klart fokus på.
- Fest en Peltier-kjølemodul til en kjøleribbe ved varmeoverføringsforbindelsen for å bygge en termoelektrisk kjøler. Peltier drives av en 2 A strømforsyning.
- Fest en termoelementmikrosonde til en datainnsamlingsenhet for å registrere temperaturen.
- Avbildning av kalsium
- Skyll larvene 3x i 1x fosfatbufret saltvann (PBS).
- Pipette 75 μL med 1x PBS på midten av et glassglass.
- Sett en eller to larver i 1x PBS og plasser termoelementmikrosonden nær larvene.
MERK: Avstanden mellom larver og mikrosonden skal være ~ 5 mm. Larvene kan bevege seg hvis mikrosonden er plassert for nær dem. En stor avstand kan føre til unøyaktige temperaturavlesninger. - Dekk larver og termoelement mikroprobe med et glassdeksel. Forsegl dekselet med neglelakk.
- Plasser lysbildet på mikroskopstadiet, finn fokus ved hjelp av et 25x mål, og plasser den termoelektriske kjøleren på lysbildet.
MERK: Peltier plasseres direkte på lysbildet der larvene skal levere temperaturstimuli. - I konfokal programvare, fokuser på fluorescerende celler av interesse. Juster lasereffekten for å unngå overmetning. Angi første og siste stykkeposisjon i z-stack-innstillingen.
MERK: Bruk lavest mulig lasereffekt før opptak for å forhindre fotobleking. - Start z-stack-skanningen og temperaturregistreringen samtidig.
- Kontroller strømforsyningen som driver Peltier for å endre Peltier-overflatetemperaturen. Slå på strømforsyningen for å senke temperaturen og slå den av for å øke temperaturen.
- Stopp z-stack-skanningen og temperaturregistreringen.
2. Analyse av 3D kalsiumavbildningsdata
- Eksporter kalsiumavbildningsdataene til TIFF-filer og lagre dem i en mappe med samme navn som basisnavnet til TIFF-filene inni.
MERK: Filnavnet må ikke inneholde komma.- Bruk følgende parametere til å eksportere kalsiumavbildningsdata fra ZEN (svart utgave): filtype, TIFF; komprimering, LZW; kanaler, 2; Z-posisjon, alle; tid, alle; fase, 1; region, fullt.
- Installasjon
- Last ned TACI-Calcium_Imaging.jar fra Github (https://github.com/niflylab/TACI_CalciumImagingPlugin/releases).
- Installer pluginet i FIJI ved å klikke på Plugins i menylinjen og deretter klikke på Installer i rullegardinmenyen (Plugins | Installere). Start deretter FIJI på nytt.
MERK: Ikke bruk plugins | Installer plugin. - Kjør plugin ved å klikke på Plugins og deretter velge TACI-Calcium Imaging (Plugins | TACI-kalsiumavbildning).
- Bruk RENAME-funksjonen til å konvertere TIFF-filnavnene til ønsket struktur.
MERK: Verktøyet bruker filename_h#t#z#c#.tif som standardstruktur (h# og c# er valgfrie; #: et positivt heltall). Hvis bildefilnavnene ikke er i standardstrukturen, må RENAME-funksjonen utføres.- Velg mappen der TIFF-bildene må gi nytt navn ved å klikke Bla gjennom mapper.
- Fyll ut parameterinformasjonen. Fem parametere er oppført, inkludert filnavn, fase, maks t-posisjon, maks z-posisjon og kanal. Hver parameter har tre verdier: Foregående tekst, Parameterverdi og Rekkefølge.
MERK: Informasjonen skiller mellom store og små bokstaver. Hvis bildefilnavnene inneholder et uttrykk før en parameter, fyller du ut uttrykket som foregående tekst for den tilsvarende parameteren. Hvis bildefilnavnene inneholder et uttrykk etter alle parametere, fyller du ut uttrykket som innleggsteksten.- Pass på at du skriver inn Filnavn, Maks T-posisjon og Maks Z-posisjon, og at parameterverdiene for Max T-Position og Max Z-Position inkluderer alle sifre.
- Vent til filnavnet fylles ut automatisk ved hjelp av mappenavnet.
- Hvis TIFF-filnavnene ikke inkluderer fasen og kanalen, lar du den tilsvarende parameterverdien stå tom og velger Na i rekkefølge.
