Summary
Este protocolo descreve como realizar uma edição eficiente da base de adenina sem limitação de PAM para construir um modelo preciso de doença do peixe-zebra usando zSpRY-ABE8e.
Abstract
A tecnologia CRISPR/Cas9 aumentou o valor do peixe-zebra para modelar doenças genéticas humanas, estudar a patogênese de doenças e triagem de drogas, mas as limitações do motivo adjacente do protoespaçador (PAM) são um grande obstáculo para a criação de modelos animais precisos de doenças genéticas humanas causadas por variantes de nucleotídeo único (SNVs). Até agora, algumas variantes SpCas9 com ampla compatibilidade PAM mostraram eficiência em peixes-zebra. A aplicação do editor de base de adenina (ABE) otimizado mediado por SpRY, zSpRY-ABE8e, e gRNA modificado sinteticamente em zebrafish permitiu uma conversão eficiente da base adenina-guanina sem restrição de PAM. Descrito aqui é um protocolo para edição eficiente de base de adenina sem limitação de PAM em zebrafish usando zSpRY-ABE8e. Injetando uma mistura de mRNA zSpRY-ABE8e e gRNA sinteticamente modificado em embriões de zebrafish, um modelo de doença do peixe-zebra foi construído com uma mutação precisa que simulou um sítio patogênico do fator de maturação do ribossomo TSR2 (tsr2). Este método fornece uma ferramenta valiosa para o estabelecimento de modelos de doença precisos para o estudo de mecanismos e tratamentos de doenças.
Introduction
Variantes de nucleotídeo único (SNVs) que causam mutações missense ou nonsense são a fonte mais comum de mutações no genoma humano1. Para determinar se um determinado SNV é patogênico e esclarecer sua patogênese, modelos animais precisos são necessários2. Os peixes-zebra são bons modelos de doenças humanas, exibindo um alto grau de homologia fisiológica e genética com humanos, um ciclo de desenvolvimento curto e forte capacidade reprodutiva, o que é vantajoso para pesquisas de características e mecanismos patogênicos, bem como triagem de drogas3.
O sistema CRISPR/Cas9 tem sido amplamente aplicado na edição do genoma de várias espécies, incluindo zebrafish4. Com a orientação do gRNA, o sistema CRISPR/Cas9 pode gerar quebras de fita dupla de DNA (DSBs) no local alvo, o que permite a substituição de base única por meio da recombinação do local alvo com modelos de DNA do doador por meio da via de reparo direcionado por homologia (HDR). No entanto, a eficiência desse método de substituição de bases é bastante baixa, uma vez que o processo de reparo do DNA celular é realizado principalmente pela via de junção final não homóloga (NHEJ), que geralmente é acompanhada por mutações de inserção e deleção (indel)5. Felizmente, a tecnologia de edição de base única baseada em CRISPR/Cas9 alivia significativamente esse problema usando editores de base, que permitem uma edição de base única mais eficiente sem induzir DSBs. Duas classes principais de editores de base, editores de base de adenina (ABEs) e editores de base de citosina (CBEs), foram desenvolvidas para implementar a edição de substituição de base para A· T a G· C e C·G para T· A, respectivamente 6,7,8,9,10,11. Esses quatro tipos de substituições de base cobrem 30% das variantes patogênicas humanas12. Ambas as classes de editores base, incluindo PmCDA1, sistema BE, CBE4max, ABE7.10 e ABE8e, têm sido relatadas para trabalhar em peixe-zebra, com BE4max e ABE8e especialmente relatados para atingir alta atividade de edição 13,14,15,16,17,18,19.
