Summary
TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) es un complemento de código abierto de ImageJ para el análisis de imágenes de calcio en 3D que examina el movimiento en el eje z e identifica el valor máximo de cada pila z para representar la intensidad de una celda en el punto de tiempo correspondiente. Puede separar neuronas que se superponen en la dirección lateral (x / y) pero en diferentes planos z.
Abstract
La investigación en neurociencia ha evolucionado para utilizar imágenes complejas y herramientas computacionales para extraer información completa de conjuntos de datos. La imagen de calcio es una técnica ampliamente utilizada que requiere un software sofisticado para obtener resultados confiables, pero muchos laboratorios luchan por adoptar métodos computacionales al actualizar los protocolos para cumplir con los estándares modernos. Las dificultades surgen debido a la falta de conocimientos de programación y paywalls para el software. Además, las células de interés muestran movimientos en todas las direcciones durante las imágenes de calcio. Se han desarrollado muchos enfoques para corregir el movimiento en la dirección lateral (x / y).
Este documento describe un flujo de trabajo utilizando un nuevo complemento de ImageJ, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), para examinar el movimiento en el eje z en imágenes de calcio 3D. Este software identifica el valor máximo de fluorescencia de todas las posiciones z en las que aparece una neurona y lo utiliza para representar la intensidad de la neurona en la posición t correspondiente. Por lo tanto, esta herramienta puede separar neuronas que se superponen en la dirección lateral (x / y) pero que aparecen en distintos planos z. Como complemento de ImageJ, TACI es una herramienta computacional de código abierto fácil de usar para el análisis de imágenes de calcio en 3D. Validamos este flujo de trabajo utilizando neuronas termosensibles larvales de mosca que mostraban movimientos en todas las direcciones durante la fluctuación de la temperatura y un conjunto de datos de imágenes de calcio en 3D adquiridos del cerebro de la mosca.
Introduction
El nivel de calcio intracelular es un marcador preciso de excitabilidad neuronal. La imagen de calcio mide los cambios en el calcio intracelular para comprender la actividad neuronal1. Los estudios en neurociencia han utilizado cada vez más este método debido al desarrollo de técnicas para medir la concentración intracelular de calcio, incluidos los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI), como GCaMP2,3, que pueden expresarse de forma no invasiva en conjuntos específicos de neuronas a través de enfoques genéticos. Los menores costos de los láseres y los componentes del microscopio también han aumentado el uso de imágenes de calcio4. Es importante destacar que las imágenes de calcio permiten registrar y estudiar neuronas individuales, así como grandes poblaciones de neuronas simultáneamente en animales que se mueven libremente5.
Sin embargo, el análisis de los datos de imágenes de calcio es desafiante porque (1) implica rastrear los cambios en la fluorescencia de las células individuales a lo largo del tiempo, (2) la señal de fluorescencia desaparece intermitentemente o reaparece con respuestas neuronales, y (3) las neuronas pueden moverse en todas las direcciones, específicamente dentro y fuera de un plano focal o apareciendo en múltiples planos4, 6. El análisis manual requiere mucho tiempo y se vuelve poco práctico a medida que aumenta la duración de las grabaciones y el número de neuronas. Se han desarrollado varios programas de software para acelerar el proceso de análisis de imágenes de calcio. Anteriormente, el software se diseñaba en un contexto experimental limitado, lo que dificultaba que otros laboratorios lo adoptaran. Los esfuerzos recientes para cumplir con los estándares modernos para el intercambio de software han llevado al desarrollo de varias herramientas que pueden analizar consistentemente los datos de imágenes de calcio en diferentes grupos 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Sin embargo, la mayoría de estas herramientas requieren conocimientos de programación y/o dependen de software comercial. La falta de conocimientos de programación y los muros de pago de software disuaden a los investigadores de adoptar estos métodos. Además, muchas de estas herramientas se centran en corregir el movimiento x/y, aunque el movimiento en el eje z también necesita ser diagnosticado y corregido explícitamente6. Existe la necesidad de una herramienta computacional para analizar imágenes de calcio 3D que se centren en las neuronas que exhiben z-drift y aparecen en múltiples z-planos. Idealmente, esta herramienta debería usar software de código abierto y no requerir conocimientos de programación para permitir que otros laboratorios la adopten fácilmente.
