Summary
הפרוטוקול הנוכחי מבסס מודל הישנות גליובלסטומה (GBM) לאחר כריתה באמצעות מיקרוסקופיה כדי לחקור את ההשפעה הטיפולית של הידרוג'ל in vivo הניתן להזרקה, המגיב ביולוגית.
Abstract
הישנות הגידול היא גורם חשוב המעיד על פרוגנוזה גרועה בגליובלסטומה (GBM). מחקרים רבים מנסים לזהות אסטרטגיות טיפוליות יעילות למניעת הישנות GBM לאחר ניתוח. הידרוג'לים טיפוליים מגיבים ביולוגית המסוגלים לקיים תרופות בשחרור מקומי משמשים לעתים קרובות לטיפול מקומי בגליובלסטומה לאחר ניתוח. עם זאת, המחקר מוגבל בשל היעדר מודל מתאים להישנות GBM לאחר כריתה. כאן, מודל הישנות GBM לאחר כריתה פותח ויושם בחקירות הידרוג'ל טיפוליות. מודל זה נבנה על בסיס מודל GBM תוך גולגולתי אורתוטופי, הנמצא בשימוש נרחב במחקרים על GBM. כריתת סכום ביניים בוצעה בעכבר מודל GBM תוך גולגולתי אורתוטופי כדי לחקות את הטיפול הקליני. הגידול השיורי שימש לציון גודל הגידול הגידול. מודל זה קל לבנייה, יכול לחקות טוב יותר את המצב של כריתה כירורגית של GBM, וניתן ליישם אותו במחקרים שונים על הטיפול המקומי בהישנות GBM לאחר כריתה. כתוצאה מכך, מודל GBM relapse post-resection מספק מודל ייחודי להישנות GBM למחקרי טיפול מקומיים יעילים בהישנות לאחר כריתה.
Introduction
גליובלסטומה (GBM) הוא הגידול הממאיר השכיח ביותר מבין כל סוגי סרטן מערכת העצבים המרכזית 1,2. ניתוח הוא טיפול הקו הראשון לחולים עם GBM, וכימותרפיה היא הטיפול האדג'ובנטי העיקרי לאחר הניתוח. עם זאת, הישנות הגידול מתפתחת לעיתים קרובות תוך 3-6 חודשים ברוב חולי GBM עם טיפולים שונים 3,4,5. לפיכך, יש צורך דחוף לפתח אסטרטגיות טיפול יעילות יותר למניעת הישנות GBM.
מחקרים אחרונים על GBM התמקדו בעיקר בגידולים ראשוניים ולא בגידולים חוזרים6. עם זאת, הבעיה הנפוצה ביותר שיש לפתור במרפאה היא כיצד לעכב את הישנות GBM לאחר הניתוח. לכן, מחקר על הישנות GBM לאחר ניתוח דורש תשומת לב רבה יותר. הידרוג'לים טיפוליים מגיבים ביולוגית הם הווקטור הנפוץ ביותר המשמש במחקרים על הישנות הגידול לאחר ניתוח 7,8. עם זאת, בשל המבנה המיוחד של מערכת העצבים המרכזית, קשה לפתח מודל מתאים להישנות GBM לאחר כריתה9, שהוא קריטי לחקר הישנות GBM.
מחקר זה יצר מודל משופר להישנות GBM לאחר כריתה המבוסס על מודל GBM תוך גולגולתי אורתוטופי המשמש במחקר על GBM ראשוני. במודל זה, רוב הגידולים מוסרים בניתוח במיקרוסקופיה, והגידול השיורי מזוהה על ידי הדמיה ביולומינסנטית in vivo וצביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E). מודל זה מחקה את מצב הכריתה של חולי גידולי מוח וניתן להשתמש בו במחקרים שונים על הישנות GBM.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים אושרו ופוקחו על ידי ועדת הביקורת המוסדית וועדת האתיקה של בעלי חיים באוניברסיטה הרפואית נאנג'ינג (IACUC-1904004). נקבות עכברי C57BL/6J, בגילאי 6-8 שבועות, שימשו במחקר הנוכחי. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).
