Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man udfører effektiv adeninbaseredigering uden PAM-begrænsning for at konstruere en præcis zebrafisksygdomsmodel ved hjælp af zSpRY-ABE8e.
Abstract
CRISPR/Cas9-teknologien har øget zebrafiskens værdi til modellering af humane genetiske sygdomme, undersøgelse af sygdomspatogenese og lægemiddelscreening, men begrænsninger i protospacer tilstødende motiv (PAM) er en stor hindring for at skabe nøjagtige dyremodeller af humane genetiske lidelser forårsaget af enkeltnukleotidvarianter (SNV'er). Indtil nu har nogle SpCas9-varianter med bred PAM-kompatibilitet vist effektivitet i zebrafisk. Anvendelsen af den optimerede SpRY-medierede adenindaspaleditor (ABE), zSpRY-ABE8e og syntetisk modificeret gRNA i zebrafisk har muliggjort effektiv adenin-guanin-basekonvertering uden PAM-begrænsning. Her beskrives en protokol til effektiv adeninbaseredigering uden PAM-begrænsning i zebrafisk ved hjælp af zSpRY-ABE8e. Ved at injicere en blanding af zSpRY-ABE8e mRNA og syntetisk modificeret gRNA i zebrafiskembryoner blev en zebrafisksygdomsmodel konstrueret med en præcis mutation, der simulerede et patogent sted for TSR2-ribosommodningsfaktoren (tsr2). Denne metode giver et værdifuldt værktøj til etablering af nøjagtige sygdomsmodeller til undersøgelse af sygdomsmekanismer og behandlinger.
Introduction
Enkeltnukleotidvarianter (SNV'er), der forårsager missense eller nonsensmutationer, er den mest almindelige kilde til mutationer i det humane genom1. For at afgøre, om en bestemt SNV er patogen, og for at kaste lys over dens patogenese kræves præcise dyremodeller2. Zebrafisk er gode modeller for sygdomme hos mennesker, der udviser en høj grad af fysiologisk og genetisk homologi hos mennesker, en kort udviklingscyklus og en stærk reproduktionsevne, hvilket er fordelagtigt for forskning i patogene egenskaber og mekanismer samt lægemiddelscreening3.
Det grupperede regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR)/Cas9-systemet er blevet anvendt i vid udstrækning i genomredigering af forskellige arter, herunder zebrafisk4. Med gRNA-vejledning kan CRISPR/Cas9-systemet generere DNA-dobbeltstrengede brud (DSB'er) på målstedet, som derefter tillader enkeltbasesubstitution gennem rekombination af målstedet med donor-DNA-skabeloner via den homologi-rettede reparationsvej (HDR). Imidlertid er effektiviteten af denne baseudskiftningsmetode ret lav, da den cellulære DNA-reparationsproces hovedsageligt udføres af den ikke-homologe endesammenføjningsvej (NHEJ), som normalt ledsages af insertions- og deletion (indel) mutationer5. Heldigvis afhjælper CRISPR/Cas9-baseret single-base-redigeringsteknologi dette problem betydeligt ved at bruge baseeditorer, som muliggør mere effektiv single-base-redigering uden at inducere DSB'er. To hovedklasser af baseredaktører, adeninbaseeditorer (ABE'er) og cytosinbaseeditorer (CBE'er), er blevet udviklet til at implementere basesubstitutionsredigering for A· T til G· C og C·G til T· A, henholdsvis 6,7,8,9,10,11. Disse fire typer basesubstitutioner dækker 30 % af de humane patogene varianter12. Begge klasser af basisredaktører, herunder PmCDA1, BE-system, CBE4max, ABE7.10 og ABE8e, er blevet rapporteret at fungere i zebrafisk, hvor BE4max og ABE8e især rapporteres at opnå høj redigeringsaktivitet 13,14,15,16,17,18,19.
