Summary
TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) הוא תוסף קוד פתוח ImageJ לניתוח הדמיית סידן תלת-ממדית הבוחן תנועה על ציר z ומזהה את הערך המרבי של כל ערימת z כדי לייצג את עוצמת התא בנקודת הזמן המתאימה. הוא יכול להפריד תאי עצב החופפים בכיוון הצידי (x/y) אך במישורי z שונים.
Abstract
המחקר במדעי המוח התפתח לשימוש בכלים מורכבים של הדמיה וחישוב כדי לחלץ מידע מקיף ממערכי נתונים. הדמיית סידן היא טכניקה נפוצה הדורשת תוכנה מתוחכמת כדי להשיג תוצאות אמינות, אך מעבדות רבות מתקשות לאמץ שיטות חישוביות בעת עדכון פרוטוקולים כדי לעמוד בתקנים מודרניים. קשיים מתעוררים עקב חוסר ידע בתכנות וחומות תשלום עבור תוכנה. בנוסף, תאים מעניינים מציגים תנועות לכל הכיוונים במהלך הדמיית סידן. גישות רבות פותחו כדי לתקן את התנועה בכיוון הצידי (x/y).
מאמר זה מתאר זרימת עבודה באמצעות תוסף ImageJ חדש, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), כדי לבחון תנועה על ציר z בדימות סידן תלת-ממדי. תוכנה זו מזהה את ערך הפלואורסצנטיות המרבי מכל מיקומי z שבהם תא עצב מופיע ומשתמשת בו כדי לייצג את עוצמת תא העצב במיקום t המתאים. לכן, הכלי הזה יכול להפריד תאי עצב החופפים בכיוון הצידי (x/y) אך מופיעים במישורי z נפרדים. כתוסף ImageJ, TACI הוא כלי חישובי ידידותי למשתמש בקוד פתוח לניתוח הדמיית סידן תלת-ממדית. תיקפנו את זרימת העבודה הזו באמצעות תאי עצב רגישים לחום של זחלי זבובים שהציגו תנועות לכל הכיוונים במהלך תנודות טמפרטורה ומערך נתונים תלת-ממדי של דימות סידן שנרכש ממוח הזבוב.
Introduction
רמת הסידן התוך-תאי היא סמן מדויק של עוררות עצבית. הדמיית סידן מודדת את השינויים בסידן התוך-תאי כדי להבין את הפעילות העצבית1. מחקרים במדעי המוח השתמשו יותר ויותר בשיטה זו בשל פיתוח טכניקות למדידת ריכוז סידן תוך תאי, כולל אינדיקטורים סידן מקודדים גנטית (GECIs), כגון GCaMP2,3, אשר יכול לבוא לידי ביטוי לא פולשני בקבוצות ספציפיות של נוירונים באמצעות גישות גנטיות. העלויות הנמוכות יותר של לייזרים ורכיבי מיקרוסקופ הגדילו גם את השימוש בדימות סידן4. חשוב לציין, דימות סידן מאפשר להקליט ולחקור נוירונים בודדים, כמו גם אוכלוסיות נוירונים גדולות בו זמנית בבעלי חיים הנעים בחופשיות5.
אף על פי כן, הניתוח של נתוני דימות סידן הוא מאתגר מכיוון ש-(1) הוא כרוך במעקב אחר השינויים בפלואורסצנטיות של תאים בודדים לאורך זמן, (2) האות הפלואורסצנטי נעלם לסירוגין או מופיע שוב עם תגובות עצביות, ו-(3) הנוירונים עשויים לנוע לכל הכיוונים, במיוחד פנימה והחוצה ממישור מוקד או להופיע במספר מישורים4, 6. ניתוח ידני גוזל זמן והופך ללא מעשי ככל שאורך ההקלטות ומספר תאי העצב גדל. תוכנות שונות פותחו כדי להאיץ את תהליך ניתוח הדמיית הסידן. בעבר, התוכנה תוכננה בהקשר ניסיוני מוגבל, מה שהקשה על מעבדות אחרות לאמץ אותה. מאמצים אחרונים לעמוד בסטנדרטים מודרניים לשיתוף תוכנה הובילו לפיתוח מספר כלים שיכולים לנתח באופן עקבי נתוני דימות סידן בקבוצות שונות 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . עם זאת, רוב הכלים הללו דורשים ידע בתכנות ו/או תלויים בתוכנות מסחריות. מחסור בידע בתכנות וחומות תשלום בתוכנה מרתיעות חוקרים מלאמץ שיטות אלה. יתר על כן, רבים מהכלים הללו מתמקדים בתיקון תנועת x/y, אם כי גם תנועה על ציר z צריכה להיות מאובחנת ומתוקנת במפורש6. יש צורך בכלי חישובי לניתוח דימות סידן תלת-ממדי המתמקד בתאי עצב המציגים סחף Z ומופיעים במספר מישורי z. באופן אידיאלי, כלי זה צריך להשתמש בתוכנת קוד פתוח ולא לדרוש ידע בתכנות כדי לאפשר למעבדות אחרות לאמץ אותו בקלות.