1. הכנת בעלי חיים
- לשקול את העכברים, ולהרדים אותם עם הזרקה intraperitoneal של 50 מ"ג / ק"ג נתרן pentobarbital (ראה טבלה של חומרים). מתן meloxicam (5mg / kg; i.p.) עבור שיכוך כאבים perioperative . אחסן את העכברים בכלוב תחת מחזור אור/חושך של 12 שעות/12 שעות, טמפרטורת סביבה של 24 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של 50%.
הערה: במחקר הנוכחי, המשקל ההתחלתי של העכברים היה כ-22 גרם. - הסר את השיער על ראשו של עכבר באמצעות מכונת גילוח של חיות מעבדה, וקיבע את הראש והגפיים על המנגנון הסטריאוטקסי (ראה טבלת חומרים).
הערה: יש לעקר את כל הציוד לפני השימוש. - לחטא את ראש העכבר עם לפחות שלושה סיבובים לסירוגין של chlorhexidine או povidone-יוד לשפשף ואחריו אלכוהול, ולכסות את העכבר עם drape כירורגי סטרילי. יש למרוח משחה אופתלמית על שתי העיניים למניעת התייבשות.
- חותכים את הקרקפת של העכבר כ 1 ס"מ לאורך קו האמצע בחלק העליון של המצח הימני עם מספריים אופתלמיים.
הערה: יש לאשר את המישור הכירורגי של ההרדמה על ידי היעדר רפלקס דוושה לפני ביצוע החתך. - כוונן את המנגנון הסטריאוטקסי כדי להבטיח שתפר עצם ההרינג ונקודת הפונטנל הקדמית ממוקמים באותה רמה.
2. בניית מודל GBM אורתוטופי תוך גולגולתי
- סמן את הנקודה 1 מ"מ לצד הקדמי של הפונטנל הקדמי, 1.8 מ"מ לצד ימין של הפונטנל הקדמי, ו-3 מ"מ למטה מהפונטנל הקדמי באמצעות צמר גפן טבול בסגול גנטיאן2 (ראה טבלת חומרים).
- קדח את הנקודה באמצעות מקדח גולגולתי קטן בקוטר 1 מ"מ (ראה טבלת חומרים) ליצירת גודל נקבוביות בקוטר של כ-1 מ"מ ובעומק של 1 מ"מ.
- הסר את נוזל המוח השדרה המופרש עם צמר גפן סטרילי.
- לשאוף 5 μL של תרחיף תאי הגידול (GL261-Luci, 5 × 10 5 תאים מרחפים5 μL של PBS) עם מזרק.
הערה: GL261-Luci התקבל ממקור מסחרי (ראה טבלת חומרים). - יישרו את קצה המחט של המיקרומזרק במאונך עם חור הקידוח של הגולגולת, הכניסו עד שקצה המחט ייכנס למישור הגולגולת למשך 3 מ"מ, והחזירו את המחט ב-0.5 מ"מ7.
- פתח את המיקרומזרק, והזריק במהירות של 1 μL / min.
- שמור על המחט במשך 10 דקות לאחר ההזרקה.
- משכו את המיקרומזרק באיטיות, ולחצו על נקודת ההזרקה בעזרת כדור צמר גפן יבש סטרילי.
- תפרו את הקרקפת בתפר כירורגי שאינו נספג (10-0, ראו טבלת חומרים), וחיטאו שוב את החתך.
- לפקח על בריאותו של בעל החיים, ולשמור אותו בתנאים חמים.
- החזירו את העכבר לכלוב הדיור לאחר שהעכבר מתעורר.
- דמיינו את העכבר עם מערכת הדמיה ביולומינסנטית in vivo (ראו טבלת חומרים) כדי לזהות את הגידול המושתל ביום העשירי לאחר נשיאת הגידול.
הערה: לוציפראז שהוטען בתאי GBM, GL261, שימש להדמיה ביולומינסנטית.- מרדימים את העכבר עם איזופלורן 1.5% עם קצב זרימת חמצן של 0.6L/min. לאחר אישור עומק ההרדמה באמצעות חוסר רפלקס דוושה, הזריקו לעכבר אשלגן פלואורסצאין תוך צפקי (10 מ"ג/מ"ל, ראו טבלת חומרים), וכעבור 11 שניות, בצעו את ההדמיה הביו-לומינסנטית in vivo . כאשר ערך הפלואורסצנטיות מגיע ~ 5 × 105, ההליך מצליח.