Cas9-proteiner fra forskellige arter, herunder Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes og S. canis, er blevet implementeret i zebrafiskens genredigering, hvor Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) anvendes mest udbredt 20,21,22,23. SpCas9 kan dog kun genkende målsteder med et NGG-protospacer tilstødende motiv (PAM), hvilket begrænser dets redigerbare rækkevidde og kan resultere i, at der ikke findes nogen passende sekvens nær det patogene sted af interesse24. For at udvide målområdet er en række SpCas9-varianter blevet konstrueret til at genkende forskellige PAM'er gennem styret evolution og strukturstyret design. Imidlertid er få varianter effektive i dyr, især hos zebrafisk, hvilket begrænser anvendelsen af zebrafisk i SNV-relateret sygdomsforskning25,26,27,28. For nylig er to varianter af SpCas9, SpG og SpRY med mindre strenge PAM-begrænsninger (NGN for SpG og NNN for SpRY med en højere præference for NRN end NYN) blevet rapporteret at udvise høj redigeringsaktivitet i humane celler og planter 29,30,31,32. Efterfølgende er SpG og SpRY samt en række af deres medierede baseredaktører, såsom SpRY-medierede CBE'er og SpRY-medierede ABE'er, også rapporteret at arbejde i zebrafisk, hvilket vil forbedre anvendelsen af zebrafiskmodeller i den mekanistiske undersøgelse og lægemiddelscreening af SNV-relaterede sygdomme 18,33,34,35. Desuden blev i-Silence foreslået som en effektiv og præcis gen-knockout-strategi gennem ABE-medieret startkodonkonvertering fra ATG til GTG eller ACG36. Kombinationen af i-Silence-strategien og den SpRY-medierede baseeditor zSpRY-ABE8e giver en ny metode til sygdomsmodellering18. Denne protokol demonstrerer, hvordan man udfører genredigering ved hjælp af zSpRY-ABE8e i zebrafisk for at konstruere en tsr2 (M1V) model ved hjælp af i-Silence-strategien. Redigeringseffektiviteten og fænotyperne, der optræder i zebrafiskmodeller, blev vurderet og analyseret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med retningslinjerne fra Care and Use Committee of the South China Normal University.
1. Fremstilling af syntetisk modificeret gRNA og zSpRY-ABE8e mRNA
- Design gRNA'et ifølge tidligere publikationer37,38.
- Vælg fortrinsvis NRN som PAM-sekvens, da zSpRY-ABE8e viser en højere præference for NRN PAM end NYN PAM (hvor R er A eller G, og Y er C eller T)18. Sørg for, at målet adeninnukleotid er i det meget aktive redigeringsvindue (tredje til niende nukleotid langs protospaceren).
- Bestil EasyEdit sgRNA (EE gRNA) modificeret med 2′-O-methyl-3′-phosphorothioat (MS) i begge ender (figur 1).
BEMÆRK: EE-gRNA'et skal opløses i RNasefrit vand og opbevares ved -80 °C. - Lineariser zSpRY-ABE8e plasmidet18.
- Lineariser 6 μg plasmidet med XbaI-enzymet (materialetabel) i et metalbad ved 37 °C i 3 timer.
- Rens det lineariserede plasmid ved hjælp af DNA-rensningssættet (se materialetabellen) i henhold til producentens anvisninger.
- Transskribere mRNA'et ved hjælp af in vitro-transkriptionssættet (Materialetabel).
- Transskribere zSpRY-ABE8e mRNA med det lineariserede plasmid som skabelon i henhold til producentens anvisninger.
BEMÆRK: Alle operationer, der involverer mRNA og gRNA, kræver brug af RNase-frie laboratorieforsyninger.
- Transskribere zSpRY-ABE8e mRNA med det lineariserede plasmid som skabelon i henhold til producentens anvisninger.
- Brug RNA-rensningssættet (Materialefortegnelse) til at rense mRNA'et i henhold til producentens anvisninger.
BEMÆRK: Før eluering skal ethanolen tørres for at undgå cytotoksicitet, og mRNA'et skal opbevares ved -80 °C, hvis det ikke anvendes straks.
2. Klargøring af mikroinjektionsglaskapillærer
- Opsæt mikropipetteaftrækkersystemet, og forvarm i mindst 30 minutter.
