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Biology

Monitorización de la pexofagia mediada por Stub1

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65010
Automatic Translation
1, 1,2
1Institute of Biological Chemistry, Academia Sinica, 2Institute of Biochemical Sciences, College of Life Sciences, National Taiwan University

Summary

Este protocolo proporciona instrucciones para desencadenar y monitorear la pexofagia mediada por Stub1 en células vivas.

Abstract

Las células de mamíferos pueden voltear los peroxisomas a través de la pexofagia mediada por Stub1. La vía potencialmente permite el control celular de la cantidad y calidad de los peroxisomas. Durante este proceso, la proteína de choque térmico 70 y la ubiquitina E3 ligasa, Stub1, se translocan en los peroxisomas para ser volteados para iniciar la pexofagia. La actividad de la ligasa Stub1 permite la acumulación de ubiquitina y otros módulos relacionados con la autofagia en peroxisomas específicos. La elevación de los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) dentro de la luz peroxisomal puede activar la pexofagia mediada por Stub1. Por lo tanto, se puede utilizar la generación de ROS asistida por colorante para desencadenar y monitorear esta vía. Este artículo describe los procedimientos para usar dos clases de colorantes, proteínas fluorescentes y fluoróforos sintéticos, para iniciar la pexofagia dentro de cultivos celulares de mamíferos. Estos protocolos basados en la generación de ROS asistidos por colorante no solo se pueden usar para atacar todos los peroxisomas dentro de una población celular a nivel mundial, sino que también pueden permitir la manipulación de peroxisomas individuales dentro de células individuales. También describimos cómo se puede seguir la pexofagia mediada por Stub1 utilizando microscopía de células vivas.

Introduction

Los peroxisomas son orgánulos unidos a una sola membrana presentes en la mayoría de las células eucariotas. Los peroxisomas son un compartimento metabólico esencial para llevar a cabo la beta-oxidación de ácidos grasos de cadena muy larga, catabolismo de purina y síntesis de fosfolípidos y ácidos biliareséter 1. La acetil-CoA derivada de peroxisomas controla la homeostasis lipídica regulando la señalización central en el metabolismo2. Por lo tanto, no es de extrañar que las funciones peroxisomales comprometidas estén implicadas en diversas enfermedades, incluyendo trastornos neurodegenerativos, envejecimiento, cáncer, obesidad y diabetes 3,4,5. Un proceso esencial en el mantenimiento de la operación peroxisomal es la pexofagia. La pexofagia es un proceso catabólico para el recambio selectivo de peroxisomas por autofagia. Las células utilizan la pexofagia para ayudar a controlar la cantidad y calidad de los peroxisomas, asegurando así una función peroxisomal adecuada. Un estudio reciente demostró que la pérdida de peroxisomas causada por mutaciones en los factores de biogénesis peroxisomal PEX1 1 y 6 resulta de la pexofagia no controlada6. En particular, el 65% de todos los pacientes con trastorno de biogénesis de peroxisomas (PBD) albergan deficiencias en el complejo ATPasa AAA peroxisomal, compuesto por PEX1, PEX6 y PEX26 en células de mamíferos7.

Se pueden utilizar varios métodos para iniciar y estudiar la pexofagia. En la levadura, la pexofagia se desencadena cuando los nutrientes suministrados se cambian de fuentes de carbono dependientes del peroxisoma a fuentes de carbono independientes del peroxisoma (para reducir el número de peroxisomas celulares)8. Por ejemplo, la transferencia de células de Pichia pastoris cultivadas con metanol del medio metanol al medio de glucosa y al medio de etanol induce micropexofagia y macropexofagia, respectivamente 8,9,10. Los secuestros de micropexofagia agrupan los peroxisomas para su degradación mediante la remodelación de la vacuola para formar membranas de secuestro vacuolar en forma de copa y una estructura similar a una tapa denominada aparato de membrana específico de micropexofagia (MIPA). En la macropexofagia, los peroxisomas individuales son engullidos por estructuras de doble membrana conocidas como pexofagosomas, seguidas de fusión con la vacuola para la degradación 8,9,10. La fosforilación de receptores de pexofagia, como Atg36p en Saccharomyces cerevisiae y Atg30p en Pichia pastoris, es crítica para que los receptores recluten maquinaria central de autofagia y faciliten la orientación peroxisomal a los autofagosomas 8,11.