- Klikk Gi nytt navn for å opprette en mappe med samme navn og _r. Vær oppmerksom på at TIFF-filnavnene i mappen er omstrukturert for å være kompatible med ORGANISE-funksjonen .
MERK: _r er lagt til filnavnene til TIFF-bildene.
- Bruk ORGANISER-funksjonen til å lagre TIFF-bilder fra samme z-posisjon i én mappe.
MERK: Mappenavnet må ha samme navn som basenavnet til TIFF-filene inne og må IKKE ha komma.- Velg mappen der TIFF-bildene må organiseres ved å klikke Bla gjennom mapper.
- Hvis parameter-CSV-filen (param.csv) finnes, venter du til parameterverdiene fylles ut automatisk.
MERK: Param.csv filen har et nødvendig format. Parameterne, inkludert filnavn, fase, position_t, position_z, kanal og is_gray, må fylles ut i rad 1 fra venstre mot høyre fra og med kolonne A. Tilsvarende verdier for hver parameter må fylles ut i rad 2. - Hvis parameter-CSV-filen (param.csv) ikke finnes, fyller du ut parameterverdiene manuelt. Sørg for at parameterverdiene for Phase og Channel inneholder bokstaver, mens parameterverdiene for T-posisjon og Z-posisjon skal være de største tallene i t- og z-posisjonene. Hvis bildefilnavnene ikke inkluderer fasen eller kanalen, angir du Na.
- Opprett TIFF-bilder i gråtoner ved behov. La boksen med Er bilder grå? være umerket for å gråtonere bildene.
- Klikk Organiser for å opprette en mappe med samme navn og _gray_stacks og for å generere mapper med samme navn og _# (#: z-posisjoner) i mappen. Vær oppmerksom på at TIFF-filene er sortert i tilsvarende mapper etter z-posisjoner, og at en fil som heter param.csv genereres, der parametrene og deres verdier kan bli funnet.
- Bruk TrackMate i FIJI for å trekke ut fluorescensintensitetene til cellene av interesse fra hver z-posisjon.
MERK: Dette trinnet kan også utføres av annen bildebehandlingsprogramvare.- Åpne TIFF-bildene i en z-posisjonsmappe av FIJI.
- Kjør TrackMate ved å klikke på Plugins | Sporing | TrackMate, og juster følgende parametere om nødvendig.
- Bruk DoG - eller LoG-detektorer.
- Endre blob-diameteren, terskelverdien og medianfilteret. Juster blob-diameteren slik at den ligner diameteren på cellene. Hvis cellene er ovale, justerer du blobdiameteren slik at den ligner på den mindre aksen.
MERK: Hvis du øker terskelen , unngår du at bakgrunnsstøy fanges opp som signaler uten å påvirke signalintensiteten (tilleggsfigur 1). En økning i terskelverdien kan imidlertid gå glipp av sanne signaler (tilleggsfigur 1). Hvis signalene er sterke, bruk medianfilteret for å redusere salt- og pepperstøyen. - Sett filtrene til å fjerne noen, om ikke alle, av de irrelevante signalene. Filtre X og Y er romlige filtre. Bruk filtre X og Y for å fjerne irrelevante signaler som er fjernt fra de virkelige signalene.
MERK: Når filtre er satt på ett bilde, er det avgjørende å sjekke alle de andre bildene for å sikre at de virkelige signalene ikke fjernes. - Angi maksimal avstand for kobling, maksimal avstand for mellomrom og maksimal avstand. Angi maksimal avstand for kobling og maksimal avstand for mellomrom til 3x–5x blobdiameteren, spesielt når prøvene beveger seg betydelig over tid, for å redusere antall spor. Sett det maksimale rammeavstanden til antall bilder i stakken.
- Eksporter fluorescensintensitetene for interesseområdene (ROI) til en CSV-fil. Hvis du bruker en gammel TrackMate-versjon, velger du Eksporter all spotstatistikk i vinduet Velg en handling. Hvis TrackMate-versjonen er 7.6.1 eller høyere, velger du Flekker i vinduet Visningsalternativer. Eksporter eller lagre som interaktive filer til CSV-filer.