- Kør en rampetest for at bestemme den varmeværdi, der er nødvendig for at smelte borosilikatglaskapillærerne (med 1 mm udvendig diameter og 0,58 mm indvendig diameter) i henhold til producentens anvisninger.
- Vælg et program, og klik på nummeret på tastaturet for at indtaste parameterværdierne. Indstil følgende parametre for at trække glaskapillærerne: varme = rampetestværdi, træk = 50, hastighed = 100, tid = 50 og tryk = 30.
- Installer kapillarrøret, og sørg for, at det er i rillen. Tryk på PULL START/STOP for at køre programmet.
- Bevar de trukne kapillærer ved at indsætte dem i skum, der indeholder huller, og hold nålen suspenderet.
3. Mikroinjektion af zSpRY-ABE8e mRNA og EE gRNA blandingen i zebrafisk embryoner
- Opsæt avlstanke natten før injektionen. Indsæt en skillevæg, placer to hunner og en hanzebrafisk (3-18 måneder gammel) i hver tank, og dæk med låget. Der henvises til tidligere publikationer for kønsdistinktioner39.
BEMÆRK: For at få flere embryoner skal du vælge fisk, der ikke har ynglet i mindst 1 uge. - Næste morgen før injektionen optø zSpRY-ABE8e mRNA og EE gRNA på is. Bland mRNA og gRNA til endelige koncentrationer på henholdsvis 400 ng / μL og 200 ng / μL.
- Udfør hele proceduren på is ved hjælp af RNase-fri spidser og rør, og håndter med handsker.
- Konfigurer den pneumatiske mikroinjektor. Luk luftpumpens partialtrykventil, og åbn først hovedventilen, skru gascylinderen af, og juster partialtrykventilens tryk til 0,2 MPa/29 psi.
- Tænd for den pneumatiske mikroinjektor, indstil tilstanden til TIMER, og juster den indledende parametertrykværdi til 20,0 psi og TIMER-værdien til 0,040 s.
- Brug fine tang til forsigtigt at bryde nålene på de trukne glaskapillærer under et stereomikroskop, og sørg for, at nålene skæres i en vinkel for at lette piercingen af korionen og ægget.
BEMÆRK: Nålens brudpunkt skal være på det rigtige sted og være stærkt nok til at gennembore ægget, men alligevel tyndt nok til at minimere skader på ægget. - Tilsæt blandingen af zSpRY-ABE8e mRNA og gRNA til spidsen af en glaskapillær ved hjælp af en mikroloaderpipettespids, undgå bobler i kapillærrøret. Sæt nålen på mikromanipulatoren, og konfigurer injektorens tryk og TIMER-værdi for at sikre, at der produceres 2 nL blanding pr. injektion ved hjælp af en mikrohætte.
- Tag stikket ud af skillevæggene i avlstankene, og lad fiskene yngle i 10-15 min. Saml æggene ved hjælp af en si, og undersøg cellestadiet og kvaliteten af æggene under et stereomikroskop. Vælg æggene i enkeltcelletilstand til injektion for at forbedre redigeringseffektiviteten.
- Linj æggene på en 1,5% agaroseinjektionsplade, og injicer 2 nL af blandingen i cellen, ikke æggeblommen, af embryonerne under et mikroskop for at forbedre redigeringseffektiviteten. Behold mindst 15 æg som kontrolgruppe.
- Brug 1x E3 buffer til at samle æggene i petriskåle, og læg dem i en inkubator ved 28 °C. Fjern de døde æg, og skift kulturbufferen hver 12. time indtil 48 timer efter befrugtning (hpf).
4. Effektivitetsanalyse af basisredigering med EditR
- Ved 48 hpf samles tre puljer med henholdsvis seks tilfældigt udvalgte injicerede embryoner og seks tilfældigt udvalgte kontrolembryoner i PCR-rør. Brug en pipette til at aspirere den resterende E3-buffer.