En las células de mamíferos, la pexofagia puede ser inducida por ubiquitinación. El marcado de las proteínas de membrana peroxisomal PMP34 o PEX3 con ubiquitina en el lado citosólico induce pexofagia12. La sobreexpresión de PEX3 induce la ubiquitinación de los peroxisomas y la eliminación de los peroxisomas por los lisosomas13. Además, la fusión de PEX5 con un EGFP C-terminal perjudica la exportación de PEX5 monoubiquitinado y da lugar a pexofagia14. Por otro lado, la pexofagia también puede ser desencadenada por el tratamiento conH2O2. Los peroxisomas producen especies reactivas de oxígeno (ROS); específicamente, la enzima peroxisomal Acox1, que cataliza el paso inicial de la beta-oxidación de ácidos grasos de cadena muy larga (> 22 carbono), produce no solo acetil-CoA sino también ROS peroxisomal. En respuesta a los niveles elevados de ROS bajo el tratamiento conH2O2, las células de mamíferos activan la pexofagia para reducir la producción de ROS y aliviar el estrés. Se ha informado que el tratamiento conH2O2impulsa el reclutamiento de ataxia-telangiectasia mutada (ATM) a peroxisomas. ATM luego fosforila PEX5 para promover el recambio peroxisomal por pexofagia15.

Dado que los peroxisomas son centros generadores de ROS, también son propensos al daño de ROS. Las lesiones peroxisomales provocadas por ROS obligan a las células a activar la pexofagia para iniciar las vías de control de calidad del peroxisoma (eliminación del peroxisoma dañado por autofagia). Aquí, describimos un enfoque para el desencadenamiento a demanda de la lesión peroxisomal provocada por ROS. El protocolo aprovecha la producción de ROS activadas por luz dentro de los orgánulos 16,17,18,19,20 (Figura 1). Los peroxisomas marcados con colorante se iluminan, lo que lleva a la producción de ROS dentro de la luz peroxisomal, lo que desencadena específicamente la lesión peroxisomal. Usando este protocolo, se muestra que los peroxisomas estresados por ROS se eliminan a través de una vía de degradación dependiente de ubiquitina. Los peroxisomas estresados por ROS reclutan la ubiquitina E3 ligasa Stub1 para permitir su inmersión en autofagosomas para su eliminación individual por pexofagia16. Se puede usar este protocolo para comparar el destino de los peroxisomas lesionados y sanos dentro de la misma célula mediante microscopía de lapso de tiempo. El método también se puede utilizar para dañar globalmente todos los peroxisomas (en todas las células) en una placa de cultivo, lo que permite el análisis bioquímico de la vía de pexofagia.

