Summary
Den nåværende protokollen etablerer en glioblastom (GBM) tilbakefallsmodell etter reseksjon ved bruk av mikroskopi for å undersøke den terapeutiske effekten av en injiserbar, bioresponsiv hydrogel in vivo.
Abstract
Tumorresidiv er en viktig faktor som indikerer dårlig prognose ved glioblastom (GBM). Mange studier forsøker å identifisere effektive terapeutiske strategier for å forhindre gjentakelse av GBM etter operasjonen. Bioresponsive terapeutiske hydrogeler som er i stand til å opprettholde lokalt frigjorte legemidler, brukes ofte til lokal behandling av GBM etter operasjonen. Forskningen er imidlertid begrenset på grunn av mangelen på en egnet GBM-modell for tilbakefall etter reseksjon. Her ble en GBM tilbakefall etter reseksjonsmodell utviklet og anvendt i terapeutiske hydrogelundersøkelser. Denne modellen ble konstruert basert på den ortotopiske intrakranielle GBM-modellen, som er mye brukt i studier på GBM. Subtotal reseksjon ble utført på ortotopisk intrakraniell GBM-modellmus for å etterligne den kliniske behandlingen. Restsvulsten ble brukt til å indikere størrelsen på tumorveksten. Denne modellen er enkel å bygge, kan bedre etterligne situasjonen for GBM kirurgisk reseksjon, og kan brukes i ulike studier på lokal behandling av GBM tilbakefall etter reseksjon. Som et resultat gir GBM-modellen for tilbakefall etter reseksjon en unik GBM-residivmodell for effektive lokale behandlingsstudier av tilbakefall etter reseksjon.
Introduction
Glioblastom (GBM) er den vanligste ondartede svulsten blant alle kreftformeri sentralnervesystemet 1,2. Kirurgi er førstelinjebehandling for pasienter med GBM, og kjemostråling er den viktigste adjuvante behandlingen etter operasjonen. Imidlertid utvikler tumorresidiv ofte innen 3-6 måneder hos de fleste GBM-pasienter med ulike behandlinger 3,4,5. Derfor er det et presserende behov for å utvikle mer effektive behandlingsstrategier for å forhindre GBM-tilbakefall.
Nylige studier på GBM har hovedsakelig fokusert på primære svulster i stedet for tilbakevendende svulster6. Imidlertid er det vanligste problemet som må løses i klinikken hvordan man hemmer tilbakefall av GBM etter operasjonen. Derfor trenger forskning på tilbakefall av GBM etter operasjonen mer oppmerksomhet. Bioresponsive terapeutiske hydrogeler er den vanligste vektoren som brukes i studier på tumorresidiv etter operasjon 7,8. På grunn av den spesielle strukturen i sentralnervesystemet er det imidlertid vanskelig å utvikle en egnet GBM-tilbakefall etter reseksjonsmodell9, som er kritisk for studiet av GBM-residiv.
Denne studien har generert en forbedret GBM-tilbakefall etter reseksjonsmodell basert på den ortotopiske intrakranielle GBM-modellen som brukes i forskning på primær GBM. I denne modellen fjernes de fleste svulstene ved kirurgi med mikroskopi, og restsvulsten påvises ved in vivo bioluminescerende avbildning og hematoksylin- og eosinfarging (H&E). Denne modellen etterligner reseksjonstilstanden til hjernesvulstpasienter og kan brukes i ulike studier på GBM-tilbakefall.
Protocol
Alle dyreforsøk ble godkjent og overvåket av Institutional Review Board og Animal Ethics Committee of Nanjing Medical University (IACUC-1904004). C57BL/6J hunnmus, i alderen 6-8 uker gamle, ble brukt i denne studien. Dyrene ble hentet fra en kommersiell kilde (se materialtabell).
1. Dyr forberedelse
- Vei musene og bedøv dem med en intraperitoneal injeksjon av 50 mg/kg pentobarbitalnatrium (se materialfortegnelse). Administrer meloksikam (5mg/kg; i.p.) ved perioperativ analgesi. Oppbevar musene i et bur under en lys/mørk syklus på 12 timer, en omgivelsestemperatur på 24 °C og en relativ fuktighet på 50 %.
MERK: For denne studien var den opprinnelige vekten av musene ca. 22 g. - Fjern håret på hodet til en mus ved hjelp av en laboratoriedyrbarbermaskin, og fest hodet og lemmer på det stereotaktiske apparatet (se materialfortegnelse).
MERK: Steriliser alt utstyr før bruk. - Desinfiser musens hode med minst tre vekslende runder klorhexidin eller povidon-jodskrubb etterfulgt av alkohol, og dekk musen med en steril kirurgisk drapering. Påfør oftalmisk salve på begge øynene for å forhindre tørking.