הערה: יש להרדים את בעל החיים לפני ההדמיה. יש להרדים באמצעות חרוט אף המסופק עם איזופלורן מאדים.
- מרדימים את העכבר עם איזופלורן 1.5% עם קצב זרימת חמצן של 0.6L/min. לאחר אישור עומק ההרדמה באמצעות חוסר רפלקס דוושה, הזריקו לעכבר אשלגן פלואורסצאין תוך צפקי (10 מ"ג/מ"ל, ראו טבלת חומרים), וכעבור 11 שניות, בצעו את ההדמיה הביו-לומינסנטית in vivo . כאשר ערך הפלואורסצנטיות מגיע ~ 5 × 105, ההליך מצליח.
- בחר את העכברים עם נשיאת גידול מוצלחת כדי לבנות את מודל הישנות GBM לאחר כריתה.
3. בניית מודל הישנות GBM לאחר כריתה
- כאשר גודל הגידול בעכברי מודל GBM תוך גולגולתי אורתוטופי הופך ~ 6.5 × 105, בחר את העכברים עבור מודל הישנות לאחר הניתוח.
- לשקול את עכברי מודל GBM תוך גולגולתי אורתוטופי, ולהרדים את העכברים עם הזרקה intraperitoneal של 50 מ"ג / ק"ג נתרן pentobarbital. מתן meloxicam (5mg / kg; i.p.) עבור שיכוך כאבים perioperative .
- חזור על התהליך של שלבים 1.2-1.5.
- הפרידו את רקמת הקרקפת והגולגולת, ובדקו את חור הקידוח המשמש לבניית מודל GBM תוך גולגולתי אורתוטופי. אם החור נרפא, זהה את החור באמצעות מכשיר סטריאוטקטי, ופעל לפי ההליך המוזכר בשלבים 2.1-2.3.
- הרחב את קוטר החור ל -5 מ"מ עם מקדח גולגולת, והסר את הנוזל השדרתי המופרש עם צמר גפן סטרילי.
- מקדו את המיקרוסקופ על ראש העכבר, והתאימו את ההגדרות כדי לוודא שחור הקידוח ממוקם במרכז שדה הראייה.
- חותכים את קרומי המוח עם מספריים, ולהסיר חלק מרקמת הגידול עם מיקרו קורט ואזמל מיקרו מתחת למיקרוסקופ.
הערה: לגבי קרומי המוח, כאשר הגולגולת נפתחת, הקרום הדק הקרוב לרקמת המוח הוא קרומי המוח. - עצור את הדימום עם גזה סטרילית, ולשטוף את החתך עם מלוחים פיזיולוגיים סטריליים.
- הזריקו את ההידרוג'ל הזמין מסחרית (10 μL, ראו טבלת חומרים) לתוך חלל הכריתה באמצעות מזרק 1 מ"ל, תפרו את הקרקפת בתפר כירורגי שאינו נספג (10-0), וחיטאו שוב את החתך (איור 1).
- עקוב אחר בריאותו של בעל החיים, ושמור על חום העכבר.
- החזירו את העכבר לכלוב הדיור לאחר שהעכבר מתעורר.
- בצעו הדמיה ביולומינסנטית in vivo כדי לזהות את הגידול המושתל יום אחד לאחר מכן כדי לכמת את גודל הגידול השיורי (איור 2 ואיור 3).
- שוקלים את העכברים כל יומיים עד לנקודת הקצה הסופית.
הערה: במחקר הנוכחי, נקודת הקצה הסופית הייתה היום ה-30, והעכברים הומתו על ידי מנת יתר של נתרן פנטוברביטלי בזריקה תוך-צפקית.