MERK: Begge filene er interaktive med bildevinduet; utheving av en avkastning viser tilsvarende avkastning i bildevinduet. Disse filene inkluderer gjennomsnittlig intensitet (MEAN_INTENSITY eller MEAN_INTENSITY_CH1) av cellene av interesse på tilsvarende tidspunkter (POSITION_T). De samme TRACK_IDs skal representere samme avkastning på forskjellige tidspunkter. Dette er imidlertid ikke alltid sant og må kanskje korrigeres manuelt når det er nødvendig. Hvis Track Mate ikke gjenkjenner avkastningen på noen tidspunkter, vises ikke disse tidspunktene.
- Trekk ut bakgrunnsfluorescensintensiteten, og opprett Background_list.csv filen.
MERK: I denne studien ble bakgrunnsintensiteten for hver z-posisjon estimert ved å bruke gjennomsnittsverdien av tre til fem nærliggende samme størrelse blobs som ikke inneholdt fluorescenssignaler og var fra forskjellige tidspunkter.- Den Background_list.csv filen har et nødvendig format: hver kolonne inneholder informasjonen til en neuron, fra Neuron 0. Fyll ut nevrontallene, for eksempel Neuron 0, i rad 1. Oppgi deretter bakgrunnsintensiteten for hver analyserte z-posisjon - hvis fem z-posisjoner analyseres for Neuron 0, fyll ut fem bakgrunnsintensitetsverdier under Neuron 0.
MERK: Background_list.csv filen kreves for TACI EXTRACT-funksjonen . Hvis bakgrunnen er ubetydelig, må Background_list.csv med nullbakgrunnsintensiteten til hvert nevron gis.
- Den Background_list.csv filen har et nødvendig format: hver kolonne inneholder informasjonen til en neuron, fra Neuron 0. Fyll ut nevrontallene, for eksempel Neuron 0, i rad 1. Oppgi deretter bakgrunnsintensiteten for hver analyserte z-posisjon - hvis fem z-posisjoner analyseres for Neuron 0, fyll ut fem bakgrunnsintensitetsverdier under Neuron 0.
- Bruk EXTRACT-funksjonen til å identifisere maksimal fluorescensintensitet ved hver t-posisjon og beregne ΔF/F0 som vist i ligningen (1).
(1)- Opprett en mappe og navngi den ved hjelp av nevronnummeret, fra Neuron 0. Lagre CSV-filene som inneholder fluorescensinformasjonen til det tilsvarende nevronet i mappen. Hver CSV-fil inneholder informasjon om en z-posisjon, slik at antall CSV-filer tilsvarer antall analyserte z-posisjoner. Gi CSV-filene navnet Mean_Intensity#.csv (# representerer z-posisjonen), og hver CSV-fil inneholder minst to kolonner: POSITION_T og MEAN_INTENSITY eller MEAN_INTENSITY_CH1.
MERK: Opprett en mappe for hver celle av interesse. - Lagre Background_list.csv filen og mappene som ble opprettet i trinn 2.7.1, i én mappe. Velg denne mappen ved å klikke på Bla gjennom filer.
MERK: Antall bakgrunnsverdier i Background_list.csv filen må samsvare med nummeret på Mean_Intensity#.csv-filene for hvert nevron. - Bakgrunnsfilen fylles ut automatisk. Fyll ut det største antallet t-posisjoner for antall T-posisjoner.
- Klikk på Pakk ut for å opprette en resultatmappe, inkludert CSV-filene og plottene for hvert nevron. CSV-filene inneholder informasjon om maksimal fluorescensintensitet og ΔF / F0 ved hver t-posisjon. Plottene er linjediagrammer for ΔF/F0 over t-posisjoner.
MERK: I denne studien ble ΔF/F0 beregnet ved hjelp av ligning (1). Den første verdien av hver z-posisjon ble brukt som F0. Hvis denne F0 ikke er passende20, gir pluginet filer, inkludert rådata for hvert nevron i python_files-mappen.
- Opprett en mappe og navngi den ved hjelp av nevronnummeret, fra Neuron 0. Lagre CSV-filene som inneholder fluorescensinformasjonen til det tilsvarende nevronet i mappen. Hver CSV-fil inneholder informasjon om en z-posisjon, slik at antall CSV-filer tilsvarer antall analyserte z-posisjoner. Gi CSV-filene navnet Mean_Intensity#.csv (# representerer z-posisjonen), og hver CSV-fil inneholder minst to kolonner: POSITION_T og MEAN_INTENSITY eller MEAN_INTENSITY_CH1.