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Protocol

1. Preparación de células que expresan diKillerRed o proteínas automarcantes (SLP) en la luz del peroxisoma

  1. Siembra las células deseadas en placas de cultivo celular con fondo de vidrio. Para el experimento aquí, sembrar 2 x 105 células SHSY5Y humanas en 840 μL de medio de cultivo (DMEM / F-12 suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina / estreptomicina) o 6 x 10 4 células NIH3T3de ratón en 840 μL de medio de cultivo (DMEM suplementado con 10% de suero bovino y 1% de penicilina/estreptomicina) en una placa de cultivo de 35 mm con un micropocillo de vidrio de 20 mm de diámetro.
    NOTA: El número de células sembradas debe ajustarse proporcionalmente de acuerdo con el área del micropocillo de vidrio cuando se utilizan platos con fondo de vidrio de otras especificaciones.
  2. Cultivar las células por debajo de 5% de CO2/37 °C durante 24 h.
  3. Transfectar las células con los plásmidos deseados utilizando un reactivo de transfección.
    1. Utilice PMP34-TagBFP para marcar los peroxisomas en células vivas. Utilice diKillerRed-VKSKL dirigido a peroxisomas o SLP-VKSKL (+ ligandos SLP marcados con colorante) para la generación de ROS en la luz del peroxisoma (a través de la producción de ROS activada por luz). En este protocolo, utilizamos la proteína autoetiquetante HaloTag-VKSKL21. Para monitorizar la translocación de Stub1/Hsp70, la acumulación de proteínas ubiquitinadas y la formación de autofagosomas en peroxisomas estresados por ROS, transfectar EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-Ub o EGFP-LC3B, respectivamente. Para comprobar la generación de ROS en la luz peroxisomal, co-transfecte diKillerRed-VKSKL con la sonda redox fluorescente localizada en peroxisomas roGFP2-VKSKL22.
    2. Para la transfección de células SHSY5Y, diluir plásmidos en 55 μL de DMEM/F-12 sin suero y diluir 1 μL de reactivo de transfección en 55 μL de DMEM/F12 sin suero. Combine el ADN diluido con el reactivo diluido. Mezclar suavemente e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
    3. Añadir el complejo al micropocillo de 20 mm previamente chapado con 100 μL de medio de cultivo para SHSY5Y sin antibióticos (DMEM/F-12 con 10% de suero fetal bovino). Agite suavemente el plato hacia adelante y hacia atrás.
    4. Para la transfección celular NIH3T3, sustituya el DMEM/F-12 sin suero por un medio sérico reducido para diluir los plásmidos y el reactivo de transfección. Sustituir el medio de cultivo de recubrimiento por SHSY5Y por medio de cultivo para células NIH3T3 sin antibióticos (DMEM con 10% de suero bovino).
  4. Después de 2 h de transfección, retire el medio que contiene el reactivo de transfección y agregue 1 ml de medio de cultivo fresco. Incubar las células NIH3T3 o SHSY5Y a 37°C y 5% deCO2 durante 24 h.
    NOTA: También se pueden usar otras líneas celulares para estudiar la pexofagia mediada por Stub1 (por ejemplo, células HeLa).

2. Tinción de peroxisomas con ligandos SLP marcados con colorante (para la producción de ROS activadas por luz)

  1. A las 24 h después de la transfección, retirar el medio de cultivo y añadir 100 μL de ligando HaloTag TMR de 200 nM o 200 nM del ligando Janelia Fluor 646 HaloTag al micropocillo de vidrio de 20 mm.
    NOTA: Los ligandos SLP marcados con colorante deben diluirse con el medio de cultivo respectivo para cada línea celular. La elección de los ligandos marcados con Janelia Fluor 646 liberará los canales azul, verde y rojo para obtener imágenes de fluorescencia aguas abajo.
  2. Transfiera el plato a una incubadora de 37 ° C, 5% de CO2 . Mancha durante 1 h. Después de 1 h, retire bien el medio de tinción y agregue 1 ml de medio de cultivo fresco.

