Summary
本プロトコルは、注射可能な生体応答性ヒドロゲルの治療効果をin vivoで調査するために、顕微鏡を使用して膠芽腫(GBM)再発切除後モデルを確立します。
Abstract
腫瘍の再発は、膠芽腫(GBM)の予後不良を示す重要な要因です。多くの研究は、手術後のGBMの再発を防ぐための効果的な治療戦略を特定しようとしています。局所的に放出された薬物を持続させることができる生体応答性治療用ヒドロゲルは、手術後のGBMの局所治療に頻繁に使用される。しかし、適切なGBM再発切除後モデルがないため、研究は限られています。ここでは、GBM再発切除後モデルが開発され、治療用ヒドロゲル研究に適用されました。このモデルは、GBMの研究で広く使用されている同所性頭蓋内GBMモデルに基づいて構築されました。亜全摘術は、臨床治療を模倣するために同所性頭蓋内GBMモデルマウスに対して実施した。残存腫瘍は、腫瘍増殖の大きさを示すために使用された。このモデルは構築が容易で、GBM外科的切除の状況をよりよく模倣することができ、切除後のGBM再発の局所治療に関するさまざまな研究に適用できます。その結果、GBM再発切除後モデルは、切除後の再発の効果的な局所治療研究のための独自のGBM再発モデルを提供します。
Introduction
膠芽腫(GBM)は、すべての中枢神経系がんの中で最も一般的な悪性腫瘍です1,2。手術は多形性膠芽腫患者の第一選択治療であり、化学放射線療法は手術後の主な補助療法です。しかし、腫瘍の再発は、さまざまな治療を受けているほとんどのGBM患者で3〜6か月以内に発症することがよくあります3、4、5。したがって、GBMの再発を防ぐためのより効果的な治療戦略を開発することが急務です。
GBMに関する最近の研究は、再発腫瘍ではなく、主に原発腫瘍に焦点を当てています6。しかし、診療所で解決する必要がある最も一般的な問題は、手術後のGBMの再発をどのように抑制するかです。したがって、手術後のGBMの再発に関する研究には、より注意が必要です。生体応答性治療用ヒドロゲルは、手術後の腫瘍再発に関する研究で使用される最も一般的なベクターです7,8。しかし、中枢神経系の特殊な構造のために、GBM再発の研究に重要な適切なGBM再発後モデル9を開発することは困難です。
この研究は、原発性GBMの研究で使用された同所性頭蓋内GBMモデルに基づいて、改善されたGBM再発後切除モデルを生成しました。このモデルでは、ほとんどの腫瘍は顕微鏡による手術によって切除され、残存腫瘍は in vivo 生物発光イメージングとヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色によって検出されます。このモデルは、脳腫瘍患者の切除状態を模倣しており、GBM再発に関するさまざまな研究に使用できます。
Protocol
すべての動物実験は、南京医科大学の治験審査委員会と動物倫理委員会(IACUC-1904004)によって承認および監督されました。6〜8週齢のC57BL / 6J雌マウスを本研究に使用しました。動物は商業的な供給源から入手した( 材料表を参照)。
1.動物の準備
- マウスの体重を量り、50 mg / kgペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射で麻酔します(材料表を参照)。周術期鎮痛のためにメロキシカム(5mg / kg;i.p.)を投与します。.マウスをケージに12時間/12時間の明暗サイクル、周囲温度24°C、相対湿度50%で収容します。
注:本試験では、マウスの初期体重は約22gであった。 - 実験動物のシェーバーを使用してマウスの頭の毛を取り除き、頭と手足を定位固定装置に固定します( 材料表を参照)。
注意: 使用前にすべての機器を滅菌してください。 - マウスの頭部を少なくとも3回のクロルヘキシジンまたはポビドンヨードスクラブとそれに続くアルコールで消毒し、マウスを滅菌外科用ドレープで覆う。乾燥を防ぐために両目に眼科用軟膏を塗ります。
- マウスの頭皮を眼科用ハサミで右額上部の正中線に沿って約1cm切ります。
注:切開を行う前に、ペダル反射がないことで麻酔の手術面を確認してください。 - 固定装置を調整して、ヘリンボーンの縫い目と前面の泉門ポイントが同じレベルにあることを確認します。
2. 同所性頭蓋内GBMモデルの構築
- ゲンチアナバイオレット2を浸した綿棒を使用して、前面泉門の前面に1 mm、前面泉門の右側に1.8 mm、前面泉門から 3 mm下のポイントに印を付けます( 材料表を参照)。
- 直径1 mmのミニ頭蓋ドリル( 材料表を参照)を使用してポイントをドリルし、直径約1 mm、深さ1 mmの細孔サイズを作成します。
- 滲出した脳脊髄液を滅菌綿棒で取り除きます。
- 5 μLの腫瘍細胞懸濁液(GL261-Luci、5 μLのPBSに懸濁した5 × 105 細胞)をマイクロシリンジで吸引します。
注意: GL261-Luciは市販のソースから入手しました( 材料表を参照)。 - マイクロシリンジの針先を頭蓋骨のドリル穴に垂直に合わせ、針先が頭蓋骨面に3 mm入るまで挿入し、針を0.5 mm7戻します。
- マイクロシリンジを開き、1μL/minの速度で注入します。
- 注射後10分間針を保持します。
- マイクロシリンジをゆっくりと引き出し、滅菌乾燥綿球で注入ポイントを押します。
