Summary
Denne protokol etablerer en glioblastom (GBM) tilbagefald efter resektionsmodel ved hjælp af mikroskopi for at undersøge den terapeutiske virkning af en injicerbar, bioresponsiv hydrogel in vivo.
Abstract
Tumor tilbagefald er en vigtig faktor, der indikerer en dårlig prognose i glioblastom (GBM). Mange undersøgelser forsøger at identificere effektive terapeutiske strategier for at forhindre gentagelse af GBM efter operationen. Bioresponsive terapeutiske hydrogeler, der er i stand til at opretholde lokalt frigivne lægemidler, anvendes ofte til lokal behandling af GBM efter operationen. Forskning er imidlertid begrænset på grund af manglen på en passende GBM tilbagefald post-resektionsmodel. Her blev en GBM tilbagefald post-resektionsmodel udviklet og anvendt i terapeutiske hydrogelundersøgelser. Denne model blev konstrueret baseret på den ortopiske intrakranielle GBM-model, som i vid udstrækning anvendes i undersøgelser af GBM. Subtotal resektion blev udført på den ortopiske intrakranielle GBM-modelmus for at efterligne den kliniske behandling. Den resterende tumor blev brugt til at indikere størrelsen af tumorvæksten. Denne model er let at bygge, kan bedre efterligne situationen med GBM kirurgisk resektion og kan anvendes i forskellige undersøgelser af lokal behandling af GBM tilbagefald efter resektion. Som følge heraf giver GBM-tilbagefald efter resektionsmodellen en unik GBM-gentagelsesmodel til effektive lokale behandlingsstudier af tilbagefald efter resektion.
Introduction
Glioblastom (GBM) er den mest almindelige maligne tumor blandt alle kræft i centralnervesystemet 1,2. Kirurgi er førstelinjebehandling for patienter med GBM, og kemostråling er den vigtigste adjuvansbehandling efter operationen. Imidlertid udvikler tumortilbagefald ofte inden for 3-6 måneder hos de fleste GBM-patienter med forskellige behandlinger 3,4,5. Derfor er der et presserende behov for at udvikle mere effektive behandlingsstrategier for at forhindre gentagelse af GBM.
Nylige undersøgelser af GBM har primært fokuseret på primære tumorer snarere end tilbagevendende tumorer6. Det mest almindelige problem, der skal løses i klinikken, er imidlertid, hvordan man hæmmer gentagelsen af GBM efter operationen. Derfor har forskning i gentagelse af GBM efter operationen brug for mere opmærksomhed. Bioresponsive terapeutiske hydrogeler er den mest almindelige vektor, der anvendes i undersøgelser af tumortilbagefald efter operation 7,8. På grund af centralnervesystemets særlige struktur er det imidlertid vanskeligt at udvikle en passende GBM tilbagefald efter resektionmodel 9, hvilket er kritisk for undersøgelsen af GBM tilbagefald.
Denne undersøgelse har genereret en forbedret GBM tilbagefald post-resektion model baseret på den ortopiske intrakranielle GBM model, der anvendes i forskning på primær GBM. I denne model fjernes de fleste tumorer ved kirurgi med mikroskopi, og den resterende tumor detekteres ved in vivo bioluminescerende billeddannelse og hæmatoxylin og eosin (H & E) farvning. Denne model efterligner resektionstilstanden hos hjernetumorpatienter og kan bruges i forskellige undersøgelser af GBM-tilbagefald.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt og overvåget af Institutional Review Board og Animal Ethics Committee of Nanjing Medical University (IACUC-1904004). C57BL/6J hunmus i alderen 6-8 uger blev anvendt til nærværende undersøgelse. Dyrene blev hentet fra en kommerciel kilde (se materialetabel).
1. Tilberedning af dyr
- Vej musene, og bedøm dem med en intraperitoneal injektion af 50 mg / kg pentobarbitalnatrium (se materialetabel). Administrer meloxicam (5mg/kg; i.p.) til perioperativ analgesi. Opstald musene i et bur under en lys/mørk cyklus på 12 timer/12 timer, en omgivelsestemperatur på 24 °C og en relativ luftfugtighed på 50 %.
BEMÆRK: I denne undersøgelse var musenes startvægt ca. 22 g. - Fjern hårene på hovedet af en mus ved hjælp af en laboratoriebarbermaskine, og fastgør hovedet og lemmerne på det stereotaksiske apparat (se materialetabel).
BEMÆRK: Steriliser alt udstyr før brug. - Desinficer musens hoved med mindst tre vekslende runder chlorhexidin eller povidon-jodskrubbe efterfulgt af alkohol, og dæk musen med en steril kirurgisk drapering. Påfør oftalmisk salve på begge øjne for at forhindre tørring.
