Summary
ينشئ البروتوكول الحالي نموذجا للانتكاس بعد الاستئصال للورم الأرومي الدبقي (GBM) باستخدام الفحص المجهري للتحقيق في التأثير العلاجي لهيدروجيل قابل للحقن ومستجيب بيولوجيا في الجسم الحي.
Abstract
تكرار الورم هو عامل مهم يدل على سوء التشخيص في الورم الأرومي الدبقي (GBM). تحاول العديد من الدراسات تحديد استراتيجيات علاجية فعالة لمنع تكرار GBM بعد الجراحة. كثيرا ما تستخدم الهلاميات المائية العلاجية المستجيبة بيولوجيا القادرة على الحفاظ على الأدوية التي يتم إطلاقها محليا للعلاج المحلي ل GBM بعد الجراحة. ومع ذلك ، فإن البحث محدود بسبب عدم وجود نموذج مناسب لانتكاس GBM بعد الاستئصال. هنا ، تم تطوير نموذج الانتكاس بعد الاستئصال GBM وتطبيقه في تحقيقات الهيدروجيل العلاجية. تم بناء هذا النموذج بناء على نموذج GBM داخل الجمجمة ، والذي يستخدم على نطاق واسع في الدراسات على GBM. تم إجراء استئصال المجموع الفرعي على ماوس نموذج GBM داخل الجمجمة لتقليد العلاج السريري. تم استخدام الورم المتبقي للإشارة إلى حجم نمو الورم. هذا النموذج سهل البناء ، ويمكن أن يحاكي بشكل أفضل حالة الاستئصال الجراحي GBM ، ويمكن تطبيقه في دراسات مختلفة حول العلاج المحلي لانتكاس GBM بعد الاستئصال. نتيجة لذلك ، يوفر نموذج الانتكاس بعد استئصال GBM نموذجا فريدا لتكرار GBM لدراسات العلاج المحلية الفعالة للانتكاس بعد الاستئصال.
Introduction
الورم الأرومي الدبقي (GBM) هو الورم الخبيث الأكثر شيوعا بين جميع سرطانات الجهاز العصبي المركزي 1,2. الجراحة هي علاج الخط الأول للمرضى الذين يعانون من GBM ، والإشعاع الكيميائي هو العلاج المساعد الرئيسي بعد الجراحة. ومع ذلك ، غالبا ما يتطور تكرار الورم في غضون 3-6 أشهر في معظم مرضى GBM مع علاجات مختلفة3،4،5. وبالتالي ، هناك حاجة ملحة لتطوير استراتيجيات علاج أكثر فعالية لمنع تكرار GBM.
ركزت الدراسات الحديثة على GBM بشكل أساسي على الأورام الأولية بدلا من الأورام المتكررة6. ومع ذلك ، فإن المشكلة الأكثر شيوعا التي تحتاج إلى حل في العيادة هي كيفية منع تكرار GBM بعد الجراحة. لذلك ، يحتاج البحث عن تكرار GBM بعد الجراحة إلى مزيد من الاهتمام. الهلاميات المائية العلاجية المستجيبة بيولوجيا هي الناقل الأكثر شيوعا المستخدم في الدراسات حول تكرار الورم بعد الجراحة 7,8. ومع ذلك ، نظرا للهيكل الخاص للجهاز العصبي المركزي ، من الصعب تطوير نموذج مناسب لانتكاس GBM بعدالاستئصال 9 ، وهو أمر بالغ الأهمية لدراسة تكرار GBM.
ولدت هذه الدراسة نموذجا محسنا لانتكاس GBM بعد الاستئصال بناء على نموذج GBM داخل الجمجمة التقويمي المستخدم في البحث عن GBM الأولي. في هذا النموذج ، تتم إزالة معظم الأورام عن طريق الجراحة بالفحص المجهري ، ويتم الكشف عن الورم المتبقي عن طريق التصوير الحيوي في الجسم الحي وتلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E). يحاكي هذا النموذج حالة استئصال مرضى أورام المخ ويمكن استخدامه في دراسات مختلفة حول انتكاس GBM.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات والإشراف عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية ولجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة نانجينغ الطبية (IACUC-1904004). تم استخدام إناث الفئران C57BL / 6J ، الذين تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع ، في الدراسة الحالية. تم الحصول على الحيوانات من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).