- 非吸収性の外科用縫合糸(10-0、 材料表を参照)で頭皮を縫合し、切開部を再度消毒します。
- 動物の健康状態を監視し、暖かい状態に保ちます。
- マウスがウェイクアップしたら、マウスをハウジングケージに戻します。
- in vivo生物発光イメージングシステム(材料表を参照)でマウスを画像化し、担癌後10日目に移植腫瘍を検出します。
注:GBM細胞にロードされたルシフェラーゼGL261を生物発光イメージングに使用しました。- 0.6L/minの酸素流量で1.5%イソフルランでマウスに麻酔をかけます。ペダル反射の欠如による麻酔深度を確認した後、フルオレセインカリウム(10 mg/mL、 材料表参照)をマウス腹腔内注射し、11秒後に in vivo 生物発光イメージングを行います。蛍光値が~5 × 105に達すると、手順は成功します。
注意: イメージングする前に動物に麻酔をかけてください。気化したイソフルランが付属するノーズコーンを介して麻酔を維持します。.
- 0.6L/minの酸素流量で1.5%イソフルランでマウスに麻酔をかけます。ペダル反射の欠如による麻酔深度を確認した後、フルオレセインカリウム(10 mg/mL、 材料表参照)をマウス腹腔内注射し、11秒後に in vivo 生物発光イメージングを行います。蛍光値が~5 × 105に達すると、手順は成功します。
- 担癌に成功したマウスを選択し、GBM再発切除後モデルを構築した。
3. GBM切除後再発モデルの構築
- 同所性頭蓋内GBMモデルマウスにおける腫瘍サイズが~6.5×105になった時点で、術後再発モデル用のマウスを選択する。
- 同所性頭蓋内GBMモデルマウスの体重を量り、50 mg / kgペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射でマウスに麻酔をかけます。周術期鎮痛のためにメロキシカム(5mg / kg;i.p.)を投与します。.
- 手順1.2−1.5のプロセスを繰り返します。
- 頭皮組織と頭蓋骨を分離し、同所性頭蓋内GBMモデルの構築に使用したドリル穴を確認します。穴が治癒した場合は、定位装置を使用して穴を特定し、手順2.1〜2.3に記載されている手順に従います。
- 頭蓋骨ドリルで穴の直径を5 mmに拡大し、滅菌綿棒で滲出した脳脊髄液を取り除きます。
- 顕微鏡をマウスの頭に合わせ、設定を調整して、ドリル穴が視野の中央に配置されるようにします。
- マイクロハサミで髄膜を切断し、顕微鏡下でマイクロキュレットとマイクロメスで腫瘍組織の一部を取り除きます。
注:髄膜に関しては、頭蓋骨を開くと、脳組織に近い薄い膜が髄膜になります。 - 滅菌ガーゼで出血を止め、滅菌生理食塩水で切開部を洗浄します。
- 市販のハイドロゲル(10 μL、 材料表参照)を1 mLシリンジで切除腔内に注入し、非吸収性の外科用縫合糸(10-0)で頭皮を縫合し、切開部を再度消毒します(図1)。
- 動物の健康状態を監視し、マウスを暖かく保ちます。
- マウスがウェイクアップしたら、マウスをハウジングケージに戻します。
- 1日後に移植腫瘍を検出するために in vivo 生物発光イメージングを行い、残存腫瘍の大きさを定量化した(図2 及び 図3)。
- 終端まで2日ごとにマウスの体重を測定します。
注:本研究では、最終エンドポイントは30日目であり、マウスは腹腔内注射によるペントバルビタールナトリウムの過剰摂取によって安楽死させました。
Representative Results
GBM再発切除後モデルの構築過程を図1に示す。腫瘍を部分的に切除した後の切除腔を顕微鏡下で示す。ヒドロゲルをシリンジで切除腔に注入し、治療効果を実証した。実験計画のスケジュールを図2Aに示す。GBM細胞をマウスの脳に移植した後、腫瘍増殖を10日目にin vivo生物発光イメージングにより試験した。切除は11日目に行われ、その後、ヒドロゲルを切除腔に注入した。in vivo生物発光イメージング試験を15日目、20日目、25日目、および30日目に実施して、残存腫瘍の成長を監視しました。図2B,Cに示すように、GBM再発切除後モデルの腫瘍のサイズは、in vivo生物発光イメージング試験によって示されるように、同所性頭蓋内GBMモデルの腫瘍のサイズよりも有意に小さかった。25日目に、腫瘍は切除後に有意に再発した(図2D)。H&E染色により、GBM切除後再発モデルが正常に構築され、切除後に残存腫瘍が有意に再発することが確認されました(図3A、B)。
図1:腫瘍切除およびハイドロゲルの注射の術中図。顕微鏡下で腫瘍組織の一部をマイクロキュレットとマイクロメスで切除し、ヒドロゲルを切除腔に注入した。スケールバー:50μm。この図はSunらから修正されています10。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:頭蓋内および切除後のGBMモデルにおけるマウスの実験デザインおよび in vivo 生物発光イメージングのスケジュール。 (A)切除が11日目に行われ、 in vivo 生物発光イメージング(IV)が10日目、15日目、20日目、25日目、および30日目に実施されたことを示す実験デザインのスケジュール。(B)頭蓋内GBMモデルマウスは10日目に大きな腫瘍サイズを示し、(C)切除後GBMモデルでは11日目の切除後に腫瘍サイズが有意に縮小し、(D)切除後GBMモデルでは25日目の切除後に腫瘍サイズが大きくなりました。