Aquí, desarrollamos un nuevo complemento de ImageJ, TACI, para analizar datos de imágenes de calcio en 3D. Primero, el software cambia el nombre, si es necesario, y organiza los datos de imágenes de calcio 3D por posiciones z. Las células de interés se rastrean en cada posición z, y sus intensidades de fluorescencia son extraídas por TrackMate u otras herramientas computacionales. Luego se aplica TACI para examinar el movimiento en el eje z. Identifica el valor máximo de una pila z y lo utiliza para representar la intensidad de una celda en el punto de tiempo correspondiente. Este flujo de trabajo es adecuado para analizar imágenes 3D de calcio con movimiento en todas las direcciones y / o con neuronas superpuestas en la dirección lateral (x / y) pero que aparecen en diferentes posiciones z. Para validar este flujo de trabajo, se utilizaron conjuntos de datos de imágenes de calcio 3D de neuronas termosensibles larvales de moscas y neuronas de hongos en el cerebro. Cabe destacar que TACI es un complemento de código abierto de ImageJ y no requiere ningún conocimiento de programación.
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Protocol
1. Imágenes de calcio
- Preparación de larvas de mosca
NOTA: Las moscas y larvas se mantienen a 25 °C bajo un ciclo de luz:oscuridad de 12 h:12 h.- Anestesiar las moscas conCO2. Clasificar 20-45 machos y 20-45 hembras en cada vial de mosca, y darles al menos 24 h a 48 h para recuperarse de la exposición alCO2 .
NOTA: La exposición de las moscas alCO2 debe durar el menor tiempo posible. - Para sincronizar la edad de las larvas, golpee sobre las moscas en nuevos viales que contengan gránulos de levadura y déjelas 4-8 h para poner huevos. Retire las moscas volteándolas en viales nuevos.
- Recolectar las larvas a las 72 h usando 10 mL de solución de sacarosa al 20% p/v.
- Anestesiar las moscas conCO2. Clasificar 20-45 machos y 20-45 hembras en cada vial de mosca, y darles al menos 24 h a 48 h para recuperarse de la exposición alCO2 .
- Configuración del microscopio y del control de temperatura
- Realice la obtención de imágenes en un microscopio confocal (consulte la Tabla de materiales) y una etapa piezoeléctrica del eje z con un inserto de escenario utilizando los siguientes ajustes: láser, argón; modo de escaneo, marco; tamaño del marco, 512 x 512; velocidad, máximo; canales/profundidad de bits, 1/8 bit; zoom, 1.5; pila z, corte = 15, Keep = corte; dispositivos de enfoque y estrategia, enfoque definido; enfoque, Enfoque definido en.
- Conecte un módulo de enfriamiento Peltier a un disipador de calor mediante el compuesto de transferencia de calor para construir un enfriador termoeléctrico. El Peltier funciona con una fuente de alimentación de 2 A.
- Conecte una microsonda de termopar a un dispositivo de adquisición de datos para registrar la temperatura.
- Imágenes de calcio
- Enjuague las larvas 3 veces en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Pipetear 75 μL de 1x PBS en el centro de un portaobjetos de vidrio.
- Coloque una o dos larvas en 1x PBS y coloque la microsonda del termopar cerca de las larvas.
NOTA: La distancia entre las larvas y la microsonda debe ser ~5 mm. Las larvas pueden moverse si la microsonda se coloca demasiado cerca de ellas. Una gran distancia podría resultar en lecturas de temperatura inexactas. - Cubra las larvas y la microsonda del termopar con un cubreobjetos de vidrio. Selle el cubreobjetos con esmalte de uñas.
- Coloque el portaobjetos en la platina del microscopio, encuentre el enfoque con un objetivo de 25x y coloque el enfriador termoeléctrico en el portaobjetos.
NOTA: El Peltier se coloca directamente en el portaobjetos donde las larvas deben entregar los estímulos de temperatura. - En el software confocal, concéntrese en las células fluorescentes de interés. Ajuste la potencia del láser para evitar sobresaturación. Establezca las posiciones de primer y último sector en la configuración z-stack.
NOTA: Utilice la potencia láser más baja posible antes de grabar para evitar el fotoblanqueo. - Inicie el escaneo z-stack y el registro de temperatura al mismo tiempo.
- Controle la fuente de alimentación que alimenta el Peltier para cambiar la temperatura de la superficie del Peltier. Encienda la fuente de alimentación para disminuir la temperatura y apáguela para aumentar la temperatura.
- Detenga el escaneo z-stack y el registro de temperatura.
2. Análisis de los datos de imágenes de calcio 3D
- Exporte los datos de imágenes de calcio a archivos TIFF y guárdelos en una carpeta con el mismo nombre que el nombre base de los archivos TIFF dentro.
Nota : el nombre de archivo no debe contener comas.- Utilice los siguientes parámetros para exportar los datos de imágenes de calcio de ZEN (edición negra): tipo de archivo, TIFF; compresión, LZW; canales, 2; posición Z, todos; tiempo, todo; fase, 1; región, lleno.
- Instalación
- Descargue TACI-Calcium_Imaging.jar desde Github (https://github.com/niflylab/TACI_CalciumImagingPlugin/releases).