- Bruk MERGE-funksjonen til å beregne gjennomsnittet av hvert nevrons ΔF/F 0, beregne SEM og plotte gjennomsnittlig ΔF/F0 over t-posisjoner.
- Velg resultatmappen som er opprettet av EXTRACT-funksjonen ved å klikke på Bla gjennom filer.
- Fyll inn antall T-posisjoner med det største antallet t-posisjoner.
- Klikk Flett for å opprette en merged_data mappe, inkludert en merged_data.csv fil og et Average_dF_F0.png tegne. CSV-filen inneholder informasjonen om gjennomsnittet og SEM ΔF / F0 ved hver t-posisjon. Plottet er et linjediagram over gjennomsnittlig ΔF / F0 over t-posisjoner.
(1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arbeidsflyt for 3D kalsiumavbildningsanalyse
I denne studien utviklet vi et nytt ImageJ-plugin, TACI, og beskrev en arbeidsflyt for å spore z-drift og analysere 3D-kalsiumavbildning som identifiserer responsene til individuelle celler som vises i flere z-posisjoner (figur 1). Dette verktøyet har fire funksjoner: RENAME, ORGANIZE, EXTRACT og MERGE. For det første, hvis bildenavnene ikke er kompatible med ORGANISATOR-funksjonen, kan RENAME-funksjonen konvertere bildenavnene til ønsket struktur. Deretter gråtoner ORGANISER-funksjonen (om nødvendig) og organiserer TIFF-dataene for 3D-kalsiumavbildning etter z-posisjoner. Bilder fra samme z-posisjon lagres i én mappe. Deretter kan forskjellige bildeanalyseverktøy brukes til å oppdage og spore avkastningen og trekke ut fluorescensintensitetene over tid for hver z-posisjon. En ImageJ plugin, TrackMate, ble brukt til å utføre dette trinnet. TrackMate er en åpen kildekode ImageJ plugin for sporing av enkeltpartikler21. Det har blitt mye brukt til å spore partikler i ulike biologiske studier som involverer levende celleavbildning, inkludert kalsiumavbildning 11,21,22,23. TrackMate sporer på en automatisert måte celler i lateral (x/y) retning, oppdager avkastning og trekker ut signaler fra et live-imaging datasett 4,12. For hver celle av interesse sorterer EXTRACT-funksjonen fluorescensintensitetene fra alle z-posisjonene etter t-posisjoner, identifiserer maksimumsverdiene for hver t-posisjon, trekker fra bakgrunnen og beregner og plotter ΔF/F0. Til slutt beregner og plotter MERGE-funksjonen gjennomsnittet av ΔF/F0 for flere celler.
Kalsiumresponser av fluelarver kjølige nevroner til temperaturendringer
Vi validerte denne metoden ved hjelp av kalsiumendringene som respons på temperatursvingninger i fluelarvervenes kjølige nevroner. En genetisk kodet kalsiumindikator, GCaMP6m 24, ble uttrykt i larvekule nevroner av Ir21a-Gal425. Ved eksponering for ca. 27 °C hadde nevronene lave intracellulære kalsiumnivåer (figur 2A og figur 3). Når temperaturen ble senket til ca. 10 °C og holdt der, økte de intracellulære kalsiumnivåene raskt og vedvarte (figur 2B og figur 3). Kalsiumnivået falt raskt når temperaturen ble økt (figur 3).
Analysere et fluehjerne 3D kalsiumavbildningsdatasett
Vi validerte også denne metoden ved hjelp av et fluehjerne 3D kalsiumavbildningsdatasett11. De avbildede transgene fluene (VT50339-Gal4; UAS-GCaMP6f) uttrykte GCaMP6f i sopplegemet i hjernen11. Data fra 45 z-posisjoner (fordelt på 1,5 μm intervaller) ble samlet inn ved 50 Hz for 225 s (250 tidspunkter), og første halvdel av datasettet (125 tidspunkter) ble analysert. Da opptaket startet, hadde syv nevroner åpenbar fluorescens, og fire av dem ble analysert (figur 4A). Intensiteten i disse nevronene avtok over tid (figur 4B). Når oktanol ble påført (figur 4C), lyste flere nevroner. Fluorescensen av 10 nevroner ble funnet å øke samtidig ved tidspunkt 92 (figur 4D), noe som tyder på at disse soppnevronene reagerer på oktanollukt. Selv om oktanol ble påført i 5 s, ble høy fluorescens i disse nevronene observert på bare ett tidspunkt (0, 9 s) og deretter raskt droppet, noe som tyder på at responsen er fasisk og forbigående.