Proteínas Cas9 de diferentes espécies, incluindo Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes e S. canis, têm sido implementadas na edição gênica de zebrafish, sendo o Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) o maisutilizado20,21,22,23. No entanto, SpCas9 só pode reconhecer sítios alvo com um motivo adjacente (PAM) do protoespaçador NGG, o que limita sua distribuição editável e pode resultar em nenhuma sequência adequada sendo encontrada perto do sítio patogênico deinteresse24. Para expandir a faixa de destino, uma variedade de variantes SpCas9 foram projetadas para reconhecer diferentes PAMs por meio de evolução direcionada e design guiado por estrutura. No entanto, poucas variantes são eficazes em animais, especialmente em zebrafish, o que limita a aplicação de zebrafish na pesquisa de doenças relacionadas ao SNV25,26,27,28. Recentemente, duas variantes de SpCas9, SpG e SpRY, com restrições menos rigorosas de PAM (NGN para SpG e NNN para SpRY, com maior preferência por NRN do que NYN) foram relatadas exibindo alta atividade de edição em células e plantas humanas 29,30,31,32. Posteriormente, SpG e SpRY, bem como vários de seus editores de base mediada, tais como CBEs mediados por SpRY e ABEs mediados por SpRY, também foram relatados como trabalhando em zebrafish, o que aumentará a aplicação de modelos de zebrafish no estudo mecanístico e triagem de drogas de doenças relacionadas ao SNV 18,33,34,35. Além disso, o i-Silence foi proposto como uma estratégia de nocaute genético eficaz e precisa através da conversão do códon inicial mediada por ABE de ATG para GTG ou ACG36. A combinação da estratégia i-Silence e do editor base mediado por SpRY zSpRY-ABE8e fornece um novo método para modelagem de doenças18. Este protocolo demonstra como realizar a edição gênica usando zSpRY-ABE8e em zebrafish para construir um modelo tsr2 (M1V) usando a estratégia i-Silence. A eficiência de edição e os fenótipos que aparecem nos modelos de zebrafish foram avaliados e analisados.
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Protocol
Este estudo foi conduzido em estrita conformidade com as diretrizes do Comitê de Cuidados e Uso da Universidade Normal do Sul da China.
1. Preparação de gRNA sinteticamente modificado e mRNA zSpRY-ABE8e
- Projetar o gRNA de acordo com publicações anteriores37,38.
- Selecione preferencialmente NRN como a sequência PAM, pois zSpRY-ABE8e mostra uma preferência maior por NRN PAM do que NYN PAM (onde R é A ou G, e Y é C ou T)18. Certifique-se de que o nucleotídeo de adenina alvo esteja na janela de edição altamente ativa (terceiro ao nono nucleotídeo ao longo do protoespaçador).
- Ordem EasyEdit sgRNA (EE gRNA) modificado com 2′-O-metil-3′-fosforotioato (MS) em ambas as extremidades (Figura 1).
NOTA: O gRNA EE deve ser dissolvido em água livre de RNase e armazenado a −80 °C. - Linearizar o plasmídeo zSpRY-ABE8e18.
- Linearizar 6 μg do plasmídeo com a enzima XbaI (Tabela de Materiais) em banho metálico a 37 °C por 3 h.
- Purificar o plasmídeo linearizado utilizando o kit de purificação de ADN (ver Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
- Transcrever o RNAm utilizando o kit de transcrição in vitro (Tabela de Materiais).
- Transcreva o mRNA zSpRY-ABE8e com o plasmídeo linearizado como molde de acordo com as instruções do fabricante.
NOTA: Todas as operações envolvendo mRNA e gRNA requerem o uso de suprimentos laboratoriais livres de RNase.
- Transcreva o mRNA zSpRY-ABE8e com o plasmídeo linearizado como molde de acordo com as instruções do fabricante.
- Use o kit de purificação de RNA (Tabela de Materiais) para purificar o mRNA de acordo com as instruções do fabricante.
NOTA: Antes da elusão, o etanol deve ser seco para evitar citotoxicidade, e o mRNA deve ser armazenado a -80 °C se não for usado imediatamente.
2. Preparação de capilares de vidro de microinjeção
- Configure o sistema extrator de micropipetas e pré-aqueça por pelo menos 30 min.
- Execute um teste em rampa para determinar o valor de calor necessário para derreter os capilares de vidro borossilicato (com 1 mm de diâmetro externo e 0,58 mm de diâmetro interno) de acordo com as instruções do fabricante.
- Selecione um programa e clique no número no teclado para inserir os valores dos parâmetros. Defina os seguintes parâmetros para puxar os capilares de vidro: calor = valor do teste em rampa, tração = 50, velocidade = 100, tempo = 50 e pressão = 30.
