Summary
本协议使用显微镜建立了胶质母细胞瘤（GBM）复发切除后模型，以研究体内可注射生物反应性 水凝胶的治疗效果。
Abstract
肿瘤复发是指示胶质母细胞瘤 （GBM） 预后不良的重要因素。许多研究正试图确定有效的治疗策略，以防止手术后GBM复发。能够维持局部释放药物的生物反应性治疗水凝胶经常用于手术后GBM的局部治疗。然而，由于缺乏合适的GBM复发术后模型，研究受到限制。在这里，开发了一种GBM复发切除后模型并将其应用于治疗性水凝胶研究。该模型基于原位颅内GBM模型构建，该模型在GBM研究中得到广泛应用。对原位颅内GBM模型小鼠进行次全切除以模拟临床治疗。残留肿瘤用于指示肿瘤生长的大小。该模型易于构建，可以更好地模拟GBM手术切除的情况，并且可以应用于GBM切除后复发局部治疗的各种研究。因此，GBM切除后复发模型为切除后复发的有效局部治疗研究提供了独特的GBM复发模型。
Introduction
胶质母细胞瘤（GBM）是所有中枢神经系统癌症中最常见的恶性肿瘤1,2。手术是GBM患者的一线治疗，放化疗是术后的主要辅助治疗。然而，大多数接受各种治疗的GBM患者通常在3-6个月内发生肿瘤复发3,4,5。因此，迫切需要制定更有效的治疗策略来预防GBM复发。
最近关于GBM的研究主要集中在原发性肿瘤而不是复发性肿瘤6。然而，临床上最常需要解决的问题是如何抑制GBM术后的复发。因此，关于GBM术后复发的研究需要更多关注。生物反应性治疗性水凝胶是手术后肿瘤复发研究中最常用的载体7,8。然而，由于中枢神经系统的特殊结构，很难开发出合适的GBM复发术后模型9，这对于GBM复发的研究至关重要。
本研究基于原发性GBM研究中使用的原位颅内GBM模型，产生了改进的GBM复发术后模型。在该模型中，大多数肿瘤通过显微镜手术切除，并通过 体内 生物发光成像和苏木精和伊红（H&E）染色检测残留肿瘤。该模型模拟脑肿瘤患者的切除状态，可用于GBM复发的各种研究。
Protocol
所有动物实验均由南京医科大学机构评审委员会和动物伦理委员会（IACUC-1904004）批准和监督。年龄为6-8周龄的C57BL / 6J雌性小鼠用于本研究。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。
1. 动物制备
- 称量小鼠，并用腹膜内注射50mg / kg戊巴比妥钠麻醉它们（见材料表）。给予美洛昔康（5mg / kg;腹膜内）用于围手术期镇痛。将小鼠饲养在笼子中，在12小时/ 12小时光照/黑暗循环，环境温度为24°C，相对湿度为50%。
注意：对于本研究，小鼠的初始重量约为22g。 - 使用实验动物剃须刀去除小鼠头部的毛发，并将头部和四肢固定在立体定位装置上（见 材料表）。
注意：使用前对所有设备进行消毒。 - 用至少三轮交替的洗必泰或聚维酮碘磨砂膏消毒小鼠头部，然后用酒精消毒，并用无菌手术布覆盖小鼠。在双眼上涂抹眼药膏以防止干燥。
- 用眼科剪刀沿右额头顶部的中线切开小鼠的头皮约1厘米。
注意：在切口之前，通过没有踏板反射来确认麻醉的手术平面。 - 调整立体定位装置，以确保人字形接缝和前囟门点位于同一水平面。
2. 原位颅内GBM模型的构建
- 使用蘸有龙胆紫2 的棉签将点标记到前囟门正面 1 毫米，在前囟门右侧 1.8 毫米，从前囟门向下标记 3 毫米（见 材料表）。
- 使用直径为1毫米的迷你颅骨钻（见 材料表）钻孔该点，以产生直径约1毫米，深度为1毫米的孔径。
- 用无菌棉签清除渗出的脑脊液。
- 用微量注射器吸出 5 μL 肿瘤细胞悬液（GL261-Luci，5 × 10 5 个细胞悬浮在5 μL PBS 中）。
注意：GL261-Luci是从商业来源获得的（见 材料表）。 - 将微量注射器的针尖垂直对准颅骨钻孔，插入直到针尖进入颅面3毫米，然后返回针头0.5毫米7。
- 打开微量注射器，以1μL / min的速度注射。
- 注射后将针头保留10分钟。
- 慢慢取出微量注射器，并用无菌干棉球按压注射点。
- 用不可吸收的手术缝合线缝合头皮（10-0，见 材料表），然后再次对切口进行消毒。