כאן, פיתחנו תוסף ImageJ חדש, TACI, לניתוח נתוני הדמיה תלת ממדית של סידן. ראשית, התוכנה משנה את שמה, במידת הצורך, ומארגנת את נתוני הדמיית הסידן התלת-ממדית לפי מיקומי z. התאים המעניינים נמצאים במעקב בכל מיקום z, ועוצמות הפלואורסצנטיות שלהם מופקות על ידי TrackMate או כלים חישוביים אחרים. לאחר מכן מופעל TACI כדי לבחון את התנועה על ציר z. הוא מזהה את הערך המרבי של ערימת z ומשתמש בו כדי לייצג את עוצמת התא בנקודת הזמן המתאימה. תהליך עבודה זה מתאים לניתוח דימות סידן תלת-ממדי עם תנועה לכל הכיוונים ו/או עם תאי עצב החופפים בכיוון הצידי (x/y) אך מופיעים במיקומי z שונים. כדי לאמת את זרימת העבודה הזו, נעשה שימוש במערכי נתונים תלת-ממדיים של דימות סידן מתאי עצב רגישים לחום של זחלי זבובים ונוירונים של פטריות במוח. שימו לב, TACI הוא תוסף קוד פתוח ImageJ ואינו דורש ידע בתכנות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הדמיית סידן
- הכנת זחלי זבובים
הערה: זבובים וזחלים נשמרים ב 25 °C (75 °F) תחת 12 שעות: 12 שעות אור: מחזור כהה.- מרדימים את הזבובים עם CO2. מיין 20-45 זכרים ו 20-45 נקבות לתוך כל בקבוקון זבוב, ולתת להם לפחות 24 שעות עד 48 שעות כדי להתאושש מהחשיפה CO2 .
הערה: חשיפה לזבובים ל-CO2 אמורה להימשך פרק הזמן הקצר ביותר האפשרי. - כדי לסנכרן את גיל הזחלים, טפחו על הזבובים לבקבוקונים חדשים המכילים גרגרי שמרים, ואפשרו להם 4-8 שעות להטיל ביצים. הסר את הזבובים על ידי הפיכתם לבקבוקונים חדשים.
- לאסוף את הזחלים ב 72 שעות באמצעות 10 מ"ל של 20% w/v תמיסת סוכרוז.
- מרדימים את הזבובים עם CO2. מיין 20-45 זכרים ו 20-45 נקבות לתוך כל בקבוקון זבוב, ולתת להם לפחות 24 שעות עד 48 שעות כדי להתאושש מהחשיפה CO2 .
- הגדרת מיקרוסקופ ובקרת טמפרטורה
- בצע את ההדמיה במיקרוסקופ קונפוקלי (ראה טבלת חומרים) ובשלב piezo ציר z עם תוספת במה באמצעות ההגדרות הבאות: לייזר, ארגון; מצב סריקה, מסגרת; גודל מסגרת, 512 x 512; מהירות, מקסימום; ערוצים/עומק סיביות, 1/8 סיביות; זום, 1.5; z-stack, פרוסה = 15, שמור = פרוסה; מכשירי מיקוד ואסטרטגיה, מיקוד מוגדר; מיקוד, דגש מובהק על.
- חבר מודול קירור פלטייה למפזר חום על ידי תרכובת העברת החום כדי לבנות מצנן תרמואלקטרי. הפלטייה מופעל על ידי ספק כוח 2 A.
- חבר מיקרו-גשושית תרמית למכשיר לרכישת נתונים כדי להקליט את הטמפרטורה.
- הדמיית סידן
- שטפו את הזחלים 3x במי מלח חוצצים פוספט (PBS).
- פיפטה 75 μL של 1x PBS על מרכז מגלשת זכוכית.
- שים זחל אחד או שניים ב 1x PBS ומניחים את microprobe thermocouple ליד הזחלים.
הערה: המרחק בין הזחלים לבין microprobe צריך להיות ~ 5 מ"מ. הזחלים עשויים לנוע אם המיקרו-גשושית ממוקמת קרוב מדי אליהם. מרחק גדול עלול לגרום לקריאות טמפרטורה לא מדויקות. - כסו את הזחלים ואת המיקרו-פרוב התרמו-זוגי בכיסוי זכוכית. יש לאטום את הכיסוי בלק.
- הניחו את השקופית על במת המיקרוסקופ, מצאו את הפוקוס באמצעות מטרה של 25x, והניחו את הצידנית התרמואלקטרית על השקופית.
הערה: הפלטייה ממוקמת ישירות על המגלשה שבה הזחלים אמורים לספק את גירויי הטמפרטורה. - בתוכנות קונפוקליות, התמקדו בתאים הפלואורסצנטיים המעניינים. התאם את עוצמת הלייזר כדי למנוע רוויית יתר. קבעו את מיקום הפרוסה הראשונה והאחרונה בקביעת z-stack.
הערה: השתמש בעוצמת הלייזר הנמוכה ביותר האפשרית לפני ההקלטה כדי למנוע הלבנה. - התחל את סריקת z-stack והקלטת הטמפרטורה בו-זמנית.
- שלוט בספק הכוח המניע את Peltier לשנות את טמפרטורת פני השטח של Peltier. הפעל את ספק הכוח כדי להקטין את הטמפרטורה וכבה אותו כדי להעלות את הטמפרטורה.
- עצור את סריקת z-stack ואת רישום הטמפרטורה.
2. ניתוח נתוני הדמיה תלת ממדית של סידן
- יצא את נתוני דימות הסידן לקובצי TIFF ושמור אותם בתיקייה בעלת שם זהה לשם הבסיס של קובצי TIFF שבתוכו.
הערה: שם הקובץ אינו יכול להכיל פסיקים.- השתמש בפרמטרים הבאים כדי לייצא את נתוני הדמיית הסידן מ-ZEN (מהדורה שחורה): סוג קובץ, TIFF; דחיסה, LZW; ערוצים, 2; מיקום Z, כל; זמן, הכל; שלב, 1; אזור, מלא.
- התקנה
- הורד את TACI-Calcium_Imaging.jar מ- Github (https://github.com/niflylab/TACI_CalciumImagingPlugin/releases).
- התקן את התוסף בפיג'י על ידי לחיצה על תוספים בשורת התפריטים ולאחר מכן לחיצה על התקן בתפריט הנפתח (תוספים | התקן). לאחר מכן, הפעל מחדש את FIJI.
הערה: אל תשתמש בתוספים | התקן תוסף. - הפעל את התוסף על ידי לחיצה על תוספים ולאחר מכן בחירה ב- TACI-Calcium Imaging (תוספים | TACI-Calcium Imaging).