- Instale o tubo capilar, garantindo que ele esteja no sulco. Pressione PULL START/STOP para executar o programa.
- Preservar os capilares puxados, inserindo-os em espuma que contenha lacunas, mantendo a agulha suspensa.
3. Microinjeção da mistura de mRNA zSpRY-ABE8e e gRNA EE em embriões de zebrafish
- Monte tanques de reprodução na noite anterior à injeção. Insira um divisor e coloque duas fêmeas e um peixe-zebra macho (3-18 meses de idade) em cada tanque e cubra com a tampa. Consulte publicações anteriores para distinções de gênero39.
NOTA: Para obter mais embriões, selecione peixes que não estejam se reproduzindo há pelo menos 1 semana. - Na manhã seguinte, antes da injeção, descongelar o mRNA zSpRY-ABE8e e o gRNA EE no gelo. Misturar o mRNA e o gRNA até concentrações finais de 400 ng/μL e 200 ng/μL, respectivamente.
- Realizar todo o procedimento no gelo usando pontas e tubos sem RNase, e manusear com luvas.
- Configure o microinjetor pneumático. Feche a válvula de pressão parcial da bomba de ar e abra a válvula principal primeiro, desaparafuse o cilindro de gás e ajuste a pressão da válvula de pressão parcial para 0,2 MPa/29 psi.
- Ligue o microinjetor pneumático, ajuste o modo como TIMER e ajuste o valor de pressão do parâmetro inicial para 20,0 psi e o valor TIMER para 0,040 s.
- Use pinças finas para quebrar cuidadosamente as agulhas dos capilares de vidro puxados sob um estereomicroscópio, certificando-se de que as agulhas sejam cortadas em um ângulo para facilitar a perfuração do córion e do ovo.
NOTA: O ponto de ruptura da agulha precisa estar no lugar certo e ser forte o suficiente para perfurar o ovo, mas fino o suficiente para minimizar os danos ao ovo. - Adicione a mistura de mRNA e gRNA zSpRY-ABE8e à ponta de um capilar de vidro usando uma ponta de pipeta microcarregadora, evitando bolhas no capilar. Conecte a agulha ao micromanipulador e configure a pressão e o valor TIMER do injetor para garantir que 2 nL de mistura sejam produzidos por injeção usando uma microtampa.
- Desconecte as divisórias dos tanques de reprodução e deixe os peixes se reproduzirem por 10-15 min. Colete os ovos usando um filtro e examine o estágio celular e a qualidade dos ovos sob um estereomicroscópio. Selecione os ovos no estado de célula única para injeção para melhorar a eficiência da edição.
- Forre os ovos em uma placa de injeção de agarose a 1,5% e injete 2 nL da mistura na célula, não na gema, dos embriões sob um microscópio para melhorar a eficiência da edição. Reter pelo menos 15 ovos como grupo controle.
- Use 1x tampão E3 para coletar os ovos em placas de Petri e coloque-os em uma incubadora a 28 °C. Retirar os ovos mortos e trocar o tampão de cultura a cada 12 h até 48 horas pós-fertilização (hpf).
4. Análise de eficiência da edição de base com EditR
- A 48 hpf, coletar três pools de seis embriões injetados selecionados aleatoriamente e seis embriões controles selecionados aleatoriamente em tubos de PCR, respectivamente. Use uma pipeta para aspirar o tampão E3 residual.
- Adicionar 40 μL de NaOH 50 mM nos tubos de PCR. Coloque os tubos em um banho de metal a 95 °C por 20 min e, em seguida, vórtice por 15 s.
- Adicionar 4 μL de 1 M Tris· HCl (pH 8,0) em cada tubo para neutralizar o NaOH. Centrifugar brevemente a 2.000 x g por 10 s à temperatura ambiente para remover gotículas da parede do tubo. Recolher o sobrenadante em novos tubos de PCR e armazená-los a -20 °C.
- Projetar primers apropriados a montante e a jusante dos locais de destino do gRNA. Use 1 μL do sobrenadante acima como molde para as reações de PCR de 50 μL de volume. Os primers utilizados para a PCR neste estudo estão listados na Tabela Suplementar 1.