3. Estrés ROS de peroxisomas en un microscopio confocal de barrido láser

  1. Coloque un plato con fondo de vidrio que contenga las células deseadas en un microscopio confocal de escaneo láser equipado con una incubadora de etapa.
  2. Haga clic en Ventana de herramientas, elija Ocular y haga clic en el botón DIA (Figura 2A) para encender la luz transmitida. Vea el plato a través del ocular del microscopio y enfoque las células girando la perilla de enfoque.
  3. Elija LSM y haga clic en el botón Dye & Detector Select (Selección de tinte y detector ) (Figura 2B). Haga doble clic en los tintes deseados en la ventana emergente para seleccionar la configuración adecuada de láser y filtro para obtener imágenes de las células (Figura 2C). Haga clic en Livex4 en el panel Live para iniciar un escaneo láser rápido para comenzar a detectar las señales de fluorescencia de las células (Figura 2D).
  4. Mueva el escenario con el controlador del joystick y localice las células medianas que expresan diKillerRed-VKSKL o SLP-VKSKL para aplicar tensión ROS (en los peroxisomas). Adquirir una imagen de la célula deseada.
  5. Haga clic en Ventana de herramientas y elija Estimulación LSM (Figura 2E). Haga clic en el botón de elipse y, en la ventana de imagen en vivo, use el mouse para dibujar un ROI circular de 15 μm de diámetro (Figura 2F) que contenga los peroxisomas deseados adquiridos en el paso 3.4 a los que se aplicará tensión ROS (consulte la Figura 3 para ver un ejemplo).
  6. Para aplicar estrés ROS, use 561 nm para células con el ligando SLP marcado con diKillerRed-PTS1 o TMR, y use 640 nm para células teñidas con el ligando SLP marcado con Janelia Fluor 646.
  7. Seleccione la longitud de onda del láser para aplicar la tensión ROS. Introduzca el porcentaje de láser deseado y la duración (Figura 2G).
  8. Haga clic en Adquirir y haga clic en el botón Estimulación (Figura 2H) para iniciar el escaneo con luz de 561/640 nm a través de los ROI durante 30 s cada uno. Esto corresponde a un ajuste de potencia láser de ~ 5% para 561 nm y 640 nm en el microscopio confocal utilizado aquí. Esta operación conducirá a la producción de ROS en los peroxisomas.
    NOTA: Uno puede seleccionar ROI de diferentes tamaños. Uno debe ajustar proporcionalmente el tiempo de iluminación para cada ROI de acuerdo con su área.
  9. Después de 30 s de iluminación láser, los peroxisomas dentro de los ROI habrán perdido sus señales diKillerRed-PTS1 / TMR / Janelia Fluor 646. Esta pérdida de señal permite distinguir los peroxisomas iluminados de los no iluminados (dañados vs. sanos) dentro de una célula.

4. Monitorización de la pexofagia en células vivas mediante imágenes de lapso de tiempo

  1. Siga la translocación de Stub1, Hsp70, Ub, p62 o LC3B marcados con EGFP en los peroxisomas iluminados/estresados por ROS mediante imágenes de lapso de tiempo utilizando intervalos de 10 minutos entre fotogramas (para ejemplos, consulte las Figuras 3-7).
    NOTA: Las señales EGFP-Stub1 o EGFP-Hsp70 comienzan a aparecer 10-20 minutos después de la iluminación y permanecen en todos los peroxisomas dañados hasta ~ 40 minutos después de la iluminación. Las señales EGFP-Ub aparecen 30 minutos después de la iluminación y duran 2-3 h. La translocación EGFP-p62 aparece 60 minutos después de la iluminación, y las señales EGFP-LC3B se hacen visibles ~ 3 h después de la iluminación.
  2. Cuantifique las señales EGFP en los peroxisomas dañados (de Stub1, Ub, p62 o LC3B) utilizando ImageJ. Realice los pasos siguientes para usar ImageJ para cuantificar una imagen de tres canales (PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL).
    1. Abra la imagen y aplique selecciones elípticas o selecciones a mano alzada para encerrar la región que contiene todos los peroxisomas iluminados (señal positiva PMP34-TagBFP y señal de ligando HaloTag blanqueada; Figura 8A).
    2. Haga clic en Duplicar para seleccionar el canal PMP34-TagBFP (Figura 8A). Establezca un umbral usando el menú desplegable Imagen > Ajustar > umbral para marcar los peroxisomas (Figura 8B).
    3. Seleccione Analizar > Analizar partículas para determinar las regiones exactas de los peroxisomas iluminados. ImageJ registra estas regiones de interés (ROI) en el administrador de ROI (Figura 8C).
    4. Haga clic en Duplicar para seleccionar el canal EGFP para analizar la señal de fluorescencia de Ub, p62 o LC3B conjugada con EGFP (Figura 8D). Seleccione todos los ROI en el Administrador de ROI (Figura 8E).
    5. Aplicar medida en el ROI Manager para medir las señales de EGFP en los peroxisomas (Figura 8E). Encuentra el valor del área y la densidad integrada (la suma de todas las intensidades de píxeles) para cada ROI en la tabla Resultados (Figura 8E).
    6. Para obtener las intensidades medias de fluorescencia de EGFP en diferentes puntos de tiempo después de la iluminación, divida la intensidad de EGFP integrada por el área total de peroxisomas iluminados (PMP34-TagBFP señal positiva y áreas negativas de señal de ligando HaloTag). Para obtener la señal acumulada en los peroxisomas, reste la intensidad promediada en un punto de tiempo por la intensidad promediada en el tiempo = 0, y luego normalice por la intensidad promedio en el tiempo = 0.