- Instale el complemento en FIJI haciendo clic en Plugins en la barra de menú y luego haciendo clic en Instalar en el menú desplegable (Plugins | Instalar). A continuación, reinicie FIJI.
NOTA: NO utilice plugins | Instalar plugin. - Ejecute el complemento haciendo clic en Plugins y luego eligiendo TACI-Calcium Imaging (Plugins | TACI-Imágenes de calcio).
- Utilice la función RENAME para convertir los nombres de archivo TIFF a la estructura necesaria.
NOTA: La herramienta utiliza filename_h#t#z#c#.tif como estructura predeterminada (h# y c# son opcionales; #: un entero positivo). Si los nombres de archivo de imagen no están en la estructura predeterminada, se debe ejecutar la función RENAME .- Elija la carpeta en la que es necesario cambiar el nombre de las imágenes TIFF haciendo clic en Examinar carpetas.
- Rellene la información del parámetro. Se enumeran cinco parámetros, incluidos Nombre de archivo, Fase, Posición T máxima, Posición Z máxima y Canal. Cada parámetro tiene tres valores: Texto anterior, Valor del parámetro y Orden.
NOTA: La información distingue entre mayúsculas y minúsculas. Si los nombres de archivo de imagen contienen una frase antes de un parámetro, rellene la frase como Texto anterior del parámetro correspondiente. Si los nombres de archivo de imagen contienen una frase después de todos los parámetros, rellene la frase como Texto de publicación.- Asegúrese de escribir Nombre de archivo, Posición T máxima y Posición Z máxima y que los valores de los parámetros para Posición T máxima y Posición Z máxima incluyan todos los dígitos.
- Espere a que el nombre de archivo se rellene automáticamente con el nombre de carpeta.
- Si los nombres de archivo TIFF no incluyen la fase y el canal, deje en blanco el valor del parámetro correspondiente y elija Na en orden.
- Haga clic en Cambiar nombre para crear una carpeta con el mismo nombre y _r. Observe que en la carpeta, los nombres de archivo TIFF se han reestructurado para que sean compatibles con la función ORGANIZAR .
NOTA: _r se ha agregado a los nombres de archivo de las imágenes TIFF.
- Utilice la función ORGANIZE para guardar las imágenes TIFF desde la misma posición z en una carpeta.
NOTA: El nombre de la carpeta debe tener el mismo nombre que el nombre base de los archivos TIFF dentro y NO debe tener comas.- Elija la carpeta en la que las imágenes TIFF deben organizarse haciendo clic en Examinar carpetas.
- Si el archivo CSV de parámetros (param.csv) existe, espere a que los valores de los parámetros se rellenen automáticamente.
Nota: El archivo param.csv tiene un formato requerido. Los parámetros, incluidos el nombre de archivo, la fase, el position_t, el position_z, el canal y is_gray, deben rellenarse en la fila 1 de izquierda a derecha a partir de la columna A. Los valores correspondientes para cada parámetro deben rellenarse en la fila 2. - Si el archivo CSV de parámetros (param.csv) no existe, rellene manualmente los valores de los parámetros. Asegúrese de que los valores de los parámetros de Fase y Canal incluyan letras, mientras que los valores de parámetro de Posición T y Posición Z deben ser los números más grandes de las posiciones t y z. Si los nombres de archivo de imagen no incluyen la fase o el canal, escriba Na.
- Cree imágenes TIFF en escala de grises cuando sea necesario. Deje la casilla de ¿Son las imágenes grises? sin marcar para escalar grises las imágenes.
- Haga clic en Organizar para crear una carpeta con el mismo nombre y _gray_stacks y para generar carpetas con el mismo nombre y _# (#: z-positions) en la carpeta. Observe que los archivos TIFF están ordenados en las carpetas correspondientes por posiciones z y que se genera un archivo llamado param.csv, en el que se pueden encontrar los parámetros y sus valores.
- Utilice TrackMate en FIJI para extraer las intensidades de fluorescencia de las células de interés de cada posición z.
NOTA: Este paso también se puede realizar con otro software de imágenes.- Abra las imágenes TIFF en una carpeta z-position de FIJI.
- Ejecute TrackMate haciendo clic en Plugins | Seguimiento | TrackMate y ajuste los siguientes parámetros si es necesario.
- Utilice detectores DoG o LoG.
- Cambie el diámetro del blob, el umbral y el filtro mediano. Ajuste el diámetro de la mancha para que sea similar al diámetro de las celdas. Si las celdas son ovaladas, ajuste el diámetro de la mancha para que sea similar al eje menor.
