Summary
Detta protokoll etablerar en glioblastom (GBM) återfallsmodell efter resektion med mikroskopi för att undersöka den terapeutiska effekten av en injicerbar, bioresponsiv hydrogel in vivo.
Abstract
Tumöråterfall är en viktig faktor som indikerar en dålig prognos vid glioblastom (GBM). Många studier försöker identifiera effektiva terapeutiska strategier för att förhindra återfall av GBM efter operation. Bioresponsiva terapeutiska hydrogeler som kan upprätthålla lokalt frisatta läkemedel används ofta för lokal behandling av GBM efter operation. Forskningen är dock begränsad på grund av bristen på en lämplig GBM-återfallsmodell efter resektion. Här utvecklades och tillämpades en GBM-återfallsmodell efter resektion i terapeutiska hydrogelundersökningar. Denna modell konstruerades baserat på den ortotopiska intrakraniella GBM-modellen, som används allmänt i studier på GBM. Subtotal resektion utfördes på den ortotopiska intrakraniella GBM-modellmusen för att efterlikna den kliniska behandlingen. Den kvarvarande tumören användes för att indikera storleken på tumörtillväxten. Denna modell är lätt att bygga, kan bättre efterlikna situationen för GBM-kirurgisk resektion och kan tillämpas i olika studier om lokal behandling av GBM-återfall efter resektion. Som ett resultat ger GBM-återfallsmodellen en unik GBM-återfallsmodell för effektiva lokala behandlingsstudier av återfall efter resektion.
Introduction
Glioblastom (GBM) är den vanligaste maligna tumören bland alla cancerformer i centrala nervsystemet 1,2. Kirurgi är första linjens behandling för patienter med GBM, och kemostrålning är den viktigaste adjuvansbehandlingen efter operation. Tumöråterfall utvecklas dock ofta inom 3-6 månader hos de flesta GBM-patienter med olika behandlingar 3,4,5. Därför finns det ett akut behov av att utveckla effektivare behandlingsstrategier för att förhindra GBM-återfall.
Nya studier på GBM har främst fokuserat på primära tumörer snarare än återkommande tumörer6. Det vanligaste problemet som behöver lösas i kliniken är dock hur man hämmar återfall av GBM efter operationen. Därför behöver forskning om återfall av GBM efter operation mer uppmärksamhet. Bioresponsiva terapeutiska hydrogeler är den vanligaste vektorn som används i studier på tumöråterfall efter operation 7,8. På grund av den speciella strukturen i centrala nervsystemet är det dock svårt att utveckla en lämplig GBM-återfall efter resektionsmodell9, vilket är avgörande för studien av GBM-återfall.
Denna studie har genererat en förbättrad GBM-återfallsmodell efter resektion baserad på den ortotopiska intrakraniella GBM-modellen som används i forskning om primär GBM. I denna modell avlägsnas de flesta tumörerna genom kirurgi med mikroskopi, och den kvarvarande tumören detekteras genom in vivo bioluminescerande avbildning och hematoxylin och eosin (H &E) färgning. Denna modell efterliknar resektionstillståndet hos hjärntumörpatienter och kan användas i olika studier på GBM-återfall.
Protocol
Alla djurförsök godkändes och övervakades av Institutional Review Board och Animal Ethics Committee of Nanjing Medical University (IACUC-1904004). C57BL/6J honmöss i åldern 6-8 veckor användes för den aktuella studien. Djuren erhölls från en kommersiell källa (se Materialförteckning).
1. Beredning av djur
- Väg mössen och bedöva dem med en intraperitoneal injektion av 50 mg/kg pentobarbitalnatrium (se Materialförteckning). Administrera meloxikam (5 mg/kg; i.p.) för perioperativ analgesi. Håll mössen i en bur under en 12 h/12 h ljus/mörk cykel, en omgivningstemperatur på 24 °C och en relativ luftfuktighet på 50%.