- Skær musens hovedbund ca. 1 cm langs midterlinjen på toppen af højre pande med oftalmisk saks.
BEMÆRK: Bekræft anæstesiens kirurgiske plan ved fravær af pedalrefleks, inden snittet foretages. - Indstil stereotaksapparatet for at sikre, at sildebensømmen og det forreste fontanelpunkt er placeret på samme niveau.
2. Konstruktion af den ortopiske intrakranielle GBM-model
- Marker punktet 1 mm til forsiden af den forreste fontanel, 1,8 mm til højre for den forreste fontanel og 3 mm ned fra den forreste fontanel ved hjælp af en vatpind dyppet med ensianviolet2 (se materialetabel).
- Bor punktet ved hjælp af et minikraniebor med en diameter på 1 mm (se materialetabellen) for at skabe en porestørrelse på ca. 1 mm diameter og 1 mm dybde.
- Fjern den udstrålede cerebrospinalvæske med en steril vatpind.
- Aspirat 5 μL tumorcellesuspension (GL261-Luci, 5 × 10 5 celler suspenderet i5 μL PBS) med en mikrosprøjte.
BEMÆRK: GL261-Luci blev hentet fra en kommerciel kilde (se materialetabel). - Ret kanylespidsen af mikrosprøjten lodret ind efter kranieborehullet, indsæt indtil kanylespidsen kommer ind i kranieplanet i 3 mm, og sæt kanylen 0,5 mm7 tilbage.
- Åbn mikrosprøjten, og injicer med en hastighed på 1 μL/min.
- Opbevar nålen i 10 minutter efter injektionen.
- Træk langsomt mikrosprøjten ud, og tryk på injektionsstedet med en steril, tør vatrondel.
- Sutur hovedbunden med en ikke-absorberbar kirurgisk sutur (10-0, se Tabel over materialer), og desinficer snittet igen.
- Overvåg dyrets helbred, og hold det under varme forhold.
- Flyt musen tilbage til husburet, når musen vågner.
- Billede musen med et in vivo bioluminescerende billeddannelsessystem (se materialetabel) for at detektere den transplanterede tumor på den 10. dag efter tumorbæring.
BEMÆRK: Luciferase indlæst i GBM-cellerne, GL261, blev brugt til bioluminescerende billeddannelse.- Bedøv musen med 1,5% isofluran med en iltgennemstrømningshastighed på 0,6L/min. Efter bekræftelse af anæstesidybden via manglende pedalrefleks injiceres musen intraperitonealt med kaliumfluorescein (10 mg / ml, se materialetabel), og 11 s senere udføres in vivo bioluminescerende billeddannelse. Når fluorescensværdien når ~ 5 × 105, er proceduren vellykket.
BEMÆRK: Bedøv dyret før billeddannelse. Oprethold anæstesi via næsekegle, der leveres med fordampet isofluran.
- Bedøv musen med 1,5% isofluran med en iltgennemstrømningshastighed på 0,6L/min. Efter bekræftelse af anæstesidybden via manglende pedalrefleks injiceres musen intraperitonealt med kaliumfluorescein (10 mg / ml, se materialetabel), og 11 s senere udføres in vivo bioluminescerende billeddannelse. Når fluorescensværdien når ~ 5 × 105, er proceduren vellykket.
- Vælg musene med vellykket tumorbærende for at konstruere GBM tilbagefald efter resektionsmodellen.
3. Konstruktion af GBM tilbagefald efter resektionsmodellen
- Når tumorstørrelsen i de ortopiske intrakranielle GBM-modelmus bliver ~ 6,5 × 105, skal du vælge musene til den postoperative tilbagefaldsmodel.
- Vej de ortopiske intrakranielle GBM-modelmus, og bedøvelse musene med en intraperitoneal injektion på 50 mg / kg pentobarbitalnatrium. Administrer meloxicam (5mg/kg; i.p.) til perioperativ analgesi.
- Gentag processen i trin 1.2-1.5.
- Adskil hovedbundens væv og kraniet, og kontroller borehullet, der bruges til at opbygge den ortopiske intrakranielle GBM-model. Hvis hullet er helet, skal du identificere hullet ved hjælp af stereotaktisk apparatur og følge proceduren nævnt i trin 2.1-2.3.
- Udvid huldiameteren til 5 mm med en kranieboremaskine, og fjern den udstrålede cerebrospinalvæske med en steril vatpind.
- Fokuser mikroskopet på musens hoved, og juster indstillingerne for at sikre, at borehullet er placeret i midten af synsfeltet.
- Skær meninges med mikrosaks, og fjern en del af tumorvævet med en mikrocurette og en mikroskalpel under mikroskopet.