- 监测动物的健康状况，并将其保持在温暖的条件下。
- 鼠标唤醒后，将鼠标移回外壳笼。
- 用 体内 生物发光成像系统（参见 材料表）对小鼠进行成像，以在荷瘤后第10天检测移植的肿瘤。
注意：加载在GBM细胞GL261中的荧光素酶用于生物发光成像。- 用1.5%异氟醚麻醉小鼠，氧流速为0.6L / min。通过缺乏踏板反射确认麻醉深度后，腹膜内注射荧光素钾（10mg / mL，参见 材料表），11秒后，进行 体内 生物发光成像。当荧光值达到~5×105时，该过程成功。
注意：在成像前麻醉动物。通过提供汽化异氟醚的鼻锥维持麻醉。
- 用1.5%异氟醚麻醉小鼠，氧流速为0.6L / min。通过缺乏踏板反射确认麻醉深度后，腹膜内注射荧光素钾（10mg / mL，参见 材料表），11秒后，进行 体内 生物发光成像。当荧光值达到~5×105时，该过程成功。
- 选择成功携带肿瘤的小鼠构建GBM复发术后模型。
3. GBM切除后复发模型的构建
- 当原位颅内GBM模型小鼠中的肿瘤大小变为~6.5×105时，选择小鼠用于术后复发模型。
- 称量原位颅内GBM模型小鼠，并用腹膜内注射50mg / kg戊巴比妥钠麻醉小鼠。给予美洛昔康（5mg / kg;腹膜内）用于围手术期镇痛。
- 重复步骤 1.2−1.5 的过程。
- 分离头皮组织和颅骨，并检查用于构建原位颅内GBM模型的钻孔。如果孔已经愈合，请使用立体定向装置识别孔，并按照步骤2.1-2.3中提到的步骤进行操作。
- 用颅骨钻将孔直径扩大到 5 毫米，并用无菌棉签去除渗出的脑脊液。
- 将显微镜对准鼠标头部，并调整设置以确保钻孔位于视野中心。
- 用显微镜刀切割脑膜，并在显微镜下用微刮匙和微型手术刀去除部分肿瘤组织。
注意：关于脑膜，当颅骨打开时，靠近脑组织的薄膜就是脑膜。 - 用无菌纱布止血，并用无菌生理盐水清洗切口。
- 用1mL注射器将市售水凝胶（10μL，见 材料表）注入切除腔，用不可吸收的手术缝合线（10-0）缝合头皮，然后再次消毒切口（图1）。
- 监测动物的健康状况，并保持鼠标温暖。
- 鼠标唤醒后，将鼠标移回外壳笼。
- 进行 体内 生物发光成像以在1天后检测移植的肿瘤，以量化残留肿瘤的大小（图2 和 图3）。
- 每2天称量小鼠，直到终末终点。
注意：对于本研究，终点为第30天，小鼠通过腹膜内注射过量的戊巴比妥钠对小鼠实施安乐死。
Representative Results
GBM复发切除后模型的构建过程如图1所示。在显微镜下部分切除肿瘤后的切除腔如图所示。用水凝胶用注射器注射到切除腔中以证明治疗效果。实验设计的时间表如图2A所示。将GBM细胞植入小鼠大脑后，在第10天通过体内生物发光成像测试肿瘤生长。在第11天进行切除，然后将水凝胶注射到切除腔中。在第15天，第20天，第25天和第30天进行体内生物发光成像测试，以监测残留肿瘤生长。如图2B，C所示，GBM复发术后切除模型中的肿瘤大小明显小于原位颅内GBM模型中的肿瘤大小，如体内生物发光成像测试所示。在第25天，肿瘤在切除后显着复发（图2D）。H&E染色证实GBM复发切除后模型构建成功，切除后残留肿瘤显着复发（图3A，B）。
图1：肿瘤切除和注射水凝胶的术中视图。 在显微镜下用微刮匙和微型手术刀切除部分肿瘤组织，并将水凝胶注射到切除腔中。比例尺：50 μm。这个数字是从Sun等人10修改而来的。 请点击此处查看此图的大图。
图2：颅内和切除后GBM模型中小鼠的实验设计和 体内 生物发光成像时间表。 （A）实验设计的时间表显示，切除在第11天进行， 体内 生物发光成像（IV）在第10天，第15天，第20天，第25天和第30天进行。（B）颅内GBM模型小鼠在第10天显示较大的肿瘤大小，（C）第11天切除后肿瘤大小显着减小，（D）在切除后GBM模型中第25天切除后肿瘤大小增加。对照组包括未治疗的GBM复发术后模型小鼠。本研究共使用了42只小鼠。比例尺：100 μm。这个数字是从Sun等人10修改而来的。 请点击此处查看此图的大图。