1. إعداد الحيوان
- وزن الفئران وتخديرها بحقنة داخل الصفاق من 50 ملغم / كغم من الصوديوم بنتوباربيتال (انظر جدول المواد). يجب تطبيق ميلوكسيكام (5ملغ/ كغ؛ طب) لعلاج التسكين في الفترة المحيطة بالجراحة. ضع الفئران في قفص تحت دورة ضوء / مظلمة لمدة 12 ساعة / 12 ساعة ، ودرجة حرارة محيطة تبلغ 24 درجة مئوية ، ورطوبة نسبية تبلغ 50٪.
ملاحظة: بالنسبة للدراسة الحالية ، كان الوزن الأولي للفئران حوالي 22 جم. - قم بإزالة الشعر على رأس الفأر باستخدام ماكينة حلاقة المختبر ، وقم بتثبيت الرأس والأطراف على الجهاز التجسيمي (انظر جدول المواد).
ملاحظة: تعقيم جميع المعدات قبل الاستخدام. - تطهير رأس الفأر مع ما لا يقل عن ثلاث جولات بالتناوب من فرك الكلورهيكسيدين أو البوفيدون اليود تليها الكحول ، وتغطية الماوس مع ستارة جراحية معقمة. ضع مرهم العيون على كلتا العينين لمنع الجفاف.
- قطع فروة رأس الفأر حوالي 1 سم على طول خط الوسط في الجزء العلوي من الجبهة اليمنى مع مقص العيون.
ملاحظة: تأكد من المستوى الجراحي للتخدير بسبب عدم وجود منعكس دواسة قبل إجراء الشق. - قم بضبط الجهاز التجسيمي للتأكد من أن التماس متعرجة ونقطة اليافوخ الأمامية تقع في نفس المستوى.
2. بناء نموذج GBM داخل الجمجمة
- ضع علامة على النقطة 1 مم إلى الجانب الأمامي من اليافوخ الأمامي ، و 1.8 مم إلى الجانب الأيمن من اليافوخ الأمامي ، و 3 مم لأسفل من اليافوخ الأمامي باستخدام قطعة قطن مغموسة بالبنفسجالجنطيانا 2 (انظر جدول المواد).
- قم بحفر النقطة باستخدام مثقاب جمجمة صغير بقطر 1 مم (انظر جدول المواد) لإنشاء حجم مسام يبلغ قطره حوالي 1 مم وعمق 1 مم.
- قم بإزالة السائل النخاعي المنضح بقطعة قطن معقمة.
- نضح 5 ميكرولتر من تعليق الخلايا السرطانية (GL261-Luci ، 5 × 10 5 خلايا معلقة في5 ميكرولتر من PBS) مع حقنة دقيقة.
ملاحظة: تم الحصول على GL261-Luci من مصدر تجاري (انظر جدول المواد). - قم بمحاذاة طرف إبرة المحقنة الدقيقة عموديا مع فتحة حفر الجمجمة ، وأدخلها حتى يدخل طرف الإبرة إلى مستوى الجمجمة لمدة 3 مم ، وأعد الإبرة بمقدار 0.5 مم7.
- افتح المحقنة الدقيقة ، واحقنها بسرعة 1 ميكرولتر / دقيقة.
- احتفظ بالإبرة لمدة 10 دقائق بعد الحقن.
- اسحب المحقنة الدقيقة ببطء ، واضغط على نقطة الحقن باستخدام كرة قطنية جافة ومعقمة.
- خياطة فروة الرأس بخياطة جراحية غير قابلة للامتصاص (10-0 ، انظر جدول المواد) ، وتطهير الشق مرة أخرى.
- مراقبة صحة الحيوان ، والحفاظ عليه في ظروف دافئة.
- حرك الماوس مرة أخرى إلى قفص السكن بعد استيقاظ الماوس.
- تخيل الفأر مع نظام التصوير الحيوي في الجسم الحي (انظر جدول المواد) للكشف عن الورم المزروع في اليوم 10 بعد حمل الورم.
ملاحظة: تم استخدام لوسيفيراز المحمل في خلايا GBM ، GL261 ، للتصوير الحيوي.- تخدير الماوس بنسبة 1.5٪ إيزوفلوران بمعدل تدفق أكسجين يبلغ 0.6 لتر / دقيقة. بعد التأكد من عمق التخدير عن طريق عدم وجود منعكس دواسة ، قم بحقن الماوس داخل الصفاق بفلوريسئين البوتاسيوم (10 مجم / مل ، انظر جدول المواد) ، وبعد 11 ثانية ، قم بإجراء التصوير الحيوي في الجسم الحي . عندما تصل قيمة التألق إلى ~ 5 × 105 ، يكون الإجراء ناجحا.