- Klipp musens hodebunn ca 1 cm langs midtlinjen på toppen av høyre panne med oftalmisk saks.
MERK: Bekreft anestesiens operasjonsplan ved fravær av pedalrefleks før snittet. - Still inn det stereotaktiske apparatet for å sikre at fiskebensømmen og det fremre fontanellpunktet er plassert på samme nivå.
2. Konstruksjon av den ortotopiske intrakranielle GBM-modellen
- Merk punktet 1 mm på forsiden av den fremre fontanellen, 1,8 mm på høyre side av den fremre fontanellen og 3 mm ned fra den fremre fontanellen ved hjelp av en bomullspinne dyppet med gentianfiolett2 (se materialfortegnelse).
- Bor punktet ved hjelp av et minikranialbor med en diameter på 1 mm (se Materialfortegnelse) for å lage en porestørrelse på ca. 1 mm diameter og 1 mm dybde.
- Fjern det utstrålede cerebrospinalvæsken med en steril bomullspinne.
- Aspirat 5 μL tumorcellesuspensjon (GL261-Luci, 5 × 10 5 celler suspendert i5 μL PBS) med en mikrosprøyte.
MERK: GL261-Luci ble hentet fra en kommersiell kilde (se Materialfortegnelse). - Juster nålespissen på mikrosprøyten vertikalt med skallens borehull, sett inn til nålespissen kommer inn i skalleplanet i 3 mm, og sett nålen tilbake med 0,5 mm7.
- Åpne mikrosprøyten og injiser med en hastighet på 1 μL/min.
- Behold nålen i 10 minutter etter injeksjon.
- Trekk mikrosprøyten sakte ut og trykk på injeksjonspunktet med en steril, tørr bomullsdott.
- Sutur hodebunnen med en ikke-absorberbar kirurgisk sutur (10-0, se materialtabell), og desinfiser snittet igjen.
- Overvåk dyrets helse, og hold det under varme forhold.
- Flytt musen tilbake til buret etter at musen har våknet.
- Bilde musen med et in vivo bioluminescerende bildebehandlingssystem (se materialtabell) for å oppdage den transplanterte svulsten på den 10. dagen etter tumorbærende.
MERK: Luciferase lastet i GBM-cellene, GL261, ble brukt til bioluminescerende avbildning.- Bedøv musen med 1,5 % isofluran med en oksygenstrømningshastighet på 0,6 l/min. Etter å ha bekreftet anestesidybden via mangel på pedalrefleks, injiser musen intraperitonealt med kaliumfluorescein (10 mg / ml, se materialtabellen), og 11 s senere, utfør in vivo bioluminescerende avbildning. Når fluorescensverdien når ~ 5 × 105, er prosedyren vellykket.
MERK: Bedøv dyret før avbildning. Oppretthold anestesi via nesekjegle som leveres med fordampet isofluran.
- Bedøv musen med 1,5 % isofluran med en oksygenstrømningshastighet på 0,6 l/min. Etter å ha bekreftet anestesidybden via mangel på pedalrefleks, injiser musen intraperitonealt med kaliumfluorescein (10 mg / ml, se materialtabellen), og 11 s senere, utfør in vivo bioluminescerende avbildning. Når fluorescensverdien når ~ 5 × 105, er prosedyren vellykket.
- Velg musene med vellykket tumorbærende for å konstruere GBM-tilbakefallet etter reseksjonsmodellen.
3. Konstruksjon av GBM-modellen for tilbakefall etter reseksjon
- Når tumorstørrelsen i den ortotopiske intrakranielle GBM-modellmusen blir ~6,5 × 105, velg musene for den postoperative tilbakefallsmodellen.
- Vei de ortotopiske intrakranielle GBM-modellmusene, og bedøv musene med en intraperitoneal injeksjon av 50 mg / kg pentobarbitalnatrium. Administrer meloksikam (5mg/kg; i.p.) ved perioperativ analgesi.
- Gjenta prosessen med trinn 1.2-1.5.
- Skill hodebunnsvevet og skallen, og sjekk borehullet som brukes til å bygge den ortotopiske intrakranielle GBM-modellen. Hvis hullet har helbredet, identifiser hullet ved hjelp av stereotaktisk apparat, og følg prosedyren nevnt i trinn 2.1-2.3.
- Utvid hulldiameteren til 5 mm med en skallebor, og fjern det utstrålede cerebrospinalvæsken med en steril bomullspinne.
- Fokuser mikroskopet på musens hode, og juster innstillingene for å sikre at borehullet ligger i midten av synsfeltet.
- Klipp meningene med mikrosaks, og fjern en del av svulstvevet med en mikrocurette og en mikroskalpell under mikroskopet.