图3：来自切除后GBM模型的脑组织的H&E染色图像。 （A）显示切除腔，残留肿瘤和正常脑组织的H&E染色图像。切除后1天收集脑组织。（B）显示复发性肿瘤和正常脑组织的H&E染色图像。在切除后第12天收集脑组织。比例尺：100 μm。这个数字是从Sun等人10修改而来的。 请点击此处查看此图的大图。
Discussion
手术仍然是大多数GBM患者的首选11。由于GBM侵入性生长的特征，在显微神经外科技术后仍有少量肿瘤细胞残留，导致最终肿瘤复发12。如何抑制GBM术后复发已成为GBM相关研究的热点。然而，由于脑组织的解剖结构复杂，构建合适的术后GBM模型已成为该领域需要解决的首要问题。
本研究开发了一种GBM切除后复发模型。在构建该模型的过程中，原位颅内GBM模型的构建至关重要。成功开发该模型后，需要在正确的时间进行切除。推荐的时间是当肿瘤大小的荧光值约为6.5×105时。为了降低小鼠的死亡率，在麻醉下用40mg / kg 1%戊巴比妥钠腹膜内注射进行切除。然而，切除很难进行，并且由于麻醉剂剂量小，小鼠经常移动。在此基础上，麻醉剂的剂量增加至50mg / kg。增加麻醉剂量后，小鼠术中反应消失，切除成功。异氟醚气体也可用于该协议。
在这项研究中，GL261-Luci细胞用于开发模型;因此，将来必须使用更多的GBM细胞系来验证该方案。为了使协议更具说服力，需要使用各种GBM小鼠模型，例如基因工程GBM小鼠模型。此外，MRI可能是检测手术后肿瘤复发的最佳方法。
综上所述，在这项工作中，已经建立了GBM复发术后模型。在该模型中，通过评估切除后残留肿瘤的生长来监测肿瘤复发。虽然该模型不能被认为完全模仿肿瘤复发，但该模型中的切除方式类似于GBM患者临床治疗中最大安全手术的标准。本工作为构建GBM切除后复发模型提供了一种方便可行的方法，代表了GBM切除后复发研究领域的进展。
Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了中国国家自然科学基金（82071767和82171781）的项目资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gentian violet | Sigma | C6158 | |
| GL261-Luci | Shanghai Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co.,Ltd. | ZQ0932 | |
| In vivo bioluminescent imaging system | Tanon | Tanon ABL X6 | |
| Laboratory animal shaver | Beyotime Biotechnology | FS600 | |
| Mice | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | ||
| Micro curette | Belevor Medical Co.,Ltd. | ||
| Micro scalpel | Belevor Medical Co.,Ltd. | ||
| Microscope | Shanghai Xiangfan Instrument Co., Ltd | JSZ5A/B | |
| Microsyringe | Hamilton | 87943 | |
| Mini cranial drill | RWD | 78001 | |
| Nonabsorbable surgical suture | Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd. | ||
| Pentobarbital sodium | ChemSrc | 57-33-0 | |
| PVA-TSPBA hydrogel | Aladdin | 9002-89-5 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD | 68043 |
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