BEMÆRK: Med hensyn til meninges, når kraniet åbnes, er den tynde membran tæt på hjernevævet meninges. - Stop blødningen med sterilt gasbind, og vask snittet med sterilt fysiologisk saltvand.
- Injicer den kommercielt tilgængelige hydrogel (10 μL, se materialetabel) i resektionshulrummet med en 1 ml sprøjte, sutur hovedbunden med en ikke-absorberbar kirurgisk sutur (10-0), og desinficer snittet igen (figur 1).
- Overvåg dyrets helbred, og hold musen varm.
- Flyt musen tilbage til husburet, når musen vågner.
- Udfør in vivo bioluminescerende billeddannelse for at detektere den transplanterede tumor 1 dag senere for at kvantificere størrelsen af den resterende tumor (figur 2 og figur 3).
- Vej musene hver 2. dag indtil terminalslutpunktet.
BEMÆRK: I dette studie var det terminale endepunkt dag 30, og musene blev aflivet ved en overdosis pentobarbitalnatrium med en intraperitoneal injektion.
Representative Results
Processen med konstruktion af GBM tilbagefald efter resektionsmodellen er vist i figur 1. Resektionshulrummet efter tumoren blev delvist fjernet under mikroskopien er vist. Hydrogelen blev injiceret i resektionshulrummet med en sprøjte for at demonstrere den terapeutiske virkning. Tidsplanen for det eksperimentelle design er vist i figur 2A. Efter at GBM-cellerne blev implanteret i musenes hjerne, blev tumorvæksten testet ved in vivo bioluminescerende billeddannelse på dag 10. Resektionen blev udført på dag 11, og hydrogelen blev derefter injiceret i resektionshulrummet. In vivo bioluminescerende billeddannelsestest blev udført på dag 15, dag 20, dag 25 og dag 30 for at overvåge den resterende tumorvækst. Som vist i figur 2B,C var størrelsen af tumorerne i GBM-tilbagefald efter resektionsmodellen signifikant mindre end dem i den ortopiske intrakranielle GBM-model, som vist ved in vivo bioluminescerende billeddannelsestest. På dag 25 gentog tumorerne sig signifikant efter resektion (figur 2D). H&E-farvningen bekræftede, at GBM-tilbagefald efter resektionsmodellen blev konstrueret med succes, og at resterende tumorer signifikant gentog sig efter resektionen (figur 3A, B).
Figur 1: Intraoperativt billede af tumorresektion og injektion af hydrogelen. En del af tumorvævet blev fjernet med en mikrocurette og mikroskalpel under mikroskopet, og hydrogel blev injiceret i resektionshulrummet. Vægtstænger: 50 μm. Dette tal er blevet ændret fra Sun et al.10. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Tidsplan for det eksperimentelle design og in vivo bioluminescerende billeddannelse af mus i GBM-modellen inden for kraniel og postresektion. A) Tidsplanen for forsøgsdesignet, hvoraf det fremgår, at resektionen blev udført på dag 11, og at in vivo-bioluminescerende billeddannelse (IV) blev udført på dag 10, dag 15, dag 20, dag 25 og dag 30. (B) De intrakranielle GBM-modelmus viste en stor tumorstørrelse på dag 10, (C) tumorstørrelsen blev signifikant reduceret efter resektion på dag 11, og (D) tumorstørrelsen steg efter resektion på dag 25 i GBM-modellen efter resektion. Kontrolgruppen omfattede GBM tilbagefald efter resektion modelmus uden behandling. I alt 42 mus blev brugt i denne undersøgelse. Skalastænger: 100 μm. Dette tal er blevet ændret fra Sun et al.10. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: H&E-farvningsbillede af hjernevæv fra GBM-modellen efter resektion. (A) Et H&E-farvningsbillede, der viser resektionshulrummet, resttumoren og normalt hjernevæv. Hjernevævet blev indsamlet 1 dag efter resektionen. (B) Et H&E-farvningsbillede, der viser den tilbagevendende tumor og det normale hjernevæv. Hjernevævet blev indsamlet på dag 12 efter resektionen. Skalastænger: 100 μm. Dette tal er blevet ændret fra Sun et al.10. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Kirurgi er fortsat førstevalget for de fleste GBM-patienter11. På grund af karakteristikken ved invasiv vækst af GBM forbliver et lille antal tumorceller stadig efter mikroneurokirurgiske teknikker, hvilket resulterer i eventuel tumorgentagelse12. Hvordan man hæmmer gentagelsen af GBM efter operationen er blevet fokus for GBM-relateret forskning. På grund af den komplekse anatomiske struktur af hjernevæv er konstruktionen af en passende postoperativ GBM-model imidlertid blevet det primære problem, der skal løses på dette område.