ملاحظة: تخدير الحيوان قبل التصوير. الحفاظ على التخدير عن طريق مخروط الأنف المزود بالإيزوفلوران المتبخر.
- تخدير الماوس بنسبة 1.5٪ إيزوفلوران بمعدل تدفق أكسجين يبلغ 0.6 لتر / دقيقة. بعد التأكد من عمق التخدير عن طريق عدم وجود منعكس دواسة ، قم بحقن الماوس داخل الصفاق بفلوريسئين البوتاسيوم (10 مجم / مل ، انظر جدول المواد) ، وبعد 11 ثانية ، قم بإجراء التصوير الحيوي في الجسم الحي . عندما تصل قيمة التألق إلى ~ 5 × 105 ، يكون الإجراء ناجحا.
- حدد الفئران ذات التحمل الناجح للورم لبناء نموذج الانتكاس بعد استئصال GBM.
3. بناء نموذج الانتكاس بعد الاستئصال GBM
- عندما يصبح حجم الورم في الفئران نموذج GBM داخل الجمجمة ~ 6.5 × 105 ، حدد الفئران لنموذج الانتكاس بعد العملية الجراحية.
- وزن الفئران النموذجية GBM داخل الجمجمة ، وتخدير الفئران بحقن داخل الصفاق من 50 مجم / كجم من الصوديوم الخماسي الباربيتال. يجب تطبيق ميلوكسيكام (5ملغ/ كغ؛ طب) لعلاج التسكين في الفترة المحيطة بالجراحة.
- كرر عملية الخطوات 1.2−1.5.
- افصل أنسجة فروة الرأس والجمجمة ، وتحقق من ثقب الحفر المستخدم لبناء نموذج GBM داخل الجمجمة التقويمي. إذا التئم الثقب ، فحدد الثقب باستخدام جهاز التجسيم ، واتبع الإجراء المذكور في الخطوات 2.1-2.3.
- قم بتوسيع قطر الثقب إلى 5 مم باستخدام مثقاب الجمجمة ، وقم بإزالة السائل النخاعي المنضح بقطعة قطن معقمة.
- ركز المجهر على رأس الماوس ، واضبط الإعدادات للتأكد من وجود فتحة الحفر في وسط مجال الرؤية.
- قطع السحايا بالمقص المجهري ، وإزالة جزء من أنسجة الورم مع مكشطة صغيرة ومشرط دقيق تحت المجهر.
ملاحظة: فيما يتعلق بالسحايا ، عندما يتم فتح الجمجمة ، فإن الغشاء الرقيق القريب من أنسجة المخ هو السحايا. - وقف النزيف مع الشاش المعقم ، وغسل شق مع المياه المالحة الفسيولوجية المعقمة.
- حقن الهيدروجيل المتاح تجاريا (10 ميكرولتر ، انظر جدول المواد) في تجويف الاستئصال باستخدام حقنة سعة 1 مل ، وخياطة فروة الرأس بخياطة جراحية غير قابلة للامتصاص (10-0) ، وتطهير الشق مرة أخرى (الشكل 1).
- مراقبة صحة الحيوان ، والحفاظ على دفء الفأر.
- حرك الماوس مرة أخرى إلى قفص السكن بعد استيقاظ الماوس.
- إجراء التصوير الحيوي في الجسم الحي للكشف عن الورم المزروع بعد يوم واحد لتحديد حجم الورم المتبقي (الشكل 2 والشكل 3).
- وزن الفئران كل 2 أيام حتى نقطة النهاية الطرفية.
ملاحظة: بالنسبة للدراسة الحالية ، كانت نقطة النهاية النهائية هي اليوم 30 ، وتم القتل الرحيم للفئران بجرعة زائدة من صوديوم بنتوباربيتال مع حقن داخل الصفاق.