対照群には、無治療のGBM再発切除後モデルマウスが含まれていました。この研究では合計42匹のマウスを使用した。スケールバー:100μm。この図はSunらから修正されています10。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:切除後GBMモデルからの脳組織のH&E染色画像 。 (A)切除腔、残存腫瘍、および正常な脳組織を示すH&E染色画像。脳組織は切除の1日後に採取した。(B)再発腫瘍および正常な脳組織を示すH&E染色画像。脳組織は切除後12日目に採取した。スケールバー:100μm。この図はSunらから修正されています10。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
手術は、ほとんどのGBM患者にとって依然として最初の選択肢です11。GBMの浸潤性増殖の特徴により、マイクロ脳神経外科技術の後も少数の腫瘍細胞が依然として残り、最終的に腫瘍が再発します12。手術後のGBMの再発を抑制する方法は、GBM関連の研究の焦点となっています。しかし、脳組織の複雑な解剖学的構造のために、適切な術後GBMモデルの構築がこの分野で解決されるべき主要な問題となっています。
この研究では、GBM再発切除後モデルを開発しました。このモデルを構築するプロセスでは、同所性頭蓋内GBMモデルの構築が重要です。このモデルの開発に成功した後、切除は適切なタイミングで実行する必要があります。推奨時間は、腫瘍サイズの蛍光値が約6.5 × 105の場合です。マウスの死亡率を低下させるために、腹腔内注射により40 mg / kg 1%ペントバルビタールナトリウムで麻酔下での切除が行われました。.しかし、切除は困難であり、麻酔薬の投与量が少ないためマウスはしばしば動きました。これに基づいて、麻酔薬の用量は50 mg / kgに増加しました。.麻酔用量を増加させた後、マウスの術中反応は消失し、切除は正常に行われた。イソフルランガスもこのプロトコルで使用することができます。
この研究では、GL261-Luci細胞を使用してモデルを開発しました。したがって、将来的にプロトコルを検証するために、より多くのGBM細胞株を使用する必要があります。プロトコルをより説得力のあるものにするために、遺伝子操作されたGBMマウスモデルなどの様々なGBMマウスモデルを使用する必要がある。さらに、MRIは手術後の腫瘍の再発を検出するための最良の手段かもしれません。
要約すると、この研究では、GBM再発切除後モデルが開発されました。このモデルでは、切除後の残存腫瘍の成長を評価することにより、腫瘍の再発を監視します。このモデルは腫瘍の再発を完全に模倣するとは言えませんが、このモデルの切除スタイルは、GBM患者の臨床治療における最大限に安全な手術の標準に似ています。この研究は、切除後のGBM再発モデルを構築するための便利で実行可能な方法を提供し、切除後のGBM再発に関する研究の分野における進歩を表しています。
Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学財団(82071767および82171781)からのプロジェクト助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gentian violet | Sigma | C6158 | |
| GL261-Luci | Shanghai Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co.,Ltd. | ZQ0932 | |
| In vivo bioluminescent imaging system | Tanon | Tanon ABL X6 | |
| Laboratory animal shaver | Beyotime Biotechnology | FS600 | |
| Mice | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | ||
| Micro curette | Belevor Medical Co.,Ltd. | ||
| Micro scalpel | Belevor Medical Co.,Ltd. | ||
| Microscope | Shanghai Xiangfan Instrument Co., Ltd | JSZ5A/B | |
| Microsyringe | Hamilton | 87943 | |
| Mini cranial drill | RWD | 78001 | |
| Nonabsorbable surgical suture | Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd. | ||
| Pentobarbital sodium | ChemSrc | 57-33-0 | |
| PVA-TSPBA hydrogel | Aladdin | 9002-89-5 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD | 68043 |
References
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