NOTA: El aumento del umbral ayuda a evitar que el ruido de fondo se capte como señales sin afectar a las intensidades de la señal (Figura complementaria 1). Sin embargo, un aumento en el umbral puede pasar por alto señales verdaderas (Figura complementaria 1). Si las señales son fuertes, use el filtro mediano para disminuir el ruido de sal y pimienta. - Configure los filtros para eliminar algunas, si no todas, las señales irrelevantes. Los filtros X e Y son filtros espaciales. Utilice los filtros X e Y para eliminar las señales irrelevantes que están distantes de las señales reales.
NOTA: Cuando se establecen filtros en una imagen, es crucial verificar todas las demás imágenes para asegurarse de que no se eliminen las señales reales. - Establezca la distancia máxima de vinculación, la distancia máxima de cierre de huecos y el espacio máximo de fotogramas de cierre de huecos. Establezca la distancia máxima de enlace y la distancia máxima de cierre de espacios para que sean 3x-5x el diámetro de la mancha, especialmente cuando las muestras se mueven significativamente con el tiempo, para ayudar a disminuir el número de pistas. Establezca el espacio máximo de fotogramas que cierra el espacio en el número de imágenes de la pila.
- Exporte las intensidades de fluorescencia de las regiones de interés (ROI) a un archivo CSV. Si se utiliza una versión antigua de TrackMate, elija Exportar todas las estadísticas de anuncios en la ventana Seleccionar una acción . Si la versión de TrackMate es 7.6.1 o superior, elija Spots en la ventana Opciones de pantalla . Exporte o guarde como archivos interactivos en archivos CSV.
NOTA: Ambos archivos son interactivos con la ventana de imagen; resaltar un ROI muestra el ROI correspondiente en la ventana de la imagen. Estos archivos incluyen las intensidades medias (MEAN_INTENSITY o MEAN_INTENSITY_CH1) de las celdas de interés en los puntos de tiempo correspondientes (POSITION_T). El mismo TRACK_IDs debe representar el mismo ROI en diferentes puntos de tiempo. Sin embargo, esto no siempre es cierto y puede necesitar ser corregido manualmente, cuando sea necesario. Si TrackMate no reconoce los ROI en algunos puntos de tiempo, esos puntos de tiempo no se muestran.
- Extraiga la intensidad de fluorescencia de fondo y cree el archivo Background_list.csv.
NOTA: En este estudio, la intensidad de fondo para cada posición z se estimó utilizando el valor promedio de tres a cinco manchas vecinas del mismo tamaño que no contenían señales de fluorescencia y provenían de diferentes puntos de tiempo.- El archivo Background_list.csv tiene un formato requerido: cada columna contiene la información de una neurona, a partir de la neurona 0. Rellene los números de neurona, como Neurona 0, en la fila 1. Luego, proporcione la intensidad de fondo para cada posición z analizada; si se analizan cinco posiciones z para la neurona 0, complete cinco valores de intensidad de fondo debajo de la neurona 0.
NOTA: El archivo Background_list.csv es necesario para la función TACI EXTRACT . Si el fondo es insignificante, se debe proporcionar el Background_list.csv con la intensidad de fondo cero de cada neurona.
- El archivo Background_list.csv tiene un formato requerido: cada columna contiene la información de una neurona, a partir de la neurona 0. Rellene los números de neurona, como Neurona 0, en la fila 1. Luego, proporcione la intensidad de fondo para cada posición z analizada; si se analizan cinco posiciones z para la neurona 0, complete cinco valores de intensidad de fondo debajo de la neurona 0.
- Utilice la función EXTRACT para identificar las intensidades máximas de fluorescencia en cada posición t y calcular ΔF/F0 como se muestra en la ecuación (1).
(1)- Cree una carpeta y asígnele un nombre con el número de neurona, comenzando por Neurona 0. Guarde los archivos CSV que contienen la información de fluorescencia de la neurona correspondiente en la carpeta. Cada archivo CSV contiene la información de una posición z, por lo que el número de archivos CSV es igual al número de posiciones z analizadas. Asigne a los archivos CSV el nombre Mean_Intensity#.csv (# representa la posición z) y cada archivo CSV incluye al menos dos columnas: POSITION_T y MEAN_INTENSITY o MEAN_INTENSITY_CH1.
NOTA: Cree una carpeta para cada celda de interés. - Guarde el archivo Background_list.csv y las carpetas creadas en el paso 2.7.1 en una carpeta. Elija esta carpeta haciendo clic en Examinar archivos.
Nota : el número de valores de fondo en el archivo de Background_list.csv debe coincidir con el número de los archivos Mean_Intensity#.csv para cada neurona. - El archivo de fondo se rellena automáticamente. Complete el mayor número de posiciones t para el número de posiciones T.
- Haga clic en Extraer para crear una carpeta de resultados, incluidos los archivos CSV y los gráficos de cada neurona. Los archivos CSV incluyen información sobre la intensidad máxima de fluorescencia y ΔF/F0 en cada posición t. Los gráficos son gráficos de líneas de ΔF/F0 sobre posiciones t.