Representative Results
תהליך הבנייה של מודל GBM relapse post-resection מוצג באיור 1. חלל הכריתה לאחר שהגידול הוסר חלקית תחת המיקרוסקופ מוצג. ההידרוג'ל הוזרק לחלל הכריתה עם מזרק כדי להדגים את האפקט הטיפולי. לוח הזמנים של תכנון הניסוי מוצג באיור 2A. לאחר שתאי GBM הושתלו במוחם של העכברים, הגידול נבדק על ידי הדמיה ביולומינסנטית in vivo ביום ה-10. הכריתה בוצעה ביום ה-11, ולאחר מכן הוזרק ההידרוג'ל לחלל הכריתה. בדיקת ההדמיה הביו-לומינסנטית in vivo בוצעה ביום ה-15, ביום ה-20, ביום ה-25 וביום ה-30 כדי לעקוב אחר שאריות הגידול הגידולי. כפי שניתן לראות באיור 2B,C, גודל הגידולים במודל GBM relapse post-resection היה קטן משמעותית מזה של הגידולים במודל GBM אורתוטופי תוך גולגולתי, כפי שניתן לראות בבדיקות הדמיה ביולומינסנטיות in vivo. ביום ה-25 הגידולים חזרו באופן משמעותי לאחר הכריתה (איור 2D). צביעת H&E אישרה כי מודל הישנות GBM לאחר כריתה נבנה בהצלחה וכי גידולים שיוריים חזרו באופן משמעותי לאחר הכריתה (איור 3A,B).
איור 1: מבט תוך ניתוחי על כריתת הגידול והזרקת ההידרוג'ל. חלק מרקמת הגידול הוסר עם מיקרו קורט ומיקרו אזמל מתחת למיקרוסקופ, והידרוג'ל הוזרק לחלל הכריתה. פסי קנה מידה: 50 מיקרומטר. נתון זה שונה מ- Sun et al.10. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: לוח הזמנים של תכנון הניסוי וההדמיה הביו-לומינסנטית in vivo של עכברים במודל GBM תוך גולגולתי ולאחר כריתה. (A) לוח הזמנים של תכנון הניסוי מראה כי הכריתה בוצעה ביום ה-11 וכי ההדמיה הביולומינסנטית in vivo (IV) בוצעה ביום ה-10, ביום ה-15, ביום ה-20, ביום ה-25 וביום ה-30. (B) עכברי מודל GBM תוך גולגולתי הראו גודל גידול גדול ביום 10, (C) גודל הגידול הוקטן משמעותית לאחר כריתה ביום 11, ו-(D) גודל הגידול גדל לאחר כריתה ביום 25 במודל GBM שלאחר כריתה. קבוצת הביקורת כללה עכברי מודל הישנות GBM לאחר כריתה ללא טיפול. במחקר זה נעשה שימוש בסך הכל ב-42 עכברים. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. נתון זה שונה מ- Sun et al.10. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונת צביעת H&E של רקמת מוח ממודל GBM שלאחר כריתה. (A) תמונת צביעת H&E המדגימה את חלל הכריתה, שאריות הגידול ורקמת המוח התקינה. רקמת המוח נאספה יום לאחר הכריתה. (B) תמונת צביעת H&E המדגימה את הגידול החוזר ואת רקמת המוח הרגילה. רקמת המוח נאספה ביום ה-12 לאחר הכריתה. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. נתון זה שונה מ- Sun et al.10. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
ניתוח נותר הבחירה הראשונה עבור רוב חולי GBM11. בשל המאפיין של צמיחה פולשנית של GBM, מספר קטן של תאי גידול עדיין נשארים לאחר טכניקות נוירוכירורגיות מיקרו, וכתוצאה מכך בסופו של דבר הישנות הגידול12. כיצד לעכב את הישנות GBM לאחר ניתוח הפך למוקד המחקר הקשור לגליובלסטומה. עם זאת, בשל המבנה האנטומי המורכב של רקמת המוח, בניית מודל GBM מתאים לאחר הניתוח הפכה לבעיה העיקרית שיש לפתור בתחום זה.
מחקר זה פיתח מודל הישנות GBM לאחר כריתה. בתהליך בניית מודל זה, בניית מודל GBM תוך גולגולתי אורתוטופי היא קריטית. לאחר שמודל זה פותח בהצלחה, יש לבצע את הכריתה בזמן הנכון. הזמן המומלץ הוא כאשר הערך הפלואורסצנטי של גודל הגידול הוא כ 6.5 × 105. כדי להפחית את התמותה של העכברים, בוצעה כריתה בהרדמה עם 40 מ"ג / ק"ג 1% נתרן pentobarbital על ידי הזרקה intraperitoneal. עם זאת, הכריתה הייתה קשה לביצוע, והעכברים נעו לעתים קרובות בגלל המינון הקטן של חומר ההרדמה. על בסיס זה, מינון חומר ההרדמה הועלה ל -50 מ"ג / ק"ג. לאחר הגדלת מינון ההרדמה, נעלמו התגובות התוך ניתוחיות של העכברים, והכריתה בוצעה בהצלחה. גז איזופלורן יכול לשמש גם בפרוטוקול זה.