OBS: För den aktuella studien var mössens initialvikt cirka 22 g. - Ta bort håret på mushuvudet med hjälp av en rakapparat för försöksdjur och fixera huvudet och lemmarna på den stereotaxiska apparaten (se Materialförteckning).
OBS: Sterilisera all utrustning före användning. - Desinficera musens huvud med minst tre alternerande omgångar klorhexidin eller povidon-jodskrubb följt av alkohol och täck musen med ett sterilt kirurgiskt draperi. Applicera oftalmisk salva på båda ögonen för att förhindra torkning.
- Skär musens hårbotten ca 1 cm längs mittlinjen på toppen av höger panna med oftalmisk sax.
OBS: Bekräfta det kirurgiska anestesiplanet genom frånvaro av pedalreflex innan snittet görs. - Ställ in den stereotaxiska apparaten för att säkerställa att fiskbenssömmen och den främre fontanellpunkten ligger på samma nivå.
2. Konstruktion av den ortotopiska intrakraniella GBM-modellen
- Markera punkten 1 mm på framsidan av den främre fontanellen, 1,8 mm till höger om den främre fontanellen och 3 mm ner från den främre fontanellen med en bomullspinne doppad med gentianviolett2 (se Materialtabell).
- Borra punkten med en minikranialborr med en diameter på 1 mm (se Materialförteckning) för att skapa en porstorlek på cirka 1 mm diameter och 1 mm djup.
- Ta bort den utsöndrade cerebrospinalvätskan med en steril bomullspinne.
- Aspirera 5 μL tumörcellssuspension (GL261-Luci, 5 × 10 5 celler suspenderade i5 μL PBS) med en mikrospruta.
GL261-Luci erhölls från en kommersiell källa (se materialförteckning). - Rikta in nålspetsen på mikrosprutan vertikalt mot skallborrhålet, sätt in tills nålspetsen kommer in i skalleplanet i 3 mm och sätt tillbaka nålen med 0,5 mm7.
- Öppna mikrosprutan och injicera med en hastighet av 1 μl/min.
- Håll kvar nålen i 10 minuter efter injektionen.
- Dra långsamt upp mikrosprutan och tryck på injektionsstället med en steril torr bomullstuss.
- Suturera hårbotten med en icke-absorberbar kirurgisk sutur (10-0, se materialtabell) och desinficera snittet igen.
- Övervaka djurets hälsa och håll det under varma förhållanden.
- Flytta musen tillbaka till höljets bur när musen vaknar.
- Avbilda musen med ett in vivo bioluminescerande bildsystem (se materialförteckning) för att detektera den transplanterade tumören den 10: e dagen efter tumörbärande.
OBS: Luciferas laddat i GBM-cellerna, GL261, användes för den bioluminescerande avbildningen.- Bedöva musen med 1,5% isofluran med en syreflödeshastighet på 0,6L/min. Efter att ha bekräftat anestesidjupet via brist på pedalreflex, injicera musen intraperitonealt med kaliumfluorescein (10 mg / ml, se materialtabell) och 11 s senare, utför in vivo bioluminescerande avbildning. När fluorescensvärdet når ~ 5 × 105 är proceduren framgångsrik.
OBS: Bedöva djuret före avbildning. Behåll anestesi via noskon som levereras med förångad isofluran.
- Bedöva musen med 1,5% isofluran med en syreflödeshastighet på 0,6L/min. Efter att ha bekräftat anestesidjupet via brist på pedalreflex, injicera musen intraperitonealt med kaliumfluorescein (10 mg / ml, se materialtabell) och 11 s senare, utför in vivo bioluminescerande avbildning. När fluorescensvärdet når ~ 5 × 105 är proceduren framgångsrik.
- Välj mössen med framgångsrik tumörbärande för att konstruera GBM-återfallsmodellen efter resektion.
3. Konstruktion av GBM-återfallsmodellen efter resektion
- När tumörstorleken i de ortotopiska intrakraniella GBM-modellmössen blir ~ 6,5 × 105, välj mössen för den postoperativa återfallsmodellen.