Separasjon av overlappende celler
Figur 5A presenterer et maksimalt projeksjonsbilde av tre nevroner. Den hvite pilspissen peker på to nevroner som overlappet hverandre i x/y-planet, men som var separate i ortovisningen (blå og oransje pilspisser i figur 5B), noe som indikerer at disse nevronene dukket opp i forskjellige z-posisjoner; den oransje cellen hadde det sterkeste signalet på z7 (figur 5C), mens den blå cellen hadde det sterkeste signalet på z10 (figur 5D). Verktøyet skilte disse to cellene og avslørte den forsinkede, men sterke aktiveringen av den oransje cellen (figur 5E).
Figur 1: Arbeidsflyt ved hjelp av TACI for å analysere 3D-kalsiumavbildning. TACI har fire funksjoner: RENAME, ORGANIZE, EXTRACT og MERGE. For det første, hvis TIFF-navnene ikke er kompatible med ORGANISER-funksjonen , kan RENAME-funksjonen konvertere bildenavnene til ønsket struktur. Deretter gråtoner ORGANISER-funksjonen (om nødvendig) og organiserer TIFF-dataene for 3D-kalsiumavbildning etter z-posisjoner. Bilder fra samme z-posisjon lagres i én mappe. Deretter kan forskjellige bildeanalyseverktøy brukes til å oppdage og spore avkastningen og trekke ut fluorescensintensitetene i hver z-posisjon. For hver celle av interesse sorterer EXTRACT-funksjonen fluorescensintensitetene etter de tilsvarende tidspunktene, identifiserer maksimumsverdiene for hver t-posisjon, trekker fra bakgrunnen og beregner og plotter ΔF / F0. Til slutt beregner og plotter MERGE-funksjonen gjennomsnittet av ΔF/F0 for flere celler. Forkortelser: TACI = TrackMate analyse av kalsiumavbildning; ROI = regioner av interesse; ΔF/F0 = forholdet mellom endring i fluorescens og innledende fluorescensintensitet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kalsiumavbildning av fluelarvers kjølige celler i inaktive og aktive tilstander . (A) Cellene er knapt synlige i inaktiv tilstand. (B) Cellene er sterkt fluorescerende i aktiv tilstand. Ulike fargepilspisser indikerer forskjellige celler. Genotypen er Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. Z5-13: Bilder i z-posisjoner fra 5 til 13. I B er cellen indikert med de hvite pilspissene vist på z5 til z8; Cellene indikert med oransje og blå pilspisser er vist på Z8 til Z13. Skala bar = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kvantifisering av fluorescens som endring i fluorescensintensitet (F) sammenlignet med den opprinnelige intensiteten (F0). Genotypen er Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. n = 7 celler fra tre dyr. Spor = gjennomsnitt ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Analysere et fluehjerne 3D kalsiumavbildningsdatasett. (A) Det maksimale projeksjonsbildet ved tidspunkt 1 (t1). Tallene 0-3 indikerer de fire analyserte nevronene. (B) Fluorescensendringer av nevroner 0-3 i A i løpet av tidspunktene 0 til 125. (C) Det maksimale projeksjonsbildet ved tidspunkt 92 (t92). Tallene 0-9 indikerer de 10 analyserte nevronene. (D) Fluorescensendringer av nevroner 0-9 i C i løpet av tidspunktene 0 til 125. Enten 5 s luft eller 5 s oktanol ble påført, som vist i grått. Skalastang = 10 000 enheter rå fluorescensintensitet. Forkortelse: OCT = oktanol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Separasjon av overlappende celler basert på maksimumsverdien. (A) To nevroner overlapper hverandre (hvit pilspiss) i et maksimalt projeksjonsbilde (m). Genotypen er Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. (B) Disse nevronene er separate i ortovisningen (blå og oransje pilspisser). (C,D) Den oransje cellen vises på z7 (C), mens den blå cellen vises på z10 (D). Skala bar = 10 μm. (E) Fluorescensendringene i de oransje og blå cellene kvantifiseres ved