Representative Results
تظهر عملية بناء نموذج الانتكاس بعد الاستئصال GBM في الشكل 1. يظهر تجويف الاستئصال بعد إزالة الورم جزئيا تحت المجهر. تم حقن الهيدروجيل في تجويف الاستئصال باستخدام حقنة لإظهار التأثير العلاجي. يظهر الجدول الزمني للتصميم التجريبي في الشكل 2 أ. بعد زرع خلايا GBM في دماغ الفئران ، تم اختبار نمو الورم عن طريق التصوير الحيوي في الجسم الحي في اليوم 10. تم إجراء الاستئصال في اليوم 11 ، ثم تم حقن الهيدروجيل في تجويف الاستئصال. تم إجراء اختبار التصوير الحيوي في الجسم الحي في اليوم 15 واليوم 20 واليوم 25 واليوم 30 لمراقبة نمو الورم المتبقي. كما هو موضح في الشكل 2B ، C ، كان حجم الأورام في نموذج الانتكاس بعد الاستئصال GBM أصغر بكثير من تلك الموجودة في نموذج GBM داخل الجمجمة ، كما هو موضح في اختبار التصوير الحيوي في الجسم الحي . في اليوم 25 ، تكررت الأورام بشكل ملحوظ بعد الاستئصال (الشكل 2 د). أكد تلطيخ H&E أن نموذج الانتكاس بعد الاستئصال GBM قد تم بناؤه بنجاح وأن الأورام المتبقية تكررت بشكل كبير بعد الاستئصال (الشكل 3 أ ، ب).
الشكل 1: عرض أثناء العملية لاستئصال الورم وحقن الهيدروجيل. تمت إزالة جزء من أنسجة الورم باستخدام مكشطة صغيرة ومشرط دقيق تحت المجهر ، وتم حقن هيدروجيل في تجويف الاستئصال. قضبان المقياس: 50 ميكرومتر. تم تعديل هذا الرقم من Sun et al.10. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الجدول الزمني للتصميم التجريبي والتصوير الحيوي في الجسم الحي للفئران في نموذج GBM داخل الجمجمة وما بعد الاستئصال. (أ) يوضح جدول التصميم التجريبي أن الاستئصال قد تم إجراؤه في اليوم 11 وأن التصوير الحيوي في الجسم الحي (IV) تم إجراؤه في اليوم 10 واليوم 15 واليوم 20 واليوم 25 واليوم 30. (ب) أظهرت الفئران النموذجية GBM داخل الجمجمة حجم ورم كبير في اليوم 10 ، (ج) تم تقليل حجم الورم بشكل ملحوظ بعد الاستئصال في اليوم 11 ، و (د) زاد حجم الورم بعد الاستئصال في اليوم 25 في نموذج GBM بعد الاستئصال. تضمنت المجموعة الضابطة الفئران النموذجية لانتكاس GBM بعد الاستئصال بدون علاج. تم استخدام ما مجموعه 42 فأرا في هذه الدراسة. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. تم تعديل هذا الرقم من Sun et al.10. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صورة تلطيخ H&E لأنسجة المخ من نموذج GBM بعد الاستئصال. (أ) صورة تلطيخ H&E توضح تجويف الاستئصال والورم المتبقي وأنسجة المخ الطبيعية. تم جمع أنسجة المخ بعد 1 يوم من الاستئصال. (ب) صورة تلطيخ H&E توضح الورم المتكرر وأنسجة المخ الطبيعية. تم جمع أنسجة المخ في اليوم 12 بعد الاستئصال. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. تم تعديل هذا الرقم من Sun et al.10. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
تظل الجراحة الخيار الأول لمعظم مرضى GBM11. نظرا لخاصية النمو الغازي ل GBM ، لا يزال هناك عدد صغير من الخلايا السرطانية بعد تقنيات جراحة الأعصاب الدقيقة ، مما يؤدي إلى تكرار الورم في نهاية المطاف12. أصبحت كيفية منع تكرار GBM بعد الجراحة محور الأبحاث المتعلقة ب GBM. ومع ذلك ، نظرا للبنية التشريحية المعقدة لأنسجة المخ ، أصبح بناء نموذج GBM مناسب بعد العملية الجراحية هو المشكلة الأساسية التي يجب حلها في هذا المجال.
طورت هذه الدراسة نموذج الانتكاس بعد الاستئصال GBM. في عملية بناء هذا النموذج ، يعد بناء نموذج GBM داخل الجمجمة أمرا بالغ الأهمية. بعد تطوير هذا النموذج بنجاح ، يجب إجراء الاستئصال في الوقت المناسب. الوقت الموصى به هو عندما تكون قيمة مضان حجم الورم حوالي 6.5 × 105. للحد من وفيات الفئران ، تم إجراء الاستئصال تحت التخدير باستخدام 40 مغ / كغ 1٪ من الصوديوم بنتوباربيتال عن طريق الحقن داخل الصفاق. ومع ذلك ، كان من الصعب إجراء الاستئصال ، وغالبا ما تحركت الفئران بسبب الجرعة الصغيرة من المخدر. على هذا الأساس ، تمت زيادة جرعة المخدر إلى 50 مغ / كغ. بعد زيادة جرعة التخدير ، اختفت الاستجابات أثناء العملية للفئران ، وتم إجراء الاستئصال بنجاح. يمكن أيضا استخدام غاز الأيزوفلوران في هذا البروتوكول.