- Tilsæt 40 μL 50 mM NaOH i PCR-rørene. Sæt rørene i et metalbad ved 95 ° C i 20 minutter og hvirvel derefter i 15 s.
- Der tilsættes 4 μL 1 M Tris· HCI (pH 8,0) ind i hvert rør for at neutralisere NaOH. Centrifuger kortvarigt ved 2.000 x g i 10 s ved stuetemperatur for at fjerne dråber fra rørvæggen. Supernatanten samles i nye PCR-reagensglas og oplagres ved -20 °C.
- Design passende primere opstrøms og nedstrøms for gRNA-målstederne. Der anvendes 1 μL af ovennævnte supernatant som skabelon for PCR-reaktioner på 50 μL volumen. De primere, der anvendes til PCR i denne undersøgelse, er anført i supplerende tabel 1.
- Udfør en DNA-agarosegelelektroforese for at sikre korrekte og specifikke bånd, efterfulgt af Sanger-sekventering som tidligere beskrevet40.
- Analysér Sanger-sekventeringsdataene med EditR-programmet (1.0.10)41.
- Upload sekventeringsfilen (ab1-format) til feltet "Upload .ab1-fil".
- Indtast 20 bp gRNA-sekvensen i 5′-3′ orientering i feltet "Indtast gRNA-sekvens".
- Åbn sekventeringsfilen (ab1-format), og bekræft basepositionerne, hvor 20 bp gRNA-sekvensen starter og slutter. Indtast den tilsvarende basisposition i felterne "5′ start" og "3′ slut".
- Klik på Forudsagt redigering for at opnå basisredigeringseffektiviteten. Kontroller kvaliteten af sekventeringsdataene nær gRNA-målsekvensen for at undgå uordnede toppe eller indels.
BEMÆRK: Generelt kan de uordnede toppe fjernes effektivt ved at justere PCR-udglødningstemperaturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mutationen af TSR2 er blevet rapporteret at forårsage Diamond Blackfan anæmi (DBA)42. Her blev en DBA zebrafisk model konstrueret med en tsr2 (M1V) mutation ved hjælp af i-Silence strategien. Adenin af zebrafiskens tsr2's startkodon blev med succes omdannet til guanin ved hjælp af zSpRY-ABE8e (figur 3).
EditR-analysen af Sanger-sekventeringsresultaterne viste, at der var en A/G-overlapning ved adeninbasen af tsr2-startkodonet (figur 4).
Efter at F0-grundlæggere blev parret med en tidligere genereret tsr2 heterozygot mutant voksen, blev embryofænotyperne observeret 2 dage efter befrugtning (dpf) under mikroskopet. Flere embryoner udviste en fænotype af mindre øjne og et hævet perikardium sammenlignet med kontroller (figur 5). Embryonerne blev bedøvet med 0,03% Tricaine, fikseret på 4% methylcellulose og fotograferet.
Figur 1: Skematisk diagram over sekvensen og sekundærstrukturen af EE gRNA indlæst i zSpRY-ABE8e protein. De kemisk modificerede nukleotider er mærket med sorte stjerner. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skematisk diagram over zSpRY-ABE8e mRNA-strukturen indeholdende codonoptimeret TadA8e (zTadA8e) og codonoptimeret SpRYCas9 (zSpRYCas9). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Skematisk diagram over zebrafiskens tsr2 (M1V) mutation ved hjælp af zSpRY-ABE8e. PAM-sekvenserne er fremhævet med rødt, de redigerede baser er fremhævet med blåt, og de målrettede aminosyrer er med fed skrift. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Sekventering af kromatogramresultater af zebrafiskens tsr2 (M1V) mutation ved hjælp af zSpRY-ABE8e. X-aksen repræsenterer basissekvensen, y-aksen repræsenterer tophøjden, og den redigerede base er angivet med en rød pilespids. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Fænotype af tsr2 (M1V) embryoner ved 2 dpf sammenlignet med kontroller. (A,C) Set fra siden og (B,D) set fra ryggen af (A,B) vildtype AB-zebrafisk og (C,D) tsr2 (M1V)-embryoner ved 2 dpf. Den røde pilespids i C indikerer perikardial hævelse. Den røde ramme og diameter afspejler øjenstørrelsen. Vægtstang: 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende tabel 1: Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver konstruktionen af en zebrafisksygdomsmodel ved hjælp af basiseditoren zSpRY-ABE8e. Sammenlignet med den traditionelle HDR-vej til basesubstitution kan denne protokol opnå mere effektiv baseredigering og reducere forekomsten af indels. Samtidig indebærer denne protokol implementering af den nyligt foreslåede i-Silence gen-knockout-strategi i zebrafisk. Samlet set vil zSpRY-ABE8e forbedre anvendelsen af zebrafiskmodeller i sygdomsforskning.