- השתמש בפונקציה RENAME כדי להמיר את שמות הקבצים של TIFF למבנה הנדרש.
הערה: הכלי משתמש ב- filename_h#t#z#c#.tif כמבנה ברירת המחדל (h# ו- c# הם אופציונליים; #: מספר שלם חיובי). אם שמות קובצי התמונות אינם במבנה ברירת המחדל, יש להפעיל את הפונקציה RENAME .- בחר את התיקייה שבה יש לשנות את שמן של תמונות TIFF על-ידי לחיצה על עיון בתיקיות.
- מלא את פרטי הפרמטר. חמישה פרמטרים מפורטים, כולל שם קובץ, פאזה, מיקום T מקסימלי, מיקום Z מרבי וערוץ. לכל פרמטר יש שלושה ערכים: טקסט קודם, ערך פרמטר וסדר.
הערה: המידע תלוי רישיות. אם שמות הקבצים של התמונות כוללים צירוף מילים לפני פרמטר, מלא את צירוף המילים כטקסט הקודם של הפרמטר המתאים. אם שמות הקבצים של התמונות מכילים ביטוי אחרי כל הפרמטרים, מלא את צירוף המילים כטקסט הפרסום.- הקפד להזין Filename, Max T-Position ו- Max Z-Position ושערכי הפרמטרים של Max T-Position ו- Max Z-Position כוללים את כל הספרות.
- המתן עד ששם הקובץ ימולא באופן אוטומטי באמצעות שם התיקיה.
- אם שמות הקבצים של TIFF אינם כוללים את הפאזה והערוץ, השאר את ערך הפרמטר המתאים ריק ובחר Na לפי הסדר.
- לחץ על שנה שם כדי ליצור תיקיה באותו שם ובאותו _r. שים לב שבתיקייה, שמות הקבצים של TIFF נבנו מחדש כך שיהיו תואמים לפונקציה ORGAN .
הערה: _r נוסף לשמות הקבצים של תמונות TIFF.
- השתמש בפונקציה ORGANIZE כדי לשמור את תמונות TIFF מאותו מיקום z בתיקייה אחת.
הערה: שם התיקיה חייב להיות זהה לשם הבסיס של קבצי TIFF שבתוכו ואסור שיכלול פסיקים.- בחר את התיקיה שבה יש לארגן את תמונות TIFF על-ידי לחיצה על עיון בתיקיות.
- אם קובץ CSV של הפרמטר (param.csv) קיים, המתן עד שערכי הפרמטרים ימולאו אוטומטית.
הערה: לקובץ param.csv יש תבנית נדרשת. יש למלא את הפרמטרים, כולל שם קובץ, שלב, position_t, position_z, ערוץ ו- is_gray, בשורה 1 משמאל לימין החל מעמודה A. יש למלא את הערכים המתאימים עבור כל פרמטר בשורה 2. - אם קובץ ה- CSV של הפרמטר (param.csv) אינו קיים, מלא ידנית את ערכי הפרמטרים. ודא שערכי הפרמטרים של Phase ו- Channel כוללים אותיות, בעוד שערכי הפרמטרים של T Position ו- Z Position צריכים להיות המספרים הגדולים ביותר של מיקומי t ו- z. אם שמות הקבצים של התמונות אינם כוללים את הפאזה או הערוץ, הזינו Na.
- צרו תמונות TIFF בגווני אפור בעת הצורך. השאר את התיבה האם תמונות אפורות? לא מסומנות בגווני אפור של התמונות.
- לחץ על ארגן כדי ליצור תיקיה בעלת שם _gray_stacks זהים וכדי ליצור תיקיות באותו שם ו- _# (#: z-positions) בתיקיה. שים לב שקבצי TIFF ממוינים לתיקיות מתאימות לפי מיקומי z וכי נוצר קובץ בשם param.csv, שבו ניתן למצוא את הפרמטרים ואת ערכיהם.
- השתמש ב- TrackMate ב- FIJI כדי לחלץ את עוצמות הפלואורסצנטיות של התאים המעניינים מכל מיקום z.
הערה: שלב זה יכול להתבצע גם על-ידי תוכנות הדמיה אחרות.- פתח את תמונות TIFF בתיקייה z-position של FIJI.
- הפעל את TrackMate על ידי לחיצה על תוספים | מעקב | TrackMate, והתאם את הפרמטרים הבאים במידת הצורך.
- השתמש בגלאי DoG או LoG.
- שנה את קוטר הכתמים, הסף והמסנן החציוני. התאם את קוטר הכתמים כך שיהיה דומה לקוטר התאים. אם התאים סגלגלים, התאימו את קוטר הכתמים כך שיהיה דומה לציר המינורי.
הערה: הגדלת הסף מסייעת למנוע מרעשי רקע להיקלט כאותות מבלי להשפיע על עוצמות האות (איור משלים 1). עם זאת, עלייה בסף עלולה להחמיץ איתותים אמיתיים (תרשים משלים 1). אם האותות חזקים, השתמש במסנן החציוני כדי להפחית את רעש המלח והפלפל. - הגדר את המסננים כדי להסיר חלק מהאותות הלא רלוונטיים, אם לא את כולם. מסננים X ו- Y הם מסננים מרחביים. השתמש במסננים X ו- Y כדי להסיר את האותות הלא רלוונטיים הרחוקים מהאותות האמיתיים.
הערה: כאשר מסננים מוגדרים על תמונה אחת, חיוני לבדוק את כל התמונות האחרות כדי להבטיח שהאותות האמיתיים לא יוסרו. - הגדר את המרחק המרבי המקשר, המרחק המרבי לסגירת הפער ומרווח המסגרת המרבי לסגירת הפער. הגדר את המרחק המרבי המקשר ואת המרחק המרבי לסגירת פער להיות פי 3-5 מקוטר הכתם, במיוחד כאשר הדגימות נעות באופן משמעותי לאורך זמן, כדי לסייע בהפחתת מספר המסלולים. קבעו את מרווח המסגרות המרבי לסגירת רווח למספר התמונות בערימה.