במחקר זה, תאי GL261-Luci שימשו לפיתוח המודל; לכן, יש להשתמש בקווי תאים נוספים של GBM כדי לאמת את הפרוטוקול בעתיד. כדי להפוך את הפרוטוקול למשכנע יותר, יש להשתמש במודלים שונים של עכברי GBM, כגון מודלים של עכברי GBM מהונדסים גנטית. בנוסף, MRI עשוי להיות האמצעי הטוב ביותר לזהות את הישנות של גידולים לאחר הניתוח.
לסיכום, בעבודה זו פותח מודל הישנות GBM לאחר כריתה. במודל זה, מעקב אחר הישנות הגידול מתבצע על ידי הערכת צמיחת שאריות הגידול לאחר כריתה. למרות שלא ניתן להתייחס למודל זה כמחקה לחלוטין את הישנות הגידול, סגנון הכריתה במודל זה דומה לסטנדרט של ניתוח בטוח באופן מקסימלי בטיפול קליני בחולי GBM. עבודה זו מספקת שיטה נוחה וישימה לבניית מודל הישנות GBM לאחר כריתה ומהווה התקדמות בתחום המחקר על הישנות GBM לאחר כריתה.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי פרויקט מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82071767 ו -82171781).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gentian violet | Sigma | C6158 | |
| GL261-Luci | Shanghai Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co.,Ltd. | ZQ0932 | |
| In vivo bioluminescent imaging system | Tanon | Tanon ABL X6 | |
| Laboratory animal shaver | Beyotime Biotechnology | FS600 | |
| Mice | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | ||
| Micro curette | Belevor Medical Co.,Ltd. | ||
| Micro scalpel | Belevor Medical Co.,Ltd. | ||
| Microscope | Shanghai Xiangfan Instrument Co., Ltd | JSZ5A/B | |
| Microsyringe | Hamilton | 87943 | |
| Mini cranial drill | RWD | 78001 | |
| Nonabsorbable surgical suture | Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd. | ||
| Pentobarbital sodium | ChemSrc | 57-33-0 | |
| PVA-TSPBA hydrogel | Aladdin | 9002-89-5 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD | 68043 |
References
- Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C., Weller, M. Current state of immunotherapy for glioblastoma. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (7), 422-442 (2018).
- Wang, X., et al. In situ targeting nanoparticles-hydrogel hybrid system for combined chemo-immunotherapy of glioma. Journal of Controlled Release. 345, 786-797 (2022).
- Binder, Z. A., O'Rourke, D. M. Glioblastoma: The current state of biology and therapeutic strategies. Cancer Research. 82 (5), 769-772 (2022).
- Kauer, T. M., Figueiredo, J. L., Hingtgen, S., Shah, K. Encapsulated therapeutic stem cells implanted in the tumor resection cavity induce cell death in gliomas. Nature Neuroscience. 15 (2), 197-204 (2011).
- Jiang, X., et al. Nanoparticle engineered TRAIL-overexpressing adipose-derived stem cells target and eradicate glioblastoma via intracranial delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (48), 13857-13862 (2016).
- Quail, D. F., Joyce, J. A.
- Zhang, J., et al. Immunostimulant hydrogel for the inhibition of malignant glioma relapse post-resection. Nature Nanotechnology. 16 (5), 538-548 (2021).
- Ruan, H., et al. A dual-bioresponsive drug-delivery depot for combination of epigenetic modulation and immune checkpoint blockade. Advanced Materials. 31 (17), 1806957 (2019).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Sun, S., et al. Immunostimulant in situ hydrogel improves synergetic radioimmunotherapy of malignant glioblastoma relapse post-resection. Advanced Functional Materials. 32 (43), 2205038 (2022).
- Liu, D. K., Sulman, E. P., Wen, P. Y., Kurz, S. C.
- Mellinghoff, I. K., Cloughesy, T. F. Balancing risk and efficiency in drug development for rare and challenging tumors: A new paradigm for glioma. Journal of Clinical Oncology. 40 (30), 3510-3519 (2022).