5. Dañar globalmente todos los peroxisomas (en cada célula) en una placa de cultivo

  1. Realice el paso 1 (preparación de células que expresan diKillerRed dirigido a peroxisomas [diKillerRed-VKSKL] o SLP [SLP-VKSKL]) y el paso 2 (tinción de peroxisomas con el ligando SLP [para la producción de ROS activadas por luz]).
  2. Después de 1 h de tinción con ligando marcado con TMR, retire el medio de tinción y agregue 1 ml de medio de cultivo que contenga 30 mM 3-AT (3-amino-1,2,4-triazol; un inhibidor de la catalasa).
    NOTA: La catalasa es un eliminador de ROS expresado en la luz del peroxisoma, por lo que el tratamiento con 3-AT ayuda a aumentar el daño oxidativo provocado por la luz en los peroxisomas.
  3. Coloque la placa de cultivo sobre un LED (555-570 nm). Iluminar todas las celdas con una densidad de potencia de 1,8 W/cm2 durante 9 h en una incubadora.
    NOTA: Para realizar este paso fuera de una incubadora, coloque la placa de cultivo en una placa calefactora de 37 °C. Agregue 20 mM HEPES al medio que contiene 3-AT y cubra el plato de cultivo con una película transparente para minimizar el intercambio de gases. HEPES es un agente amortiguador que mantiene el pH fisiológico en cultivo celular fuera de una incubadora deCO2 durante la iluminación LED.
  4. Valide el éxito del daño provocado por LED mediante la obtención de imágenes de las señales EGFP-Ub, EGFP-p62 o EGFP-LC3B en los peroxisomas. Usando la condición de iluminación descrita anteriormente, el 82% de las células SHSY5Y que expresan de manera estable HaloTag-VKSKL mostraron pexofagia mediada por Stub1.
  5. Cosechar las células para el análisis bioquímico posterior.

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Representative Results

El esquema de inducción de pexofagia mediado por Stub1 que se muestra aquí aprovecha la generación de ROS asistida por colorante dentro de la luz del peroxisoma. Esta operación requiere intensidades de luz mínimas. Por lo tanto, los peroxisomas que contienen proteínas o colorantes fluorescentes pueden iluminarse utilizando microscopios confocales estándar de barrido láser. La iluminación focal conduce a la producción instantánea y localizada de ROS dentro de los peroxisomas individuales, como lo indica el reportero fluorescente roGFP2-VKSKL (Figura 9). No se obtuvieron imágenes de diKillerRed-VKSKL en las mediciones de roGFP2-VKSKL para evitar la generación adicional de ROS durante la obtención de imágenes. La imagen inferior derecha de diKillerRed-VKSKL en la Figura 9 se tomó después de que se realizaron todas las mediciones de roGFP2-VKSKL para indicar claramente dónde estaban13 los peroxisomas dañados. Los datos también muestran que los peroxisomas no iluminados no se ven afectados, lo que indica la precisión de la metodología. ROS conduce a la oxidación de una pequeña fracción de moléculas residentes de peroxisomas, lo que lleva a la disfunción del peroxisoma. Esta operación aguda permite sondear las diversas vías de control de calidad del peroxisoma de manera robusta.

Pudimos usar esta metodología para monitorear la pexofagia mediada por Stub1. En la pexofagia mediada por Stub1, Hsp70 recluta Stub1 en peroxisomas estresados por ROS para iniciar el recambio de peroxisomas por autofagia. Durante este proceso, Hsp70, Stub1, proteínas ubiquitinadas, adaptador de autofagia p62 y LC3B aparecen secuencialmente en peroxisomas estresados por ROS para impulsar la pexofagia (Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6 , Figura 7)13. A través de imágenes de lapso de tiempo, fue posible seguir el momento y el orden del reclutamiento de estos factores críticos en la pexofagia. Al utilizar la metodología para lesionar los peroxisomas focalmente, pudimos demostrar fácilmente que la maquinaria Hsp70 / Stub1 se dirige específicamente a los peroxisomas dañados (pero no a los funcionales). Además de provocar la producción de ROS dentro de peroxisomas individuales, fue posible utilizar la misma estrategia para dañar simultáneamente todos los peroxisomas en una placa de cultivo para la caracterización bioquímica de la pexofagia mediada por Stub1 (Figura 10).