- יצא את עוצמות הפלואורסצנטיות של אזורי העניין (ROI) לקובץ CSV. אם נעשה שימוש בגרסת TrackMate ישנה, בחרו ' יצא את כל סטטיסטיקות הספוט ' בחלון 'בחר פעולה '. אם גרסת TrackMate היא 7.6.1 ומעלה, בחרו ב'ספוטים' בחלון אפשרויות תצוגה . יצא או שמור כקבצים אינטראקטיביים בקובצי CSV.
הערה: שני הקבצים אינטראקטיביים עם חלון התמונה; הדגשת החזר השקעה מציגה את החזר ההשקעה המתאים בחלון התמונה. קבצים אלה כוללים את העוצמות הממוצעות (MEAN_INTENSITY או MEAN_INTENSITY_CH1) של התאים המעניינים בנקודות הזמן המתאימות (POSITION_T). אותו TRACK_IDs אמור לייצג את אותם ROI בנקודות זמן שונות. עם זאת, זה לא תמיד נכון וייתכן שיהיה צורך לתקן באופן ידני, בעת הצורך. אם TrackMate אינו מזהה את החזר ההשקעה בנקודות זמן מסוימות, נקודות זמן אלה אינן מוצגות.
- חלץ את עוצמת הפלואורסצנטיות ברקע וצור את קובץ Background_list.csv.
הערה: במחקר זה, עוצמת הרקע עבור כל מיקום z הוערכה באמצעות הערך הממוצע של שלושה עד חמישה כתמים שכנים באותו גודל שלא הכילו אותות פלואורסצנטיים והיו מנקודות זמן שונות.- לקובץ Background_list.csv יש תבנית נדרשת: כל עמודה מכילה את המידע של תא עצב אחד, החל מנוירון 0. מלא את מספרי תאי העצב, כגון נוירון 0, בשורה 1. לאחר מכן, ספק את עוצמת הרקע עבור כל מיקום z שנותח - אם מנותחים חמישה מיקומי z עבור נוירון 0, מלא חמישה ערכי עוצמת רקע מתחת לנוירון 0.
הערה: קובץ Background_list.csv נדרש עבור הפונקציה TACI EXTRACT . אם הרקע זניח, יש לספק את Background_list.csv עם עוצמת הרקע האפסית של כל נוירון.
- לקובץ Background_list.csv יש תבנית נדרשת: כל עמודה מכילה את המידע של תא עצב אחד, החל מנוירון 0. מלא את מספרי תאי העצב, כגון נוירון 0, בשורה 1. לאחר מכן, ספק את עוצמת הרקע עבור כל מיקום z שנותח - אם מנותחים חמישה מיקומי z עבור נוירון 0, מלא חמישה ערכי עוצמת רקע מתחת לנוירון 0.
- השתמש בפונקציה EXTRACT כדי לזהות את העוצמות הפלואורסצנטיות המרביות בכל מיקום t ולחשב ΔF/F0 כפי שמוצג במשוואה (1).
(1)- צור תיקייה ותן לה שם באמצעות מספר תא העצב, החל מנוירון 0. שמור את קובצי ה- CSV המכילים את המידע הפלואורסצנטי של תא העצב המתאים בתיקיה. כל קובץ CSV מכיל את המידע של מיקום z אחד, כך שמספר קבצי CSV שווה למספר מיקומי z שנותחו. תן לקובצי ה- CSV את השם Mean_Intensity#.csv (# מייצג את מיקום z) וכל קובץ CSV כולל לפחות שתי עמודות: POSITION_T ו- MEAN_INTENSITY או MEAN_INTENSITY_CH1.
הערה: צור תיקיה עבור כל תא מעניין. - שמור את Background_list.csv הקבצים והתיקיות שנוצרו בשלב 2.7.1 בתיקיה אחת. בחר תיקיה זו על ידי לחיצה על עיון בקבצים.
הערה: מספר ערכי הרקע בקובץ Background_list.csv חייב להתאים למספר קבצי Mean_Intensity#.csv עבור כל תא עצב. - קובץ הרקע מתמלא באופן אוטומטי. מלא את המספר הגדול ביותר של עמדות t עבור מספר עמדות T.
- לחץ על Extract כדי ליצור תיקיית תוצאות, כולל קובצי CSV ותרשימים לכל תא עצב. קובצי CSV כוללים מידע על עוצמת הפלואורסצנטיות המרבית ועל ΔF/F0 בכל מיקום t. התרשימים הם תרשימי קו של ΔF/F0 מעל מיקומי t.
הערה: במחקר זה, ΔF/F0 חושב באמצעות משוואה (1). הערך הראשון של כל מיקום z שימש כ-F0. אם F0 זה אינו מתאים20, התוסף מספק קבצים הכוללים נתונים גולמיים עבור כל נוירון בתיקיית python_files.
- צור תיקייה ותן לה שם באמצעות מספר תא העצב, החל מנוירון 0. שמור את קובצי ה- CSV המכילים את המידע הפלואורסצנטי של תא העצב המתאים בתיקיה. כל קובץ CSV מכיל את המידע של מיקום z אחד, כך שמספר קבצי CSV שווה למספר מיקומי z שנותחו. תן לקובצי ה- CSV את השם Mean_Intensity#.csv (# מייצג את מיקום z) וכל קובץ CSV כולל לפחות שתי עמודות: POSITION_T ו- MEAN_INTENSITY או MEAN_INTENSITY_CH1.
- השתמש בפונקציית MERGE כדי לחשב ממוצע ΔF/F 0 של כל נוירון, לחשב את ה- SEM ולשרטט את הממוצע ΔF/F0 על מיקומי t.