NOTA: En este estudio, ΔF/F0 se calculó utilizando la ecuación (1). El primer valor de cada posición z se utilizó como F0. Si este F0 no es apropiado20, el complemento proporciona archivos que incluyen datos sin procesar para cada neurona en la carpeta python_files.
- Cree una carpeta y asígnele un nombre con el número de neurona, comenzando por Neurona 0. Guarde los archivos CSV que contienen la información de fluorescencia de la neurona correspondiente en la carpeta. Cada archivo CSV contiene la información de una posición z, por lo que el número de archivos CSV es igual al número de posiciones z analizadas. Asigne a los archivos CSV el nombre Mean_Intensity#.csv (# representa la posición z) y cada archivo CSV incluye al menos dos columnas: POSITION_T y MEAN_INTENSITY o MEAN_INTENSITY_CH1.
- Utilice la función MERGE para promediar el ΔF/F 0 de cada neurona, calcular el SEM y trazar el promedio de ΔF/F0 sobre las posiciones t.
- Elija la carpeta de resultados creada por la función EXTRACT haciendo clic en Examinar archivos.
- Rellene el número de posiciones T con el mayor número de posiciones t.
- Haga clic en Combinar para crear una carpeta merged_data, incluido un archivo merged_data.csv y un trazado de Average_dF_F0.png. El archivo CSV incluye la información sobre el promedio y SEM ΔF / F0 en cada posición t. El gráfico es un gráfico de líneas del promedio ΔF/F0 sobre las posiciones t.
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Representative Results
Flujo de trabajo del análisis de imágenes de calcio 3D
En este estudio, desarrollamos un nuevo complemento de ImageJ, TACI, y describimos un flujo de trabajo para rastrear la deriva z y analizar imágenes de calcio 3D que señalan las respuestas de las células individuales que aparecen en múltiples posiciones z (Figura 1). Esta herramienta tiene cuatro funciones: RENAME, ORGANIZE, EXTRACT y MERGE. En primer lugar, si los nombres de las imágenes no son compatibles con la función ORGANIZAR, la función RENAME puede convertir los nombres de las imágenes a la estructura necesaria. A continuación, la función ORGANIZE escala de grises (si es necesario) y organiza los datos TIFF de imágenes de calcio 3D por posiciones z. Las imágenes de la misma posición z se guardan en una carpeta. A continuación, se pueden utilizar diferentes herramientas de análisis de imágenes para detectar y rastrear los ROI y extraer sus intensidades de fluorescencia a lo largo del tiempo para cada posición z. Se utilizó un complemento de ImageJ, TrackMate, para realizar este paso. TrackMate es un plugin de código abierto de ImageJ para rastrear partículas individuales21. Se ha utilizado ampliamente para rastrear partículas en varios estudios biológicos que involucran imágenes de células vivas, incluidas las imágenes de calcio 11,21,22,23. TrackMate, de manera automatizada, rastrea las células en la dirección lateral (x / y), detecta ROI y extrae señales de un conjunto de datos de imágenes en vivo 4,12. Para cada celda de interés, la función EXTRACT ordena las intensidades de fluorescencia de todas las posiciones z por posiciones t, identifica los valores máximos de cada posición t, resta el fondo y calcula y traza ΔF/F0. Por último, la función MERGE calcula y traza el promedio de ΔF/F0 de varias celdas.
Respuestas de calcio de las neuronas frías de larvas de mosca a los cambios de temperatura
Validamos este método utilizando los cambios de calcio en respuesta a las fluctuaciones de temperatura en las neuronas frías de larvas de mosca. Un indicador de calcio codificado genéticamente, GCaMP6m 24, fue expresado en neuronas frías larvales por Ir21a-Gal425. Cuando se expusieron a aproximadamente 27 °C, las neuronas tenían niveles bajos de calcio intracelular (Figura 2A y Figura 3). Cuando la temperatura se redujo a aproximadamente 10 ° C y se mantuvo allí, los niveles de calcio intracelular aumentaron rápidamente y se mantuvieron (Figura 2B y Figura 3). Los niveles de calcio disminuyeron rápidamente cuando se aumentó la temperatura (Figura 3).