Off-target effekter er et almindeligt problem i CRISPR / Cas9 systemer. I betragtning af den PAM-mindre begrænsning kan off-target-effekten af zSpRY-ABE8e være højere, selvom der ikke blev fundet nogen signifikant off-target i en tidligere undersøgelse, herunder tsr2 rettet mod18. Heldigvis kan dette problem undgås ved strenge gRNA-designstandarder, som sikrer, at kun en genomsekvens matcher gRNA'et med PAM nøjagtigt og holder det samlede antal forudsagte off-target-steder på et minimum. Derudover har en undersøgelse vist, at injektionen af ribonukleoprotein (RNP) og gRNA reducerer sandsynligheden uden for målet sammenlignet med injektionen af mRNA og gRNA43. Desuden kan modifikationen af gRNA og Cas9 også reducere off-target effekter44,45. I zebrafisk kan flere generationer af avl også screenes for målfænotyperne for at opnå dyremodeller med lave off-target effekter.
Der er stadig nogle begrænsninger i denne protokol. Selvom zSpRY-ABE8e ikke har nogen PAM-begrænsning, udviser den stadig PAM-præference, hvor NRN foretrækkes frem for NYN i zebrafisk. Desuden kan ABE kun implementere to typer basissubstitution, hvilket betyder, at den kun kan anvendes til konstruktion af delmodeller. Der skal stadig udvikles flere baseeditorer for at implementere de resterende basesubstitutioner i zebrafisk.
Afslutningsvis giver denne protokol detaljeret vejledning til brugen af zSpRY-ABE8e single base editor i zebrafisk. Det giver en gennemførlig og effektiv metode til at konstruere præcise zebrafisksygdomsmodeller, der udvider anvendelsen af zebrafiskmodeller i studier af patogenese og behandling af SNV-relaterede sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Barbara Garbers, ph.d., fra Liwen Bianji (Edanz) for at redigere den engelske tekst til et udkast til dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af nøgleområdets forsknings- og udviklingsprogram i Guangdong-provinsen (2019B030335001), Kinas nationale nøgleforsknings- og udviklingsprogram (2019YFE0106700), National Natural Science Foundation of China (32070819, 31970782) og forskningsfondsprogrammet for Guangdong Provincial Key Lab of Pathogen Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals (PBEA2020YB05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | 1.5% Agarose used to make an injection plate |
| Borosilicate Glass Capillaries | Harvard Apparatus | BS4 30-0016 | |
| Cell culture dishes | Falcon | 351029 | |
| ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit | Vazyme | C115 | Kit for Infusion clone |
| Codon optimization service | Sangon Biotech | ||
| Drummond Microcaps | Drummond Microcaps | P1299-1PAK | Length:32 mm, capacity:0.5 μL |
| EasyEdit gRNA service | GenScript | ||
| Fine Forceps | Fine Scientific Instrument | 11254-20 | Used to break meedle |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | Used to pull the glass capillaries |
| HotStart Taq PCR StarMix | Genstar | A033-101 | Used for PCR reaction |
| Intelligent artificial climate box | TENLIN | PRX-1000A | Used to culture zebrafish embryos |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | Used to fix zebrafish when photographing |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| mMACHINE kit | |||
| Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 | Vazyme | C214-01 | Kit for site-directed mutagenesis |
| Pneumatic Microinjector | ZGene Biotech | ZGPCP-1500 PLUS | |
| pT3TS-zSpCas9 | Addgene | 46757 | |
| RNeasy FFPE kit | Qiagen | 73504 | Kit for RNA purification |
| Sanger Sequencing service | Sangon Biotech | ||
| Sodium hydroxide, granular | Sangon | A100173-0500 | NaOH used for genome extraction |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX10 | Used for photograph of phenotype |
| SZ Series Zoom Stereo Microscope | CNOPTEC | SZ650 | |
| T3 mMESSAGE | Ambion | AM1348 | Kit for in vitro transcription |
| TIANprep Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP103-03 | Kit for plasmid extraction kit |
| TIANquick Mini Purification Kit | TIANGEN | DP203-02 | Kit for purification for linearized plasmid |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Used to anesthetize zebrafish |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sangon | A600194-0500 | Component of Tris·HCl used for genome extraction |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | Restriction endonuclease used for plasmid linearization |
References
- Eichler, E. E., et al. Completing the map of human genetic variation. Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).
- Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
- Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
- Nishida, K., et al. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science. 353 (6305), (2016).
- Gaudelli, N. M., et al. Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application. Nature Biotechnology. 38 (7), 892-900 (2020).
- Liu, Z., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit. Nature Communications. 9, 2717 (2018).
- Levy, J. M., et al. Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses. Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).
- Liu, Z., et al. Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing. Nature Communications. 9, 2338 (2018).
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Research. 44, 862-868 (2016).
- Qin, W., et al. Precise A•T to G•C base editing in the zebrafish genome. BMC Biology. 16 (1), 139 (2018).
- Tanaka, S., et al. In vivo targeted single-nucleotide editing in zebrafish. Scientific Reports. 8, 11423 (2018).
- Carrington, B., Weinstein, R. N., Sood, R. BE4max and AncBE4max are efficient in germline conversion of C:G to T:A base pairs in zebrafish. Cells. 9 (7), 1690 (2020).
- Zhang, Y., et al. Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system. Nature Communications. 8, 118 (2017).
- Rosello, M., et al. Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish. eLife. 10, 65552 (2021).
- Liang, F., et al. SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish. Nature Communications. 13, 3421 (2022).
- Qin, W., Lu, X., Lin, S. Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system. Methods. 150, 19-23 (2018).
- Feng, Y., et al. Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9. G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).
- Liu, Y., et al. Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM. Cells. 10 (8), 2099 (2021).
- Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
- Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13 (2019).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
- Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
- Endo, M., et al. Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM. Nature Plants. 5, 14-17 (2019).
- Li, J., et al. Plant genome editing using xCas9 with expanded PAM compatibility. Journal of Genetics and Genomics. 46 (5), 277-280 (2019).
- Ren, Q., et al. PAM-less plant genome editing using a CRISPR-SpRY toolbox. Nature Plants. 7, 25-33 (2021).
- Xu, Z., et al. SpRY greatly expands the genome editing scope in rice with highly flexible PAM recognition. Genome Biology. 22 (1), 6 (2021).
- Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. 368 (6488), 290-296 (2020).
- Li, J., et al. Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical PAM compatibility in plants. Molecular Plant. 14 (2), 352-360 (2021).
- Vicencio, J., et al. Genome editing in animals with minimal PAM CRISPR-Cas9 enzymes. Nature Communications. 13, 2601 (2022).
- Rosello, M., et al. Disease modeling by efficient genome editing using a near PAM-less base editor in vivo. Nature Communications. 13, 3435 (2022).
- Cornean, A., et al. Precise in vivo functional analysis of DNA variants with base editing using ACEofBASEs target prediction. eLife. 11, 72124 (2022).
- Wang, X., et al. Efficient gene silencing by adenine base editor-mediated start codon mutation. Molecular Therapy. 28 (2), 431-440 (2020).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
- Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
- Kluesner, M. G., et al. EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing. The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).
- Gripp, K. W., et al. Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28. American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).
- Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs. Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).