Figure 1
Figura 1: Esquema para la producción de ROS activadas por luz en peroxisomas. (A) Esquema de cómo desencadenar la generación de ROS peroxisomales por luz. Los colorantes como los dímeros tándem KillerRed o los ligandos fluorescentes SLP se dirigen a los peroxisomas mediante el uso de secuencias dirigidas a peroxisomas (VKSKL). (B) El 3-AT inhibe la catalasa y se puede utilizar junto con el esquema que se muestra aquí para aumentar los niveles de ROS en la luz peroxisomal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Uso de un microscopio confocal para activar la producción de ROS en peroxisomas. (A) Captura de pantalla para el paso 3.2 en el protocolo. (B-D) Capturas de pantalla para el paso 3.3 en el protocolo. (E-F) Capturas de pantalla para el paso 3.5 en el protocolo. (G) Captura de pantalla para el paso 3.7 en el protocolo. (H) Captura de pantalla para el paso 3.8 en el protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Translocación de EGFP-Stub1 en peroxisomas estresados por ROS. Las células SHSY5Y se transfectaron con HaloTag-VKSKL, PMP34-TagBFP y EGFP-Stub1. Un día después de la transfección, las células se tiñeron con el ligando HaloTag TMR a 37°C (200 nM, 1 h). Aquí se muestran los datos de una de las celdas de este ejemplo. (A) La región circular blanca en esta celda fue seleccionada para una iluminación de 561 nm. (B) Los peroxisomas iluminados en la región circular blanca perdieron inmediatamente su fluorescencia TMR. (C) EGFP-Stub1 translocado sobre los peroxisomas iluminados a t = 20 min. Recuadros superiores izquierdos: vista ampliada de las regiones cuadradas blancas. Todas las barras de escala: 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Reclutamiento de EGFP-Hsp70 por peroxisomas estresados por ROS. Los peroxisomas en las células SHSY5Y que expresan HaloTag-VKSKL, PMP34-TagBFP y EGFP-Hsp70 se tiñeron con 200 nM de ligando HaloTag TMR durante 1 h. Aquí se muestran los datos de una de las celdas de este ejemplo. (A) La región circular blanca en la celda fue sometida a una iluminación de 561 nm. (B) Los peroxisomas iluminados en esta región iluminada perdieron inmediatamente su fluorescencia TMR debido al fotoblanqueo. (C) EGFP-Hsp70 translocado a los peroxisomas iluminados 20 min después. Recuadros inferiores derechos: vista ampliada de las regiones cuadradas blancas. Todas las barras de escala: 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Imágenes de lapso de tiempo de la acumulación de proteínas ubiquitinadas en peroxisomas estresados por ROS. (A) Después de 1 h de tinción del ligando HaloTag TMR, los peroxisomas dentro de la región circular blanca en una célula SHSY5Y que expresaba EGFP-Ub, PMP34-TagBFP y HaloTag-VKSKL se iluminaron con 561 nm. (B) La fluorescencia TMR dentro de la región se blanqueó después de la iluminación. EGFP-Ub posteriormente se acumuló específicamente sobre los peroxisomas iluminados (t = 40 min y 2 h después de la iluminación de 561 nm). Recuadros inferiores derechos: vista ampliada de las regiones cuadradas blancas en (C). Todas las barras de escala: 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Acumulación del adaptador de autofagia p62 en peroxisomas estresados con ROS . (A) La región circular blanca en una célula SHSY5Y que expresa EGFP-p62, PMP34-TagBFP y HaloTag-VKSKL (teñida con el ligando HaloTag TMR; 200 nM, 1 h) se iluminó con luz de 561 nm. (B) La iluminación causó la pérdida inmediata de las señales TMR en los peroxisomas objetivo. (C) A las 2,5 h después de la iluminación, los peroxisomas reclutaron EGFP-p62. Recuadros superiores derechos: vistas ampliadas de las regiones cuadradas blancas en (C). Todas las barras de escala: 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Translocación de EGFP-LC3B en peroxisomas estresados con ROS. (A) Después de la tinción del ligando HaloTag TMR (200 nM, 1 h), una célula SHSY5Y que expresa EGFP-LC3B, PMP34-TagBFP y HaloTag-VKSKL se iluminó con 561 nm dentro de la región circular blanca. (B) Después de la iluminación, la señal TMR de los peroxisomas en la región circular blanca se blanqueó. (C) A