Análisis de un conjunto de datos de imágenes de calcio 3D de cerebro de mosca
También validamos este método utilizando un conjunto de datos de imágenes de calcio 3D de cerebro de mosca11. Las moscas transgénicas fotografiadas (VT50339-Gal4; UAS-GCaMP6f) expresó GCaMP6f en el cuerpo del hongo en el cerebro11. Los datos de 45 posiciones z (espaciadas a intervalos de 1,5 μm) se recopilaron a 50 Hz durante 225 s (250 puntos de tiempo), y se analizó la primera mitad del conjunto de datos (125 puntos de tiempo). Cuando comenzó la grabación, siete neuronas tenían fluorescencia obvia, y cuatro de ellas fueron analizadas (Figura 4A). Las intensidades en estas neuronas disminuyeron con el tiempo (Figura 4B). Cuando se aplicó octanol (Figura 4C), múltiples neuronas se iluminaron. Se encontró que la fluorescencia de 10 neuronas aumenta simultáneamente en el punto de tiempo 92 (Figura 4D), lo que sugiere que estas neuronas de hongos responden al olor a octanol. Aunque el octanol se aplicó durante 5 s, se observó una alta fluorescencia en estas neuronas en un solo punto de tiempo (0,9 s) y luego disminuyó rápidamente, lo que sugiere que la respuesta es fásica y transitoria.
Separación de celdas superpuestas
La figura 5A presenta una imagen de proyección máxima de tres neuronas. La punta de flecha blanca apunta a dos neuronas que se superponían en el plano x/y pero estaban separadas en la vista orto (puntas de flecha azules y naranjas en la Figura 5B), lo que indica que estas neuronas aparecieron en diferentes posiciones z; la celda naranja tenía la señal más fuerte en z7 (Figura 5C), mientras que la celda azul tenía la señal más fuerte en z10 (Figura 5D). La herramienta distinguió estas dos células y reveló la activación retardada pero fuerte de la célula naranja (Figura 5E).
Figura 1: Flujo de trabajo usando TACI para analizar imágenes de calcio en 3D. TACI tiene cuatro funciones: RENAME, ORGANIZE, EXTRACT y MERGE. En primer lugar, si los nombres TIFF no son compatibles con la función ORGANIZAR, la función RENAME puede convertir los nombres de imagen a la estructura requerida. A continuación, la función ORGANIZE escala de grises (si es necesario) y organiza los datos TIFF de imágenes de calcio 3D por posiciones z. Las imágenes de la misma posición z se guardan en una carpeta. A continuación, se pueden utilizar diferentes herramientas de análisis de imágenes para detectar y rastrear los ROI y extraer sus intensidades de fluorescencia en cada posición z. Para cada celda de interés, la función EXTRACT ordena las intensidades de fluorescencia por los puntos de tiempo correspondientes, identifica los valores máximos de cada posición t, resta el fondo y calcula y traza ΔF/F0. Por último, la función MERGE calcula y traza el promedio de ΔF/F0 de varias celdas. Abreviaturas: TACI = TrackMate Analysis of Calcium Imaging; ROIs = regiones de interés; ΔF/F0 = relación entre el cambio en la fluorescencia y la intensidad inicial de la fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes de calcio de células frías larvales de mosca en estados inactivos y activos . (A) Las células son apenas visibles en el estado inactivo. (B) Las células son fuertemente fluorescentes en el estado activo. Las puntas de flecha de diferentes colores indican diferentes celdas. El genotipo es Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. Z5-13: imágenes en posiciones z del 5 al 13. En B, la celda indicada por las puntas de flecha blancas se muestra en z5 a z8; Las celdas indicadas por puntas de flecha naranja y azul se muestran en Z8 a Z13. Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cuantificación de la fluorescencia como el cambio en la intensidad de fluorescencia (F) en comparación con la intensidad inicial (F0). El genotipo es Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. n = 7 células de tres animales. Trazas = media ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis de un conjunto de datos de imágenes de calcio 3D de cerebro de mosca. (A) La imagen de proyección máxima en el punto de tiempo 1 (t1). Los números 0-3 indican las cuatro neuronas analizadas. (B) Cambios de fluorescencia de las neuronas 0-3 en A durante los puntos de tiempo 0 a 125. (C) La imagen de proyección máxima en el punto de tiempo 92 (t92). Los números 0-9 indican las 10 neuronas analizadas. (D) Cambios de fluorescencia de las neuronas 0-9 en C durante los puntos de tiempo 0 a 125. Se aplicaron 5 s de aire o 5 s de octanol, como se muestra en gris. Barra de escala = 10.000 unidades de intensidad de fluorescencia bruta. Abreviatura: OCT = octanol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Separación de celdas superpuestas en función del valor máximo. (A) Dos neuronas se superponen (punta de flecha blanca) en una imagen de proyección máxima (m). El genotipo es Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. (B) Estas neuronas están separadas en la vista orto (puntas de flecha azules y naranjas). (C,D) La