MERK: Når det gjelder hjernehinnene, når skallen åpnes, er den tynne membranen nær hjernevevet meningene. - Stopp blødningen med sterilt gasbind, og vask snittet med sterilt fysiologisk saltvann.
- Injiser den kommersielt tilgjengelige hydrogelen (10 μL, se materialfortegnelse) inn i reseksjonshulen med en 1 ml sprøyte, sutur hodebunnen med en ikke-absorberbar kirurgisk sutur (10-0) og desinfiser snittet igjen (figur 1).
- Overvåk dyrets helse, og hold musen varm.
- Flytt musen tilbake til buret etter at musen har våknet.
- Utfør in vivo bioluminescerende avbildning for å påvise den transplanterte svulsten 1 dag senere for å kvantifisere størrelsen på resttumor (figur 2 og figur 3).
- Vei musene hver 2. dag til det terminale endepunktet.
MERK: For denne studien var det terminale endepunktet dag 30, og musene ble avlivet av en overdose pentobarbitalnatrium med en intraperitoneal injeksjon.
Representative Results
Prosessen med konstruksjon av GBM-tilbakefallsmodellen etter reseksjon er vist i figur 1. Reseksjonshulen etter at svulsten ble delvis fjernet under mikroskopien er vist. Hydrogelen ble injisert i reseksjonshulen med en sprøyte for å demonstrere den terapeutiske effekten. Tidsplanen for det eksperimentelle designet er vist i figur 2A. Etter at GBM-cellene ble implantert i hjernen til musene, ble tumorveksten testet ved in vivo bioluminescerende avbildning på dag 10. Reseksjonen ble utført dag 11, og hydrogelen ble deretter injisert i reseksjonshulen. In vivo bioluminescerende bildediagnostikk ble utført dag 15, dag 20, dag 25 og dag 30 for å overvåke gjenværende tumorvekst. Som vist i figur 2B,C var størrelsen på svulstene i GBM-modellen for tilbakefall etter reseksjon signifikant mindre enn i den ortotopiske intrakranielle GBM-modellen, som vist ved in vivo bioluminescerende bildetesting. Dag 25 kom svulstene signifikant tilbake etter reseksjon (figur 2D). H&E-fargingen bekreftet at GBM-modellen for tilbakefall etter reseksjon var vellykket konstruert og at restsvulster residiverte signifikant etter reseksjonen (figur 3A,B).
Figur 1 Intraoperativt bilde av tumorreseksjon og injeksjon av hydrogel. En del av tumorvevet ble fjernet med mikrocurette og mikroskalpell under mikroskopet, og hydrogel ble injisert i reseksjonshulen. Skala barer: 50 μm. Denne figuren er modifisert fra Sun et al.10. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Tidsplan for eksperimentell design og in vivo bioluminescerende avbildning av mus i intrakraniell og postreseksjon GBM-modellen. (A) Tidsplanen for det eksperimentelle designet som viser at reseksjonen ble utført på dag 11 og at in vivo bioluminescerende avbildning (IV) ble utført på dag 10, dag 15, dag 20, dag 25 og dag 30. (B) De intrakraniale GBM-modellmusene viste en stor tumorstørrelse på dag 10, (C) tumorstørrelsen ble signifikant redusert etter reseksjon på dag 11, og (D) tumorstørrelsen økte etter reseksjon på dag 25 i GBM-modellen etter reseksjon. Kontrollgruppen inkluderte GBM-tilbakefall etter reseksjonsmodellen mus uten behandling. Totalt 42 mus ble brukt i denne studien. Skala barer: 100 μm. Denne figuren er modifisert fra Sun et al.10. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: H&E-fargebilde av hjernevev fra GBM-modellen etter reseksjon. (A) Et H&E-fargebilde som viser reseksjonshulen, restsvulsten og normalt hjernevev. Hjernevevet ble samlet 1 dag etter reseksjonen. (B) Et H&E-fargebilde som demonstrerer den tilbakevendende svulsten og det normale hjernevevet. Hjernevevet ble samlet dag 12 etter reseksjonen. Skala barer: 100 μm. Denne figuren er modifisert fra Sun et al.10. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Kirurgi er fortsatt førstevalget for de fleste GBM-pasienter11. På grunn av karakteristikken for invasiv vekst av GBM, forblir et lite antall tumorceller fortsatt etter mikronevrokirurgiske teknikker, noe som resulterer i eventuell tumorresidiv12. Hvordan hemme tilbakefall av GBM etter operasjonen har blitt fokus for GBM-relatert forskning. På grunn av den komplekse anatomiske strukturen i hjernevev har konstruksjonen av en egnet postoperativ GBM-modell imidlertid blitt det primære problemet som skal løses på dette feltet.