- בחר את תיקיית התוצאות שנוצרה על ידי הפונקציה EXTRACT על ידי לחיצה על עיון בקבצים.
- מלא את מספר עמדות T עם המספר הגדול ביותר של עמדות t.
- לחץ על מזג כדי ליצור תיקיית merged_data, כולל קובץ merged_data.csv והתוויית Average_dF_F0.png. קובץ ה- CSV כולל את המידע על הממוצע ו- SEM ΔF/F0 בכל מיקום t. העלילה היא תרשים קו של ממוצע ΔF/F0 מעל מיקומי t.
(1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זרימת עבודה של ניתוח הדמיית סידן תלת-ממדית
במחקר הזה פיתחנו תוסף חדש של ImageJ, TACI, ותיארנו זרימת עבודה למעקב אחר z-drift ולניתוח הדמיית סידן תלת-ממדית שמאתרת את התגובות של תאים בודדים המופיעים במיקומי z מרובים (איור 1). כלי זה כולל ארבע פונקציות: שינוי שם, ארגון, חילוץ ומיזוג. ראשית, אם שמות התמונות אינם תואמים לפונקציה ORGAN, הפונקציה RENAME יכולה להמיר את שמות התמונות למבנה הנדרש. לאחר מכן, הפונקציה ORGANIZE יוצרת גווני אפור (במידת הצורך) ומארגנת את נתוני TIFF של הדמיה תלת-ממדית של סידן לפי מיקומי z. תמונות מאותו מיקום z נשמרות בתיקייה אחת. לאחר מכן, ניתן להשתמש בכלי ניתוח הדמיה שונים כדי לזהות ולעקוב אחר החזר ההשקעה ולחלץ את עוצמות הפלואורסצנטיות שלהם לאורך זמן עבור כל מיקום z. תוסף ImageJ, TrackMate, שימש לביצוע שלב זה. TrackMate הוא תוסף קוד פתוח ImageJ למעקב אחר חלקיקים בודדים21. נעשה בו שימוש נרחב למעקב אחר חלקיקים במחקרים ביולוגיים שונים הכוללים דימות תאים חיים, כולל הדמיית סידן 11,21,22,23. TrackMate, באופן אוטומטי, עוקב אחר תאים בכיוון הצידי (x/y), מזהה ROI ומחלץ אותות ממערך נתונים של הדמיה חיה 4,12. עבור כל תא מעניין, הפונקציה EXTRACT ממיינת את העוצמות הפלואורסצנטיות מכל מיקומי z לפי מיקומי t, מזהה את הערכים המרביים של כל מיקום t, מחסירה את הרקע, מחשבת ומתווה ΔF/F0. לבסוף, הפונקציה MERGE מחשבת ומתווה את הממוצע של ΔF/F0 של תאים מרובים.
תגובות סידן של זחלי זבובים מקררות נוירונים לשינויי טמפרטורה
תיקפנו את השיטה הזו באמצעות שינויי הסידן בתגובה לתנודות טמפרטורה בתאי עצב קרים של זחלי זבובים. אינדיקטור סידן מקודד גנטית, GCaMP6m 24, התבטא בנוירונים קרירים של הזחלים על ידי Ir21a-Gal425. כאשר הם נחשפו לכ-27°C, לתאי העצב היו רמות סידן תוך-תאיות נמוכות (איור 2A ואיור 3). כאשר הטמפרטורה ירדה לכ-10 מעלות צלזיוס והוחזקה שם, רמות הסידן התוך-תאי עלו במהירות ונמשכו (איור 2B ואיור 3). רמות הסידן ירדו במהירות כאשר הטמפרטורה עלתה (איור 3).
ניתוח מערך נתונים של הדמיית סידן תלת-ממדית של מוח זבוב
כמו כן, תיקפנו שיטה זו באמצעות מערך נתונים של הדמיית סידן תלת-ממדית של מוח זבוב11. הזבובים הטרנסגניים המצולמים (VT50339-Gal4; UAS-GCaMP6f) ביטא GCaMP6f בגוף הפטרייה במוח11. נתונים מ-45 מיקומי z (במרווחים של 1.5 מיקרומטר) נאספו ב-50 הרץ במשך 225 שניות (250 נקודות זמן), והמחצית הראשונה של מערך הנתונים (125 נקודות זמן) נותחה. כשההקלטה החלה, לשבעה תאי עצב הייתה פלואורסצנטיות ברורה, וארבעה מהם נותחו (איור 4A). העוצמות בתאי העצב האלה פחתו עם הזמן (איור 4B). כאשר אוקטאנול הוחל (איור 4C), תאי עצב מרובים התבהרו. נמצא שהפלואורסצנטיות של 10 תאי עצב גדלה בו זמנית בנקודת זמן 92 (איור 4D), מה שמרמז על כך שתאי העצב האלה של הפטריות מגיבים לריח אוקטאנול. למרות שאוקטאנול הוחל במשך 5 שניות, פלואורסצנטיות גבוהה בנוירונים אלה נצפתה רק בנקודת זמן אחת (0.9 שניות) ואז ירדה במהירות, מה שמרמז על כך שהתגובה היא פאסית וחולפת.
הפרדת תאים חופפים
איור 5A מציג תמונת הקרנה מקסימלית של שלושה תאי עצב. ראש החץ הלבן מצביע על שני תאי עצב שחפפו במישור x/y אך היו נפרדים במבט אורתודוקסי (ראשי חץ כחולים וכתומים באיור 5B), מה שמצביע על כך שתאי עצב אלה הופיעו במיקומי z שונים; לתא הכתום היה האות החזק ביותר ב-Z7 (איור 5C), בעוד שלתא הכחול היה את האות החזק ביותר ב-Z10 (איור 5D). הכלי הבחין בין שני התאים האלה וחשף את ההפעלה המאוחרת אך החזקה של התא הכתום (איור 5E).