- Realizar eletroforese em gel de DNA agarose para garantir bandas corretas e específicas, seguida de sequenciamento de Sanger conforme descrito anteriormente40.
- Analise os dados de sequenciamento do Sanger com o programa EditR (1.0.10)41.
- Carregue o arquivo de sequenciamento (formato ab1) na caixa "Carregar arquivo .ab1".
- Digite a sequência de gRNA de 20 pb na orientação 5′-3′ na caixa "Enter gRNA sequence".
- Abra o arquivo de sequenciamento (formato ab1) e confirme as posições de base onde a sequência de gRNA de 20 pb começa e termina. Digite a posição base correspondente nas caixas "5′ start" e "3′ end".
- Clique em Edição prevista para obter a eficiência de edição base. Verifique a qualidade dos dados de sequenciamento perto da sequência alvo do gRNA para evitar picos ou indéis desordenados.
NOTA: Em geral, os picos desordenados podem ser efetivamente removidos ajustando a temperatura de recozimento da PCR.
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Representative Results
A mutação do TSR2 tem sido relatada como causadora da anemia de Diamond Blackfan (DBA)42. Aqui, um modelo de zebrafish DBA foi construído com uma mutação tsr2 (M1V) usando a estratégia i-Silence. A adenina do códon inicial do zebrafish tsr2 foi convertida com sucesso em guanina usando zSpRY-ABE8e (Figura 3).
A análise EditR dos resultados do sequenciamento de Sanger mostrou que havia uma sobreposição A/G na base de adenina do códon inicial tsr2 (Figura 4).
Depois que os fundadores da F0 foram acasalados com um adulto mutante heterozigoto tsr2 previamente gerado, os fenótipos embrionários foram observados aos 2 dias pós-fertilização (dpf) ao microscópio. Vários embriões exibiram fenótipo de olhos menores e pericárdio inchado em comparação com controles (Figura 5). Os embriões foram anestesiados com Tricaína a 0,03%, fixados em metilcelulose a 4% e fotografados.
Figura 1: Diagrama esquemático da sequência e estrutura secundária do gRNA EE carregado na proteína zSpRY-ABE8e. Os nucleotídeos quimicamente modificados são marcados com estrelas negras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Diagrama esquemático da estrutura do mRNA zSpRY-ABE8e contendo TadA8e otimizado para códon (zTadA8e) e SpRYCas9 otimizado para códon (zSpRYCas9). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Diagrama esquemático da mutação zebrafish tsr2 (M1V) usando zSpRY-ABE8e. As sequências PAM são destacadas em vermelho, as bases editadas são destacadas em azul e os aminoácidos visados estão em negrito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Resultados do cromatograma de sequenciamento da mutação zebrafish tsr2 (M1V) usando zSpRY-ABE8e. O eixo x representa a sequência de base, o eixo y representa a altura do pico e a base editada é indicada com uma ponta de seta vermelha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Fenótipo dos embriões tsr2 (M1V) a 2 dpf em comparação com os controles. (A,C) A vista lateral e (B,D) dorsal de (A,B) peixe-zebra selvagem AB e (C,D) tsr2 (M1V) embriões a 2 dpf. A cabeça de seta vermelha em C indica edema pericárdico. A moldura vermelha e o diâmetro refletem o tamanho dos olhos. Barra de escala: 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela Suplementar 1: Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Este protocolo descreve a construção de um modelo de doença do zebrafish usando o editor base zSpRY-ABE8e. Em comparação com o caminho HDR tradicional para substituição de base, este protocolo pode alcançar uma edição de base mais eficiente e reduzir a ocorrência de indels. Ao mesmo tempo, este protocolo envolve a implementação da estratégia recentemente proposta de nocaute genético i-Silence em peixes-zebra. Em conjunto, o zSpRY-ABE8e aumentará a aplicação de modelos de peixe-zebra na pesquisa de doenças.