las 3,5 h después de la iluminación, EGFP-LC3B translocado sobre los peroxisomas estresados por ROS. Recuadros superiores derechos: vistas ampliadas de las regiones cuadradas blancas en (C). Todas las barras de escala: 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Cuantificación de las señales de fluorescencia en peroxisomas dañados usando ImageJ . (A) Captura de pantalla para el paso 4.2.1 y el paso 4.2.2 en el protocolo. (B) Captura de pantalla para el paso 4.2.2 en el protocolo. (C) Captura de pantalla de los pasos 4.2.3 en el protocolo. (D) Captura de pantalla para el paso 4.2.4 en el protocolo. (E) Captura de pantalla para los pasos 4.2.4 y 4.2.5 en el protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Producción de ROS activadas por luz dentro de peroxisomas individuales. La sonda redox localizada en peroxisomas roGFP2-VKSKL se utilizó para validar la producción de ROS activada por luz dentro de los peroxisomas objetivo. Los peroxisomas dentro de la región circular blanca de una célula NIH3T3 que expresan diKillerRed-VKSKL y roGFP2-VKSKL se iluminaron con luz de 561 nm, y estos se muestran (A) antes de la iluminación de luz de 561 nm y (B) después de la iluminación de luz de 561 nm. Izquierda: emisión roGFP2-VKSKL con excitación de 405 nm (magenta); medio: emisión roGFP2-VKSKL con excitación de 488 nm (verde). La relación de la señal de emisión roGFP2-VKSKL excitada por 405 nm (magenta) sobre la señal de emisión excitada por 488 nm (verde) rastrea los niveles de ROS dentro de los peroxisomas. La región circular blanca en (B) muestra la pérdida inmediata de la emisión diKillerRed-VKSKL después de una iluminación de 561 nm. Todas las barras de escala: 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 10
Figura 10: Daño global de todos los peroxisomas en una placa de cultivo. Las células SHSY5Y que expresaban HaloTag-VKSKL, EGFP-Ub y PMP34-TagBFP se tiñeron con el ligando HaloTag TMR durante 1 h. (A) Antes de la iluminación LED, la fluorescencia EGFP-Ub era homogénea en el citoplasma y no colocalizaba con los peroxisomas (marcados por el ligando HaloTag TMR y PMP34-TagBFP). (B) Después de 9 h de iluminación LED, la señal EGFP-Ub se acumuló en todos los peroxisomas en las células cultivadas en una placa confocal, como se indica en los dos paneles en (B). Todas las barras de escala: 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo detalla cómo desencadenar la pexofagia mediada por Stub1 dentro de cultivos celulares elevando los niveles de ROS peroxisomales con luz. Como el protocolo se basa en la generación de ROS asistida por colorante, es necesario garantizar una expresión suficiente de diKillerRed-VKSKL o tinción de ligando SLP marcada con colorante dentro de las células de interés. Dado que diferentes tipos de células o células de diferentes antecedentes genéticos pueden albergar peroxisomas con propiedades ligeramente diferentes, es posible que sea necesario ajustar las condiciones exactas de iluminación para garantizar la inducción de la pexofagia. Una medida robusta para detectar la activación de la pexofagia mediada por Stub1 es monitorear si EGFP-Ub se transloca sobre los peroxisomas iluminados (1 h después de la iluminación)13. En las células sanas, las señales de EGFP-Ub generalmente se distribuyen uniformemente en el citoplasma. Su translocación sobre peroxisomas iluminados es, por lo tanto, fácil de observar. Para optimizar la condición de iluminación, se puede alterar la intensidad de la luz o el tiempo de iluminación. También es mejor evitar la iluminación excesiva de los tintes cuando se trata de dañar los peroxisomas, ya que algunos pueden someterse a procesos fotoquímicos que pueden interferir con las imágenes posteriores. Por ejemplo, se ha demostrado que la sobreiluminación de KillerRed puede hacer que se vuelva débilmente verde fluorescente. La sobreiluminación genera señales verdes débiles en los peroxisomas iluminados inmediatamente después de la iluminación23 (a diferencia de la translocación de los reporteros basados en EGFP, que puede tardar de decenas de minutos a horas en ocurrir).