hjelp av maksimumsverdiene fra individuelle z-posisjoner. Forkortelse: ΔF / F0 = forholdet mellom endring i fluorescens og innledende fluorescensintensitet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: To nevroner med svake kalsiumsignaler analyseres ved hjelp av DoG- og LoG-detektorer ved forskjellige terskler. (AC) Det første nevronet (Ir21a-Gal80 26/UAS-GCaMP6;Ir93a-Gal427) analyseres av DoG og LoG ved forskjellige terskler. (A) Terskelen er satt til 0,1. Både DoG og LoG oppdager alle 36 tidspunktene. (B) Terskelen er satt til 0,3. Blant de 36 tidspunktene oppdager DoG 36, og LoG oppdager 35. (C) Terskelen er satt til 1,0. Blant de 36 tidspunktene oppdager DoG 34, og LoG oppdager 15. (VG Nett) Den andre nevronen (UAS-GCaMP6;Ir68a-Gal428) analyseres av DoG og LoG ved forskjellige terskler. (D) Terskelen er satt til 0,1. DoG oppdager alle 36 tidspunkter, og LoG oppdager 34. (E) Terskelen er satt til 0,3. Blant de 36 tidspunktene oppdager DoG 33, og LoG oppdager 18. (F) Terskelen er satt til 1,0. Blant de 36 tidspunktene oppdager DoG 14, og LoG oppdager bare en. Merk at økning av terskelen ikke påvirker intensitetsavlesningen hvis en avkastning gjenkjennes. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 2: Maksimumsverdien er en god representant for en celles intensitet. (A) Z-stacks med forskjellige z-avstander simuleres. (B) Z-stacks med forskjellige z-posisjoner simuleres. (C) Z-stacks er opprettet fra simulerte celler med forskjellige intensiteter. Forkortelser: maks = den maksimale verdien av en z-stabel; ground_truth = produktet av den simulerte cellens volum og dens fylte intensitet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 3: Sammenligning mellom TACI og 3D-ROI metoder. (A) Fluorescensendringer i to celler indikert med oransje og blått kvantifiseres ved hjelp av TACI og en tilpasset programvare skrevet i IGOR Pro. Genotypetypen er R11F02-Gal429; UAS-GCaMP6m. (B) Fluorescensendringer i to celler indikert med oransje og blått kvantifiseres ved hjelp av TACI og IMARIS. Genotypetypen er Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. Forkortelse: ΔF / F0 = forholdet mellom endring i fluorescens og innledende fluorescensintensitet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne studien utviklet et nytt ImageJ-plugin, TACI, og beskrev en arbeidsflyt som analyserte 3D-kalsiumavbildning. Mange tilgjengelige verktøy fokuserer på å korrigere x / y-bevegelsen, selv om bevegelse på z-aksen også må diagnostiseres eksplisitt eller korrigeres6. Under bildeopptak i en levende organisme er bevegelse på z-aksen uunngåelig selv når organismen er immobilisert, og noen stimuli, som temperaturendring, forårsaker ofte betydelig z-drift. Å øke høyden på z-stakkene vil tillate registrering av cellene av interesse under hele bildeprosessen; Det er imidlertid ikke trivielt å analysere bevegelse på z-aksen, spesielt når individuelle celler vises i flere z-posisjoner. Hvis en slik bevegelse ignoreres, vil forskerne ikke oppnå de nøyaktige kalsiumresponsene til disse cellene. TACI korrigerer z-drift ved å trekke ut fluorescenssignalene fra hver z-posisjon. Et kritisk trinn i TACI er å sortere maksimumsverdien ved hvert tidspunkt og bruke den til å representere intensiteten til en celle. Derfor er det nøkkelen til å inkludere alle z-posisjonene til cellene av interesse under avbildningsprosessen. I tillegg anbefaler vi å tillate at en celle vises i fem eller flere z-posisjoner, slik at z-avstandene og z-posisjonene ikke påvirker maksimumsverdien (tilleggsfigur 2A,B). I tillegg tillater TACI separasjon av celler som overlapper i lateral (x / y) retning, men vises i forskjellige z-posisjoner.