Denne studien utviklet en GBM-modell for tilbakefall etter reseksjon. I prosessen med å konstruere denne modellen er konstruksjonen av den ortotopiske intrakranielle GBM-modellen kritisk. Etter at denne modellen er utviklet vellykket, må reseksjonen utføres til rett tid. Den anbefalte tiden er når fluorescensverdien av tumorstørrelsen er ca. 6,5 × 105. For å redusere mortaliteten hos musene ble reseksjon under anestesi utført med 40 mg/kg 1% pentobarbitalnatrium ved intraperitoneal injeksjon. Reseksjonen var imidlertid vanskelig å utføre, og musene flyttet ofte på grunn av den lille dosen av bedøvelsen. På denne bakgrunn ble anestesidosen økt til 50 mg/kg. Etter å ha økt bedøvelsesdosen forsvant musens intraoperative respons, og reseksjonen ble utført vellykket. Isofluran gass kan også brukes i denne protokollen.
I denne studien ble GL261-Luci-celler brukt til å utvikle modellen; Derfor må flere GBM-cellelinjer brukes til å validere protokollen i fremtiden. For å gjøre protokollen mer overbevisende, må forskjellige GBM-musemodeller, for eksempel genetisk konstruerte GBM-musemodeller, brukes. I tillegg kan MR være den beste måten å oppdage tilbakefall av svulster etter operasjonen.
Oppsummert er det i dette arbeidet utviklet en GBM-modell for tilbakefall etter reseksjon. I denne modellen overvåkes tumorresidiv ved å vurdere resttumorens vekst etter reseksjon. Selv om denne modellen ikke kan anses å fullstendig etterligne tumorresidiv, er reseksjonsstilen i denne modellen lik standarden for maksimalt sikker kirurgi i klinisk behandling av GBM-pasienter. Dette arbeidet gir en praktisk og gjennomførbar metode for å konstruere GBM-tilbakefallsmodellen etter reseksjon og representerer et fremskritt innen forskning på GBM-tilbakefall etter reseksjon.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av prosjekttilskudd fra The National Natural Science Foundation of China (82071767 og 82171781).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gentian violet | Sigma | C6158 | |
| GL261-Luci | Shanghai Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co.,Ltd. | ZQ0932 | |
| In vivo bioluminescent imaging system | Tanon | Tanon ABL X6 | |
| Laboratory animal shaver | Beyotime Biotechnology | FS600 | |
| Mice | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | ||
| Micro curette | Belevor Medical Co.,Ltd. | ||
| Micro scalpel | Belevor Medical Co.,Ltd. | ||
| Microscope | Shanghai Xiangfan Instrument Co., Ltd | JSZ5A/B | |
| Microsyringe | Hamilton | 87943 | |
| Mini cranial drill | RWD | 78001 | |
| Nonabsorbable surgical suture | Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd. | ||
| Pentobarbital sodium | ChemSrc | 57-33-0 | |
| PVA-TSPBA hydrogel | Aladdin | 9002-89-5 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD | 68043 |
References
- Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C., Weller, M. Current state of immunotherapy for glioblastoma. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (7), 422-442 (2018).
- Wang, X., et al. In situ targeting nanoparticles-hydrogel hybrid system for combined chemo-immunotherapy of glioma. Journal of Controlled Release. 345, 786-797 (2022).
- Binder, Z. A., O'Rourke, D. M. Glioblastoma: The current state of biology and therapeutic strategies. Cancer Research. 82 (5), 769-772 (2022).
- Kauer, T. M., Figueiredo, J. L., Hingtgen, S., Shah, K. Encapsulated therapeutic stem cells implanted in the tumor resection cavity induce cell death in gliomas. Nature Neuroscience. 15 (2), 197-204 (2011).
- Jiang, X., et al. Nanoparticle engineered TRAIL-overexpressing adipose-derived stem cells target and eradicate glioblastoma via intracranial delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (48), 13857-13862 (2016).
- Quail, D. F., Joyce, J. A.
- Zhang, J., et al. Immunostimulant hydrogel for the inhibition of malignant glioma relapse post-resection. Nature Nanotechnology. 16 (5), 538-548 (2021).
- Ruan, H., et al. A dual-bioresponsive drug-delivery depot for combination of epigenetic modulation and immune checkpoint blockade. Advanced Materials. 31 (17), 1806957 (2019).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Sun, S., et al. Immunostimulant in situ hydrogel improves synergetic radioimmunotherapy of malignant glioblastoma relapse post-resection. Advanced Functional Materials. 32 (43), 2205038 (2022).
- Liu, D. K., Sulman, E. P., Wen, P. Y., Kurz, S. C.
- Mellinghoff, I. K., Cloughesy, T. F. Balancing risk and efficiency in drug development for rare and challenging tumors: A new paradigm for glioma. Journal of Clinical Oncology. 40 (30), 3510-3519 (2022).