איור 1: זרימת עבודה באמצעות TACI לניתוח הדמיית סידן תלת-ממדית. ל- TACI ארבע פונקציות: שינוי שם, ארגון, חילוץ ומיזוג. ראשית, אם שמות TIFF אינם תואמים לפונקציה ORGAN, הפונקציה RENAME יכולה להמיר את שמות התמונות למבנה הנדרש. לאחר מכן, הפונקציה ORGANIZE יוצרת גווני אפור (במידת הצורך) ומארגנת את נתוני TIFF של הדמיה תלת-ממדית של סידן לפי מיקומי z. תמונות מאותו מיקום z נשמרות בתיקייה אחת. לאחר מכן, ניתן להשתמש בכלי ניתוח הדמיה שונים כדי לזהות ולעקוב אחר החזר ההשקעה ולחלץ את עוצמות הפלואורסצנטיות שלהם בכל מיקום z. עבור כל תא מעניין, הפונקציה EXTRACT ממיינת את העוצמות הפלואורסצנטיות לפי נקודות הזמן המתאימות, מזהה את הערכים המרביים של כל מיקום t, מחסירה את הרקע, מחשבת ומתווה ΔF/F0. לבסוף, הפונקציה MERGE מחשבת ומתווה את הממוצע של ΔF/F0 של תאים מרובים. קיצורים: TACI = ניתוח TrackMate של הדמיית סידן; ROI = אזורי עניין; ΔF/F0 = היחס בין השינוי בפלואורסצנטיות לעוצמת הפלואורסצנטיות הראשונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הדמיית סידן של זחלי זבובים מקררים תאים במצבים לא פעילים ופעילים . (A) התאים בקושי נראים במצב הלא פעיל. (B) התאים הם פלואורסצנטיים חזקים במצב פעיל. ראשי חץ בצבעים שונים מציינים תאים שונים. הגנוטיפ הוא Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. Z5-13: תמונות בעמדות Z מ-5 עד 13. ב-B, התא המסומן על-ידי ראשי החצים הלבנים מוצג ב-z5 עד z8; התאים המסומנים על-ידי ראשי חץ כתומים וכחולים מוצגים ב-Z8 עד Z13. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: כימות הפלואורסצנטיות כשינוי בעוצמת הפלואורסצנטיות (F) בהשוואה לעוצמה הראשונית (F0). הגנוטיפ הוא Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. n = 7 תאים משלושה בעלי חיים. עקבות = ממוצע ± SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניתוח מערך נתונים של הדמיית סידן תלת-ממדית במוח זבוב. (A) תמונת ההקרנה המרבית בנקודת זמן 1 (t1). המספרים 0-3 מציינים את ארבעת תאי העצב שנותחו. (B) שינויים פלואורסצנטיים של תאי עצב 0-3 ב-A בנקודות זמן 0 עד 125. (C) תמונת ההקרנה המרבית בנקודת זמן 92 (t92). המספרים 0-9 מציינים את 10 תאי העצב שנותחו. (D) שינויים פלואורסצנטיים של תאי עצב 0-9 ב-C בנקודות זמן 0 עד 125. 5 שניות אוויר או 5 שניות אוקטאנול יושמו, כפי שמוצג באפור. סרגל קנה מידה = 10,000 יחידות של עוצמת פלואורסצנטיות גולמית. קיצור: OCT = אוקטאנול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הפרדת תאים חופפים בהתבסס על הערך המרבי. (A) שני תאי עצב חופפים (ראש חץ לבן) בתמונת הקרנה מקסימלית (m). הגנוטיפ הוא Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. (B) תאי העצב האלה נפרדים במבט אורתודוקסי (ראשי חץ כחולים וכתומים). (ג,ד) התא הכתום מופיע ב- z7 (C), ואילו התא הכחול מופיע ב- z10 (D). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (E) השינויים הפלואורסצנטיים של התאים הכתומים והכחולים מכומתים באמצעות הערכים המרביים ממיקומי z בודדים. קיצור: ΔF/F0 = היחס בין השינוי בפלואורסצנטיות לעוצמת הפלואורסצנטיות הראשונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: שני תאי עצב עם אותות סידן חלשים מנותחים באמצעות גלאי DoG ו-LoG בספחים שונים. (א-ג) תא העצב הראשון (Ir21a-Gal80 26/UAS-GCaMP6;Ir93a-Gal427) מנותח על ידי DoG ו-LoG בערכי סף שונים. (א) הסף נקבע על 0.1. גם DoG וגם LoG מזהים את כל 36 נקודות הזמן. (ב) הסף נקבע על 0.3. מבין 36 נקודות הזמן, DoG מזהה 36, ו- LoG מזהה 35. (ג) הסף נקבע על 1.0. מבין 36 נקודות הזמן, DoG מזהה 34, ו- LoG מזהה 15. (ד-ו) תא העצב השני (UAS-GCaMP6;Ir68a-Gal428) מנותח על ידי DoG ו-LoG בערכי סף שונים. (ד) הסף נקבע על 0.1. DoG מזהה את כל 36 נקודות הזמן, ו- LoG מזהה 34. (ה) הסף נקבע על 0.3. מבין 36 נקודות הזמן, DoG מזהה 33, ו- LoG מזהה 18. (ו) הסף נקבע על 1.0. מבין 36 נקודות הזמן, DoG מזהה 14, ו- LoG מזהה רק אחת. יש לציין כי העלאת הסף אינה משפיעה על קריאת העוצמה שלו אם מזהים החזר השקעה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 2: הערך המרבי מייצג היטב את עוצמת התא. (A) מדומים ערימות Z עם מרחקי z שונים. (B) מדומים ערימות Z עם מיקומי z שונים. (C) ערימות Z נוצרות מתאים מדומים בעוצמות שונות. קיצורים: max = הערך המרבי של z-stack; ground_truth = מכפלת נפח התא המדומה ועוצמתו המלאה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