Z-drift kan også korrigeres ved å trekke ut fluorescensintensiteter fra 3D ROI 8,11,29. Vi sammenlignet TACI med to 3D-ROI-metoder. Først opprettet Klein et al. en tilpasset programvare skrevet i IGOR Pro som bruker de lyseste 100 pikslene i hver 3D-avkastning for å generere råsignalet29. Denne metoden og TACI ga tilsvarende resultater (tilleggsfigur 3A). For det andre brukte vi IMARIS (versjon 9.8.2), en kommersiell programvare, for å modellere 3D-avkastningen og trekke ut deres gjennomsnittlige intensiteter. Selv om resultatene fra TACI og IMARIS viste lignende trender, var foldeendringene forskjellige (tilleggsfigur 3B). Dette avviket kan skyldes algoritmer. Merk at maksimumsverdien som trekkes ut av TACI er proporsjonal med grunnsannhetsintensiteten (tilleggsfigur 2C).
Selv om denne arbeidsflyten er halvautomatisk og fortsatt krever manuell innsats fra forskere, gir den en beregningsmessig tilnærming for 3D-kalsiumavbildningsanalyse. Det er viktig at denne arbeidsflyten er basert på ImageJ og ikke krever kommersiell programvare eller programmeringskunnskap. Begrensningene og potensielle løsninger for denne arbeidsflyten er som følger. For det første godtar TACI bare TIFF-filer og en bestemt filnavnstruktur: filename_h#t#z#c#.tif (h# og c# er valgfrie). Imidlertid kan andre filformater som er kompatible med ImageJ, enkelt konverteres til TIFF-filer av ImageJ. Videre har pluginet en RENAME-funksjon som konverterer bildenavnene til ønsket struktur slik at den er kompatibel med kalsiumavbildningsdata hentet fra forskjellige systemer.
For det andre er pluginet designet for kalsiumavbildningsdata med konstant bakgrunn. Å trekke den tilsvarende bakgrunnsinformasjonen fra avkastningsintensitetene på hvert tidspunkt er en måte å korrigere svingende bakgrunner på. Verktøyet gir avkastningsintensiteter på hvert tidspunkt i python_files-mappen. Bakgrunnsintensitetene kan representeres av (1) bildenes gjennomsnittlige intensiteter eller (2) de gjennomsnittlige intensitetene til avkastningen uten aktive celler. ImageJ gir metoder for å oppnå bildenes gjennomsnittlige intensiteter (ved å klikke på Image | Stabel | Mål stabel) og gjennomsnittlig intensitet av tilfeldige avkastninger (ved å klikke på Analyser | Verktøy | ROI Manager | Multi mål). Hvis fotobleking skjer under kalsiumavbildning, fungerer Bleach Correction-funksjonen (ved å klikke på Image | Justere | Blekemiddelkorreksjon) kan kjøres før TrackMate.
Til slutt må celleregistrering på tvers av z-posisjoner inkluderes i denne arbeidsflyten hvis du bruker TACI til å analysere et stort antall nevroner samtidig. Følgelig må det utvikles en tilleggsfunksjon som organiserer informasjonen om fluorescensintensiteter i datastrukturen som kreves av MERGE-funksjonen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
En Zeiss LSM 880 i Fralin Imaging Center ble brukt til å samle inn kalsiumavbildningsdata. Vi anerkjenner Dr. Michelle L Olsen og Yuhang Pan for deres hjelp med IMARIS-programvaren. Vi anerkjenner Dr. Lenwood S. Heath for konstruktive kommentarer til manuskriptet og Steven Giavasis for kommentarer til GitHub README-filen. Dette arbeidet ble støttet av NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) og NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) til L.N. Finansiørene hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om publisering eller utarbeiding av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt Fill Needel | BD | 303129 | |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Fly food ingredient |
| Carbon dioxide | Airgas | UN1013 | Size 200 High Pressure Steel Cylinder |
| CO2 bubbler kit | Genesee | 59-180 | |
| Confocal microscope LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2. |
| DAQami software | Measurement Computing | ||
| Dextrose | Genesee | 62-113 | Fly food ingredient |
| Drosophila Agar | Genesee | 66-111 | Fly food ingredient |
| Ethanol | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | Fly food ingredient |
| Fly line: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni lab | ||
| Fly line: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| General purpose forged brass regulator | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| Green Drosophila tubing | Genesee | 59-124 | |
| Heat transfer compound | MG Chemicals | 860-60G | |
| Heatsink | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | Resize to 12.9 x 5.5 cm |
| Illuminator | AmScope | LED-6W | |
| Inactive Dry Yeast | Genesee | 62-108 | Fly food ingredient |