celda naranja aparece en z7 (C), mientras que la celda azul aparece en z10 (D). Barra de escala = 10 μm. (E) Los cambios de fluorescencia de las celdas naranja y azul se cuantifican utilizando los valores máximos de las posiciones z individuales. Abreviatura: ΔF/F0 = relación entre el cambio en la fluorescencia y la intensidad de fluorescencia inicial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Dos neuronas con señales débiles de calcio se analizan utilizando detectores DoG y LoG en diferentes umbrales. (A-C) La primera neurona (Ir21a-Gal80 26/UAS-GCaMP6;Ir93a-Gal427) es analizada por DoG y LoG en diferentes umbrales. (A) El umbral se fija en 0.1. Tanto DoG como LoG detectan los 36 puntos de tiempo. (B) El umbral se fija en 0,3. Entre los 36 puntos de tiempo, DoG detecta 36 y LoG detecta 35. (C) El umbral se establece en 1.0. Entre los 36 puntos de tiempo, DoG detecta 34 y LoG detecta 15. (D-F) La segunda neurona (UAS-GCaMP6;Ir68a-Gal428) es analizada por DoG y LoG a diferentes umbrales. D) El umbral se fija en 0,1. DoG detecta los 36 puntos de tiempo y LoG detecta 34. E) El umbral se fija en 0,3. Entre los 36 puntos de tiempo, DoG detecta 33 y LoG detecta 18. (F) El umbral se establece en 1.0. Entre los 36 puntos de tiempo, DoG detecta 14 y LoG detecta solo uno. Cabe destacar que aumentar el umbral no afecta su lectura de intensidad si se reconoce un ROI. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 2: El valor máximo es un buen representante de la intensidad de una célula. (A) Se simulan pilas Z con diferentes distancias Z. (B) Se simulan pilas Z con diferentes posiciones z. (C) Las pilas Z se crean a partir de celdas simuladas con diferentes intensidades. Abreviaturas: max = el valor máximo de una pila z; ground_truth = el producto del volumen de la celda simulada y su intensidad de llenado. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 3: Comparación entre los métodos TACI y 3D-ROI. (A) Los cambios de fluorescencia en dos celdas indicadas por naranja y azul se cuantifican utilizando TACI y un software personalizado escrito en IGOR Pro. El tipo de genotipo es R11F02-Gal429; UAS-GCaMP6m. (B) Los cambios de fluorescencia en dos celdas indicadas por naranja y azul se cuantifican utilizando TACI e IMARIS. El tipo de genotipo es Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. Abreviatura: ΔF/F0 = relación entre el cambio en la fluorescencia y la intensidad de fluorescencia inicial. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Este estudio desarrolló un nuevo complemento de ImageJ, TACI, y describió un flujo de trabajo que analiza las imágenes de calcio en 3D. Muchas herramientas actualmente disponibles se centran en corregir el movimiento x/y, aunque el movimiento en el eje z también necesita ser diagnosticado o corregido explícitamente6. Durante la adquisición de imágenes en un organismo vivo, el movimiento en el eje z es inevitable incluso cuando el organismo está inmovilizado, y algunos estímulos, como el cambio de temperatura, a menudo causan una deriva z significativa. El aumento de la altura de las pilas z permitirá registrar las células de interés durante todo el proceso de obtención de imágenes; Sin embargo, no es trivial analizar el movimiento en el eje Z, especialmente cuando las células individuales aparecen en múltiples posiciones Z. Si se ignora tal movimiento, los investigadores no obtendrán las respuestas precisas de calcio de estas células. TACI corrige la deriva z extrayendo las señales de fluorescencia de cada posición z. Un paso crítico de TACI es ordenar el valor máximo en cada punto de tiempo y usarlo para representar la intensidad de una célula. Por lo tanto, es clave incluir todas las posiciones z de las células de interés durante el proceso de imagen. Además, recomendamos permitir que una celda aparezca en cinco o más posiciones z para que las distancias z y las posiciones z no afecten al valor máximo (Figura complementaria 2A, B). Además, TACI permite la separación de células que se superponen en la dirección lateral (x / y) pero aparecen en diferentes posiciones z.
La deriva Z también se puede corregir extrayendo intensidades de fluorescencia de ROI 3D 8,11,29. Se comparó TACI con dos métodos 3D-ROI. Primero, Klein et al. crearon un software personalizado escrito en IGOR Pro que utiliza los 100 píxeles más brillantes en cada ROI 3D para generar la señal sin procesar29. Este método y TACI produjeron resultados similares (Figura complementaria 3A). En segundo lugar, aplicamos IMARIS (versión 9.8.2), un software comercial, para modelar los ROI 3D y extraer sus intensidades medias. Aunque los resultados de TACI e IMARIS mostraron tendencias similares, los cambios en el pliegue fueron diferentes (Figura complementaria 3B). Esta discrepancia puede deberse a algoritmos. Cabe destacar que el valor máximo extraído por TACI es proporcional a la intensidad de la verdad sobre el terreno (Figura complementaria 2C).