תרשים משלים 3: השוואה בין שיטות TACI ו-3D-ROI. (A) שינויים פלואורסצנטיים בשני תאים המסומנים בכתום ובכחול מכומתים באמצעות TACI ותוכנה מותאמת אישית הכתובה ב-IGOR Pro. סוג הגנוטיפ הוא R11F02-Gal429; UAS-GCaMP6m. (B) שינויים פלואורסצנטיים בשני תאים המסומנים בכתום ובכחול מכומתים באמצעות TACI ו-IMARIS. סוג הגנוטיפ הוא Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. קיצור: ΔF/F0 = היחס בין השינוי בפלואורסצנטיות לעוצמת הפלואורסצנטיות הראשונית. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקר זה פיתח תוסף חדש של ImageJ, TACI, ותיאר זרימת עבודה המנתחת הדמיית סידן תלת-ממדית. כלים רבים הזמינים כיום מתמקדים בתיקון תנועת x/y, אם כי גם תנועה על ציר z צריכה להיות מאובחנת במפורש או מתוקנת6. במהלך רכישת תמונה באורגניזם חי, תנועה על ציר z היא בלתי נמנעת גם כאשר האורגניזם משותק, וגירויים מסוימים, כגון שינוי טמפרטורה, גורמים לעתים קרובות להיסחפות Z משמעותית. הגדלת הגובה של ערימות z תאפשר להקליט את התאים המעניינים במהלך כל תהליך ההדמיה; עם זאת, אין זה טריוויאלי לנתח תנועה על ציר Z, במיוחד כאשר תאים בודדים מופיעים במספר מיקומי Z. אם מתעלמים מתנועה כזו, החוקרים לא יקבלו את תגובות הסידן המדויקות של תאים אלה. TACI מתקן את סחף ה-z על ידי חילוץ האותות הפלואורסצנטיים מכל מיקום z. שלב קריטי של TACI הוא למיין את הערך המרבי בכל נקודת זמן ולהשתמש בו כדי לייצג את עוצמת התא. לכן, זה המפתח לכלול את כל z- מיקומים של התאים של עניין במהלך תהליך ההדמיה. בנוסף, אנו ממליצים לאפשר לתא להופיע בחמישה מיקומי z או יותר, כך שמרחקי z ומיקומי z לא ישפיעו על הערך המרבי (איור משלים 2A,B). בנוסף, TACI מאפשר הפרדה של תאים החופפים בכיוון הצידי (x/y) אך מופיעים במיקומי z שונים.
ניתן לתקן Z-drift גם על ידי חילוץ עוצמות פלואורסצנטיות מ- ROI תלת-ממדי 8,11,29. השווינו את TACI עם שתי שיטות 3D-ROI. ראשית, קליין ואחרים יצרו תוכנה מותאמת אישית שנכתבה ב- IGOR Pro המשתמשת ב- 100 הפיקסלים הבהירים ביותר בכל החזר השקעה תלת ממדי כדי ליצור את האות הגולמי29. שיטה זו ו-TACI הניבו תוצאות דומות (איור משלים 3A). שנית, יישמנו את IMARIS (גרסה 9.8.2), תוכנה מסחרית, כדי למדל את החזר ההשקעה התלת-ממדי ולחלץ את העוצמות הממוצעות שלהם. למרות שהתוצאות של TACI ו-IMARIS הציגו מגמות דומות, שינויי הקיפול היו שונים (איור משלים 3B). פער זה עשוי לנבוע מאלגוריתמים. יש לציין כי הערך המרבי המופק על-ידי TACI פרופורציונלי לעוצמת האמת הקרקעית (איור משלים 2C).
למרות שזרימת עבודה זו היא אוטומטית למחצה ועדיין דורשת מאמצים ידניים מחוקרים, היא מספקת גישה חישובית לניתוח דימות סידן תלת-ממדי. חשוב לציין, תהליך עבודה זה מבוסס על ImageJ ואינו דורש תוכנה מסחרית או ידע בתכנות. להלן המגבלות והפתרונות האפשריים עבור זרימת עבודה זו. ראשית, TACI מקבל רק קבצי TIFF ומבנה שמות קובץ ספציפי: filename_h#t#z#c#.tif (h# ו- c# הם אופציונליים). עם זאת, תבניות קובץ אחרות התואמות ל- ImageJ ניתנות להמרה בקלות לקבצי TIFF באמצעות ImageJ. יתר על כן, לתוסף יש פונקציית RENAME הממירה את שמות התמונות למבנה הנדרש כך שהוא תואם לנתוני הדמיית סידן המתקבלים ממערכות שונות.
שנית, התוסף מיועד לנתוני הדמיית סידן עם רקעים קבועים. הפחתת מידע הרקע המתאים מעוצמות החזר ההשקעה בכל נקודת זמן היא אחת הדרכים לתקן רקעים משתנים. הכלי מספק עוצמות ROI בכל נקודת זמן בתיקיית python_files. עוצמות הרקע יכולות להיות מיוצגות על ידי (1) העוצמות הממוצעות של התמונות או (2) העוצמות הממוצעות של החזר ההשקעה ללא תאים פעילים. ImageJ מספק שיטות להשגת העוצמות הממוצעות של התמונות (על ידי לחיצה על תמונה | ערימה | Measure Stack) והעוצמות הממוצעות של החזר השקעה אקראי (על ידי לחיצה על נתח | כלים | מנהל החזר השקעה | רב מידה). אם מתרחשת הלבנה במהלך הדמיית סידן, פונקציית תיקון האקונומיקה (על ידי לחיצה על תמונה | התאמה | תיקון אקונומיקה) ניתן להריץ לפני TrackMate.