Denne undersøgelse udviklede en GBM tilbagefald post-resektion model. I processen med at konstruere denne model er konstruktionen af den ortopiske intrakranielle GBM-model kritisk. Når denne model er udviklet med succes, skal resektionen udføres på det rigtige tidspunkt. Den anbefalede tid er, når fluorescensværdien af tumorstørrelsen er ca. 6, 5 × 105. For at reducere musenes dødelighed blev resektion under anæstesi udført med 40 mg/kg 1% pentobarbitalnatrium ved intraperitoneal injektion. Resektionen var imidlertid vanskelig at udføre, og musene bevægede sig ofte på grund af den lille dosis bedøvelsesmiddel. På dette grundlag blev dosis af bedøvelsesmidlet øget til 50 mg / kg. Efter at have øget bedøvelsesdosis forsvandt musenes intraoperative reaktioner, og resektionen blev udført med succes. Isoflurangas kan også anvendes i denne protokol.
I denne undersøgelse blev GL261-Luci-celler brugt til at udvikle modellen; Derfor skal der bruges flere GBM-cellelinjer til at validere protokollen i fremtiden. For at gøre protokollen mere overbevisende skal der anvendes forskellige GBM-musemodeller, såsom genetisk manipulerede GBM-musemodeller. Derudover kan MR være det bedste middel til at opdage gentagelse af tumorer efter operationen.
Sammenfattende er der i dette arbejde udviklet en GBM-tilbagefald efter resektionsmodel. I denne model overvåges tumor tilbagefald ved at vurdere den resterende tumors vækst efter resektion. Selvom denne model ikke kan anses for fuldstændigt at efterligne tumorgentagelse, svarer resektionsstilen i denne model til standarden for maksimalt sikker kirurgi i den kliniske behandling af GBM-patienter. Dette arbejde giver en bekvem og gennemførlig metode til konstruktion af GBM tilbagefald post-resektionsmodellen og repræsenterer et fremskridt inden for forskning i GBM tilbagefald efter resektion.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af projektbevillinger fra National Natural Science Foundation of China (82071767 and 82171781).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gentian violet | Sigma | C6158 | |
| GL261-Luci | Shanghai Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co.,Ltd. | ZQ0932 | |
| In vivo bioluminescent imaging system | Tanon | Tanon ABL X6 | |
| Laboratory animal shaver | Beyotime Biotechnology | FS600 | |
| Mice | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | ||
| Micro curette | Belevor Medical Co.,Ltd. | ||
| Micro scalpel | Belevor Medical Co.,Ltd. | ||
| Microscope | Shanghai Xiangfan Instrument Co., Ltd | JSZ5A/B | |
| Microsyringe | Hamilton | 87943 | |
| Mini cranial drill | RWD | 78001 | |
| Nonabsorbable surgical suture | Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd. | ||
| Pentobarbital sodium | ChemSrc | 57-33-0 | |
| PVA-TSPBA hydrogel | Aladdin | 9002-89-5 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD | 68043 |
References
- Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C., Weller, M. Current state of immunotherapy for glioblastoma. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (7), 422-442 (2018).
- Wang, X., et al. In situ targeting nanoparticles-hydrogel hybrid system for combined chemo-immunotherapy of glioma. Journal of Controlled Release. 345, 786-797 (2022).
- Binder, Z. A., O'Rourke, D. M. Glioblastoma: The current state of biology and therapeutic strategies. Cancer Research. 82 (5), 769-772 (2022).
- Kauer, T. M., Figueiredo, J. L., Hingtgen, S., Shah, K. Encapsulated therapeutic stem cells implanted in the tumor resection cavity induce cell death in gliomas. Nature Neuroscience. 15 (2), 197-204 (2011).
- Jiang, X., et al. Nanoparticle engineered TRAIL-overexpressing adipose-derived stem cells target and eradicate glioblastoma via intracranial delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (48), 13857-13862 (2016).
- Quail, D. F., Joyce, J. A.
- Zhang, J., et al. Immunostimulant hydrogel for the inhibition of malignant glioma relapse post-resection. Nature Nanotechnology. 16 (5), 538-548 (2021).
- Ruan, H., et al. A dual-bioresponsive drug-delivery depot for combination of epigenetic modulation and immune checkpoint blockade. Advanced Materials. 31 (17), 1806957 (2019).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Sun, S., et al. Immunostimulant in situ hydrogel improves synergetic radioimmunotherapy of malignant glioblastoma relapse post-resection. Advanced Functional Materials. 32 (43), 2205038 (2022).
- Liu, D. K., Sulman, E. P., Wen, P. Y., Kurz, S. C.
- Mellinghoff, I. K., Cloughesy, T. F. Balancing risk and efficiency in drug development for rare and challenging tumors: A new paradigm for glioma. Journal of Clinical Oncology. 40 (30), 3510-3519 (2022).