| Incubator | Pervical | DR-41VL | Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH. |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Thermo Scientific | 126965000 | Fly food ingrediete |
| Micro cover glass | VWR | 48382-126 | 22 x 40 mm |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| Nail polish | Kleancolor | ||
| Narrow Drosophila vials | Genesee | 32-113RL | |
| Objective | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| Peltier cooling module | TE Technology | TE-127-1.0-0.8 | 30 x 30 mm |
| Plugs | Genesee | 49-102 | |
| Power Supply | Circuit Specialists | CSI1802X | 10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply |
| Princeton Artist Brush Nepture | Princeton Artist Brush Co. | Series 4750, size 2 | |
| Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate | Thermo Scientific | 033241-36 | Fly food ingredient |
| Stage insert | Wienecke and Sinske | 432339-9030-000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | Any stereo microscope works |
| T-Fitting | Genesee | 59-123 | |
| Thermocouple data acquisition device | Measurement Computing | USB-2001-TC | Single channel |
| Thermocouple microprobe | Physitemp | IT-24P | |
| Yellow Cornmeal | Genesee | 62-101 | Fly food ingredient |
| Z-axis piezo stage | Wienecke and Sinske | 432339-9000-000 |
References
- Grienberger, C., Konnerth, A.
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Zhang, Y., et al. jGCaMP8 fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
- Robbins, M., Christensen, C. N., Kaminski, C. F., Zlatic, M. Calcium imaging analysis - How far have we come. F1000Research. 10, 258 (2021).
- Oh, J., Lee, C., Kaang, B. K. Imaging and analysis of genetically encoded calcium indicators linking neural circuits and behaviors. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 23 (4), 237-249 (2019).
- Stringer, C., Pachitariu, M. Computational processing of neural recordings from calcium imaging data. Current Opinion in Neurobiology. 55, 22-31 (2019).
- Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
- Nguyen, J. P., Linder, A. N., Plummer, G. S., Shaevitz, J. W., Leifer, A. M. Automatically tracking neurons in a moving and deforming brain. PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005517 (2017).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. EMC2: A versatile algorithm for robust tracking of calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. bioRxiv. , (2021).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
- Delestro, F., et al. In vivo large-scale analysis of Drosophila neuronal calcium traces by automated tracking of single somata. Scientific Reports. 10, 7153 (2020).
- Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).
- Eglen, S. J., et al. Toward standard practices for sharing computer code and programs in neuroscience. Nature Neuroscience. 20 (6), 770-773 (2017).
- Pachitariu, M., et al. Suite2p: Beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy. bioRxiv. , (2017).
- Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. Tracking calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. PLoS Computational Biology. 17 (10), 1009432 (2021).
- Kolar, K., Dondorp, D., Zwiggelaar, J. C., Høyer, J., Chatzigeorgiou, M. Mesmerize is a dynamically adaptable user-friendly analysis platform for 2D and 3D calcium imaging data. Nature Communications. 12, 6569 (2021).
- Moein, M., et al. CaSiAn: A Calcium Signaling Analyzer tool. Bioinformatics. 34 (17), 3052-3054 (2018).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
- Neugornet, A., O'Donovan, B., Ortinski, P. I. Comparative effects of event detection methods on the analysis and interpretation of Ca(2+) imaging data. Frontiers in Neuroscience. 15, 620869 (2021).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Fazeli, E., et al. Automated cell tracking using StarDist and TrackMate. F1000Research. 9, 1279 (2020).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Ni, L., et al. The ionotropic receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
- Omelchenko, A. A., et al. Cool and warm ionotropic receptors control multiple thermotaxes in Drosophila larvae. Frontiers in Molecular Neuroscience. , (2022).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nature Communications. 9 (1), 4252 (2018).
- Hernandez-Nunez, L., et al. Synchronous and opponent thermosensors use flexible cross-inhibition to orchestrate thermal homeostasis. Science Advances. 7 (35), (2021).
- Klein, M., et al. Sensory determinants of behavioral dynamics in Drosophila thermotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (2), 220-229 (2015).