לבסוף, רישום תאים על פני מיקומי z צריך להיכלל בזרימת עבודה זו אם משתמשים ב- TACI כדי לנתח מספר גדול של נוירונים בו זמנית. בהתאם לכך, יש לפתח פונקציה נוספת המארגנת את המידע על עוצמות פלואורסצנטיות לתוך מבנה הנתונים הנדרש על ידי הפונקציה MERGE .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
Zeiss LSM 880 במרכז ההדמיה Fralin שימש לאיסוף נתוני הדמיית הסידן. אנו מודים לד"ר מישל ל. אולסן ויוהנג פאן על עזרתם בתוכנת IMARIS. אנו מודים לד"ר לנווד ס. הית' על הערות בונות על כתב היד ולסטיבן ג'יאווסיס על הערות על קובץ ה-README של GitHub. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) ו- NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) ל- L.N. למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב המחקר, באיסוף הנתונים ובניתוחם, בהחלטה על פרסומם או בהכנת כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt Fill Needel | BD | 303129 | |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Fly food ingredient |
| Carbon dioxide | Airgas | UN1013 | Size 200 High Pressure Steel Cylinder |
| CO2 bubbler kit | Genesee | 59-180 | |
| Confocal microscope LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2. |
| DAQami software | Measurement Computing | ||
| Dextrose | Genesee | 62-113 | Fly food ingredient |
| Drosophila Agar | Genesee | 66-111 | Fly food ingredient |
| Ethanol | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | Fly food ingredient |
| Fly line: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni lab | ||
| Fly line: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| General purpose forged brass regulator | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| Green Drosophila tubing | Genesee | 59-124 | |
| Heat transfer compound | MG Chemicals | 860-60G | |
| Heatsink | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | Resize to 12.9 x 5.5 cm |
| Illuminator | AmScope | LED-6W | |
| Inactive Dry Yeast | Genesee | 62-108 | Fly food ingredient |
| Incubator | Pervical | DR-41VL | Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH. |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Thermo Scientific | 126965000 | Fly food ingrediete |
| Micro cover glass | VWR | 48382-126 | 22 x 40 mm |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| Nail polish | Kleancolor | ||
| Narrow Drosophila vials | Genesee | 32-113RL | |
| Objective | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| Peltier cooling module | TE Technology | TE-127-1.0-0.8 | 30 x 30 mm |
| Plugs | Genesee | 49-102 | |
| Power Supply | Circuit Specialists | CSI1802X | 10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply |
| Princeton Artist Brush Nepture | Princeton Artist Brush Co. | Series 4750, size 2 | |
| Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate | Thermo Scientific | 033241-36 | Fly food ingredient |
| Stage insert | Wienecke and Sinske | 432339-9030-000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | Any stereo microscope works |
| T-Fitting | Genesee | 59-123 | |
| Thermocouple data acquisition device | Measurement Computing | USB-2001-TC | Single channel |
| Thermocouple microprobe | Physitemp | IT-24P | |
| Yellow Cornmeal | Genesee | 62-101 | Fly food ingredient |
| Z-axis piezo stage | Wienecke and Sinske | 432339-9000-000 |
References
- Grienberger, C., Konnerth, A.
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Zhang, Y., et al. jGCaMP8 fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
- Robbins, M., Christensen, C. N., Kaminski, C. F., Zlatic, M. Calcium imaging analysis - How far have we come. F1000Research. 10, 258 (2021).
- Oh, J., Lee, C., Kaang, B. K. Imaging and analysis of genetically encoded calcium indicators linking neural circuits and behaviors. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 23 (4), 237-249 (2019).
- Stringer, C., Pachitariu, M. Computational processing of neural recordings from calcium imaging data. Current Opinion in Neurobiology. 55, 22-31 (2019).
- Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
- Nguyen, J. P., Linder, A. N., Plummer, G. S., Shaevitz, J. W., Leifer, A. M. Automatically tracking neurons in a moving and deforming brain. PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005517 (2017).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. EMC2: A versatile algorithm for robust tracking of calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. bioRxiv. , (2021).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
- Delestro, F., et al. In vivo large-scale analysis of Drosophila neuronal calcium traces by automated tracking of single somata. Scientific Reports. 10, 7153 (2020).
- Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).
- Eglen, S. J., et al. Toward standard practices for sharing computer code and programs in neuroscience. Nature Neuroscience. 20 (6), 770-773 (2017).
- Pachitariu, M., et al. Suite2p: Beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy. bioRxiv. , (2017).
- Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. Tracking calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. PLoS Computational Biology. 17 (10), 1009432 (2021).
- Kolar, K., Dondorp, D., Zwiggelaar, J. C., Høyer, J., Chatzigeorgiou, M. Mesmerize is a dynamically adaptable user-friendly analysis platform for 2D and 3D calcium imaging data. Nature Communications. 12, 6569 (2021).
- Moein, M., et al. CaSiAn: A Calcium Signaling Analyzer tool. Bioinformatics. 34 (17), 3052-3054 (2018).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
- Neugornet, A., O'Donovan, B., Ortinski, P. I. Comparative effects of event detection methods on the analysis and interpretation of Ca(2+) imaging data. Frontiers in Neuroscience. 15, 620869 (2021).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Fazeli, E., et al. Automated cell tracking using StarDist and TrackMate. F1000Research. 9, 1279 (2020).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Ni, L., et al. The ionotropic receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
- Omelchenko, A. A., et al. Cool and warm ionotropic receptors control multiple thermotaxes in Drosophila larvae. Frontiers in Molecular Neuroscience. , (2022).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nature Communications. 9 (1), 4252 (2018).
- Hernandez-Nunez, L., et al. Synchronous and opponent thermosensors use flexible cross-inhibition to orchestrate thermal homeostasis. Science Advances. 7 (35), (2021).
- Klein, M., et al. Sensory determinants of behavioral dynamics in Drosophila thermotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (2), 220-229 (2015).