Efeitos fora do alvo são um problema comum em sistemas CRISPR/Cas9. Considerando a restrição sem PAM, o efeito off-target do zSpRY-ABE8e pode ser maior, mesmo que nenhum off-target significativo tenha sido encontrado em um estudo anterior incluindo tsr2 targeting18. Felizmente, esse problema pode ser evitado por padrões rigorosos de projeto de gRNA, que garantem que apenas uma sequência de genoma corresponda exatamente ao gRNA com PAM e mantenha o número total de locais fora do alvo previstos a um mínimo. Além disso, um estudo mostrou que a injeção de ribonucleoproteína (RNP) e gRNA reduz a probabilidade fora do alvo em comparação com a injeção de mRNA e gRNA43. Além disso, a modificação do gRNA e Cas9 também pode reduzir os efeitos fora do alvo44,45. Em peixes-zebra, várias gerações de reprodução também podem ser rastreadas para os fenótipos alvo para obter modelos animais com baixos efeitos fora do alvo.
Ainda existem algumas limitações nesse protocolo. Embora o zSpRY-ABE8e não tenha restrição de PAM, ele ainda exibe preferência por PAM, com NRN preferindo NYN em peixe-zebra. Além disso, a ABE só pode implementar dois tipos de substituição de base, ou seja, só é aplicável à construção de modelos parciais. Mais editores de base ainda precisam ser desenvolvidos para implementar as substituições de base restantes no peixe-zebra.
Em conclusão, este protocolo fornece orientações detalhadas para o uso do editor de base única zSpRY-ABE8e em zebrafish. Ele fornece um método viável e eficiente para construir modelos precisos de zebrafish doença, expandindo a aplicação de modelos de zebrafish em estudos da patogênese e tratamento de doenças relacionadas ao SNV.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos a Barbara Garbers, PhD, de Liwen Bianji (Edanz) pela edição do texto em inglês de um rascunho deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa e Desenvolvimento da Área-Chave da Província de Guangdong (2019B030335001), pelo Programa Nacional de P&&D da China (2019YFE0106700), pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32070819, 31970782) e pelo Programa de Fundo de Pesquisa do Laboratório Chave Provincial de Biologia Patogênica e Epidemiologia para Animais Aquáticos (PBEA2020YB05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | 1.5% Agarose used to make an injection plate |
| Borosilicate Glass Capillaries | Harvard Apparatus | BS4 30-0016 | |
| Cell culture dishes | Falcon | 351029 | |
| ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit | Vazyme | C115 | Kit for Infusion clone |
| Codon optimization service | Sangon Biotech | ||
| Drummond Microcaps | Drummond Microcaps | P1299-1PAK | Length:32 mm, capacity:0.5 μL |
| EasyEdit gRNA service | GenScript | ||
| Fine Forceps | Fine Scientific Instrument | 11254-20 | Used to break meedle |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | Used to pull the glass capillaries |
| HotStart Taq PCR StarMix | Genstar | A033-101 | Used for PCR reaction |
| Intelligent artificial climate box | TENLIN | PRX-1000A | Used to culture zebrafish embryos |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | Used to fix zebrafish when photographing |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| mMACHINE kit | |||
| Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 | Vazyme | C214-01 | Kit for site-directed mutagenesis |
| Pneumatic Microinjector | ZGene Biotech | ZGPCP-1500 PLUS | |
| pT3TS-zSpCas9 | Addgene | 46757 | |
| RNeasy FFPE kit | Qiagen | 73504 | Kit for RNA purification |
| Sanger Sequencing service | Sangon Biotech | ||
| Sodium hydroxide, granular | Sangon | A100173-0500 | NaOH used for genome extraction |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX10 | Used for photograph of phenotype |
| SZ Series Zoom Stereo Microscope | CNOPTEC | SZ650 | |
| T3 mMESSAGE | Ambion | AM1348 | Kit for in vitro transcription |
| TIANprep Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP103-03 | Kit for plasmid extraction kit |
| TIANquick Mini Purification Kit | TIANGEN | DP203-02 | Kit for purification for linearized plasmid |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Used to anesthetize zebrafish |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sangon | A600194-0500 | Component of Tris·HCl used for genome extraction |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | Restriction endonuclease used for plasmid linearization |
References
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