La metodología permite a los investigadores utilizar microscopios confocales estándar de escaneo láser para dañar una fracción de peroxisomas dentro de una célula, lo que permite comparaciones directas de la diferencia en el destino entre los peroxisomas sanos y dañados. En comparación con los métodos existentes, el protocolo aquí causa estrés ROS a solo una pequeña porción de los peroxisomas en lugar de todos los peroxisomas u otros orgánulos en las células. Por lo tanto, es factible estudiar el efecto de los peroxisomas sanos restantes en la pexofagia de los peroxisomas estresados por ROS en la misma célula.

A través de la iluminación de un plato completo, también es posible apuntar a todos los peroxisomas dentro de un cultivo celular, lo que permite el análisis bioquímico de la pexofagia mediada por Stub1. Cómo Hsc70/Stub1 reconoce los peroxisomas dañados y qué sustratos peroxisomales ubiquitina Stub1 son preguntas que se pueden explorar utilizando este protocolo. En términos más generales, el protocolo de deterioro del peroxisoma también se puede utilizar para investigar otras vías de control de calidad del peroxisoma. Dado que los peroxisomas están íntimamente conectados a muchos orgánulos celulares diferentes dentro de la célula, incluido el retículo endoplásmico, las mitocondrias y las gotas de lípidos, también sería interesante investigar cómo las células modulan sistemáticamente los comportamientos de todas las estructuras celulares en respuesta al deterioro del peroxisoma.

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Disclosures

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado en parte por una beca de investigación MOST 111-2311-B-001-019-MY3 del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de Taiwán.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell  MatTek P35G-1.5-20-C 20 mm glass bottomed
3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) Sigma Aldrich A8056
bovine serum ThermoFisher Scientific 16170060
Cell culture incubator Nuaire NU-4750
diKillerRed-PTS1 Academia Sinica made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL)
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ThermoFisher Scientific 11965092
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) ThermoFisher Scientific 11330032
EGFP-C1 Clontech pEGFP-C1 The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62
EGFP-Hsp70 Academia Sinica Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1
EGFP-LC3B Addgene 11546
EGFP-p62 Academia Sinica generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1
EGFP-Stub1 Academia Sinica generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1
EGFP-Ub Addgene 11928
fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10437028
HaloTag TMR ligand  Promega G8252
HaloTag-PTS1 Academia Sinica PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone
HEPES ThermoFisher Scientific 15630080
Inverted Confocal Microscope  Olympus FV3000RS 405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,  microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment
Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand Promega GA1120
LED VitaStar PAR64 80 W, 555-570 nm
lipofectamine 2000  ThermoFisher Scientific 11668 transfection reagent
NIH3T3 cell ATCC CRL-1658 adherent
Opti-MEM ThermoFisher Scientific 319850 reduced serum media
penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15140
PMP34-TagBFP Academia Sinica PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171)
roGFP2-PTS1 Academia Sinica generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1
SHSY5Y cell ATCC CRL-2266 adherent

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References

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Biología Número 195 Pexofagia peroxisomas Hsc70 Stub1 autofagia ROS
Monitorización de la pexofagia mediada por Stub1
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Chen, B. H., Yang, W. Y. Monitoring… More

Chen, B. H., Yang, W. Y. Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy. J. Vis. Exp. (195), e65010, doi:10.3791/65010 (2023).

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