في هذه الدراسة ، تم استخدام خلايا GL261-Luci لتطوير النموذج. لذلك ، يجب استخدام المزيد من خطوط خلايا GBM للتحقق من صحة البروتوكول في المستقبل. لجعل البروتوكول أكثر إقناعا ، يجب استخدام نماذج مختلفة من الماوس GBM ، مثل نماذج الماوس GBM المعدلة وراثيا. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون التصوير بالرنين المغناطيسي أفضل وسيلة للكشف عن تكرار الأورام بعد الجراحة.
باختصار ، في هذا العمل ، تم تطوير نموذج الانتكاس بعد الاستئصال GBM. في هذا النموذج ، تتم مراقبة تكرار الورم من خلال تقييم نمو الورم المتبقي بعد الاستئصال. على الرغم من أنه لا يمكن اعتبار هذا النموذج يحاكي تكرار الورم تماما ، إلا أن أسلوب الاستئصال في هذا النموذج يشبه معيار الجراحة الآمنة القصوى في العلاج السريري لمرضى GBM. يوفر هذا العمل طريقة ملائمة ومجدية لبناء نموذج ما بعد الانتكاس GBM ويمثل تقدما في مجال البحث حول الانتكاس بعد استئصال GBM.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال منح المشروع من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82071767 و 82171781).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gentian violet | Sigma | C6158 | |
| GL261-Luci | Shanghai Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co.,Ltd. | ZQ0932 | |
| In vivo bioluminescent imaging system | Tanon | Tanon ABL X6 | |
| Laboratory animal shaver | Beyotime Biotechnology | FS600 | |
| Mice | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | ||
| Micro curette | Belevor Medical Co.,Ltd. | ||
| Micro scalpel | Belevor Medical Co.,Ltd. | ||
| Microscope | Shanghai Xiangfan Instrument Co., Ltd | JSZ5A/B | |
| Microsyringe | Hamilton | 87943 | |
| Mini cranial drill | RWD | 78001 | |
| Nonabsorbable surgical suture | Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd. | ||
| Pentobarbital sodium | ChemSrc | 57-33-0 | |
| PVA-TSPBA hydrogel | Aladdin | 9002-89-5 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD | 68043 |
References
- Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C., Weller, M. Current state of immunotherapy for glioblastoma. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (7), 422-442 (2018).
- Wang, X., et al. In situ targeting nanoparticles-hydrogel hybrid system for combined chemo-immunotherapy of glioma. Journal of Controlled Release. 345, 786-797 (2022).
- Binder, Z. A., O'Rourke, D. M. Glioblastoma: The current state of biology and therapeutic strategies. Cancer Research. 82 (5), 769-772 (2022).
- Kauer, T. M., Figueiredo, J. L., Hingtgen, S., Shah, K. Encapsulated therapeutic stem cells implanted in the tumor resection cavity induce cell death in gliomas. Nature Neuroscience. 15 (2), 197-204 (2011).
- Jiang, X., et al. Nanoparticle engineered TRAIL-overexpressing adipose-derived stem cells target and eradicate glioblastoma via intracranial delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (48), 13857-13862 (2016).
- Quail, D. F., Joyce, J. A.
- Zhang, J., et al. Immunostimulant hydrogel for the inhibition of malignant glioma relapse post-resection. Nature Nanotechnology. 16 (5), 538-548 (2021).
- Ruan, H., et al. A dual-bioresponsive drug-delivery depot for combination of epigenetic modulation and immune checkpoint blockade. Advanced Materials. 31 (17), 1806957 (2019).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Sun, S., et al. Immunostimulant in situ hydrogel improves synergetic radioimmunotherapy of malignant glioblastoma relapse post-resection. Advanced Functional Materials. 32 (43), 2205038 (2022).
- Liu, D. K., Sulman, E. P., Wen, P. Y., Kurz, S. C.
- Mellinghoff, I. K., Cloughesy, T. F. Balancing risk and efficiency in drug development for rare and challenging tumors: A new paradigm for glioma. Journal of Clinical Oncology. 40 (30), 3510-3519 (2022).