Aunque este flujo de trabajo es semiautomático y aún requiere esfuerzos manuales de los investigadores, proporciona un enfoque computacional para el análisis de imágenes de calcio en 3D. Es importante destacar que este flujo de trabajo se basa en ImageJ y no requiere software comercial ni conocimientos de programación. Las limitaciones y posibles soluciones para este flujo de trabajo son las siguientes. Primero, TACI solo acepta archivos TIFF y una estructura de nombre de archivo específica: filename_h#t#z#c#.tif (h# y c# son opcionales). Sin embargo, ImageJ puede convertir fácilmente otros formatos de archivo compatibles con ImageJ a archivos TIFF. Además, el plugin tiene una función RENAME que convierte los nombres de las imágenes a la estructura requerida para que sea compatible con los datos de imágenes de calcio obtenidos de diferentes sistemas.
En segundo lugar, el complemento está diseñado para datos de imágenes de calcio con fondos constantes. Restar la información de fondo correspondiente de las intensidades de ROI en cada punto de tiempo es una forma de corregir los fondos fluctuantes. La herramienta proporciona intensidades de ROI en cada punto de tiempo en la carpeta python_files. Las intensidades de fondo podrían representarse por (1) las intensidades medias de las imágenes o (2) las intensidades medias de los ROI sin células activas. ImageJ proporciona métodos para obtener las intensidades medias de las imágenes (haciendo clic en Imagen | Pila | Medir pila) y las intensidades medias de los ROI aleatorios (haciendo clic en Analizar | Herramientas | Gerente de ROI | Multimedida). Si se produce fotoblanqueo durante la obtención de imágenes de calcio, la función de corrección de lejía (haciendo clic en Imagen | Ajustar | Bleach Correction) se puede ejecutar antes de TrackMate.
Finalmente, el registro celular a través de las posiciones z debe incluirse en este flujo de trabajo si se usa TACI para analizar una gran cantidad de neuronas simultáneamente. En consecuencia, es necesario desarrollar una función adicional que organice la información sobre las intensidades de fluorescencia en la estructura de datos requerida por la función MERGE .
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Se utilizó un Zeiss LSM 880 en el Fralin Imaging Center para recopilar los datos de imágenes de calcio. Agradecemos a la Dra. Michelle L Olsen y Yuhang Pan por su ayuda con el software IMARIS. Agradecemos al Dr. Lenwood S. Heath por sus comentarios constructivos sobre el manuscrito y a Steven Giavasis por sus comentarios sobre el archivo README de GitHub. Este trabajo fue apoyado por NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) y NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) a L.N. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt Fill Needel | BD | 303129 | |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Fly food ingredient |
| Carbon dioxide | Airgas | UN1013 | Size 200 High Pressure Steel Cylinder |
| CO2 bubbler kit | Genesee | 59-180 | |
| Confocal microscope LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2. |
| DAQami software | Measurement Computing | ||
| Dextrose | Genesee | 62-113 | Fly food ingredient |
| Drosophila Agar | Genesee | 66-111 | Fly food ingredient |
| Ethanol | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | Fly food ingredient |
| Fly line: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni lab | ||
| Fly line: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| General purpose forged brass regulator | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| Green Drosophila tubing | Genesee | 59-124 | |
| Heat transfer compound | MG Chemicals | 860-60G | |
| Heatsink | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | Resize to 12.9 x 5.5 cm |
| Illuminator | AmScope | LED-6W | |
| Inactive Dry Yeast | Genesee | 62-108 | Fly food ingredient |
| Incubator | Pervical | DR-41VL | Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH. |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Thermo Scientific | 126965000 | Fly food ingrediete |
| Micro cover glass | VWR | 48382-126 | 22 x 40 mm |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| Nail polish | Kleancolor | ||
| Narrow Drosophila vials | Genesee | 32-113RL | |
| Objective | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| Peltier cooling module | TE Technology | TE-127-1.0-0.8 | 30 x 30 mm |
| Plugs | Genesee | 49-102 | |
| Power Supply | Circuit Specialists | CSI1802X | 10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply |
| Princeton Artist Brush Nepture | Princeton Artist Brush Co. | Series 4750, size 2 | |
| Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate | Thermo Scientific | 033241-36 | Fly food ingredient |
| Stage insert | Wienecke and Sinske | 432339-9030-000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | Any stereo microscope works |
| T-Fitting | Genesee | 59-123 | |
| Thermocouple data acquisition device | Measurement Computing | USB-2001-TC | Single channel |
| Thermocouple microprobe | Physitemp | IT-24P | |
| Yellow Cornmeal | Genesee | 62-101 | Fly food ingredient |
| Z-axis piezo stage | Wienecke and Sinske | 432339-9000-000 |
References
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