- Väg upp de ortotopiska intrakraniella GBM-mössen och bedöva mössen med en intraperitoneal injektion av 50 mg/kg pentobarbitalnatrium. Administrera meloxikam (5 mg/kg; i.p.) för perioperativ analgesi.
- Upprepa processen med steg 1.2-1.5.
- Separera hårbottenvävnaden och skallen och kontrollera borrhålet som används för att bygga den ortotopiska intrakraniella GBM-modellen. Om hålet har läkt, identifiera hålet med stereotaktisk apparatur och följ proceduren som nämns i steg 2.1-2.3.
- Expandera håldiametern till 5 mm med en skalleborr och ta bort den utsöndrade cerebrospinalvätskan med en steril bomullspinne.
- Fokusera mikroskopet på mushuvudet och justera inställningarna för att säkerställa att borrhålet ligger i mitten av synfältet.
- Skär hjärnhinnorna med mikrosax och ta bort en del av tumörvävnaden med en mikrocurett och en mikroskalpell under mikroskopet.
OBS: När det gäller hjärnhinnorna, när skallen öppnas, är det tunna membranet nära hjärnvävnaden hjärnhinnorna. - Stoppa blödningen med steril gasbindning och tvätta snittet med steril fysiologisk saltlösning.
- Injicera den kommersiellt tillgängliga hydrogelen (10 μl, se materialtabell) i resektionshålan med en 1 ml spruta, sutur hårbotten med en icke-absorberbar kirurgisk sutur (10-0) och desinficera snittet igen (figur 1).
- Övervaka djurets hälsa och håll musen varm.
- Flytta musen tillbaka till höljets bur när musen vaknar.
- Utför in vivo bioluminescerande avbildning för att detektera den transplanterade tumören 1 dag senare för att kvantifiera storleken på den kvarvarande tumören (figur 2 och figur 3).
- Väg mössen varannan dag tills det slutliga effektmåttet.
OBS: För den aktuella studien var det terminala effektmåttet dag 30 och mössen avlivades genom en överdos av pentobarbitalnatrium med en intraperitoneal injektion.
Representative Results
Processen för konstruktion av GBM-återfallsmodellen efter resektion visas i figur 1. Resektionshålan efter att tumören delvis avlägsnades under mikroskopin visas. Hydrogelen injicerades i resektionshålan med en spruta för att visa den terapeutiska effekten. Schemat för den experimentella designen visas i figur 2A. Efter att GBM-cellerna implanterades i hjärnan hos mössen testades tumörtillväxten genom in vivo bioluminescerande avbildning på dag 10. Resektionen utfördes på dag 11, och hydrogelen injicerades sedan i resektionshålan. Den bioluminescerande avbildningstestningen in vivo utfördes på dag 15, dag 20, dag 25 och dag 30 för att övervaka kvarvarande tumörtillväxt. Som visas i figur 2B,C var storleken på tumörerna i GBM-återfallsmodellen efter resektion signifikant mindre än i den ortotopiska intrakraniella GBM-modellen, vilket framgår av in vivo bioluminescerande avbildningstestning. På dag 25 återkom tumörerna signifikant efter resektion (figur 2D). H&E-färgningen bekräftade att GBM-återfallsmodellen efter resektion konstruerades framgångsrikt och att kvarvarande tumörer signifikant återkom efter resektion (figur 3A, B).
Figur 1: Intraoperativ bild av tumörresektion och injektion av hydrogelen. En del av tumörvävnaden avlägsnades med en mikrocurett och mikroskalpell under mikroskopet och hydrogel injicerades i resektionshålan. Skalstänger: 50 μm. Denna siffra har modifierats från Sun et al.10. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Schema för experimentell design och in vivo bioluminescerande avbildning av möss i den intrakraniella och postresektionella GBM-modellen. (A) Schemat för försöksdesignen som visar att resektion utfördes på dag 11 och att in vivo bioluminescerande avbildning (IV) utfördes dag 10, dag 15, dag 20, dag 25 och dag 30. (B) De intrakraniella GBM-modellmössen visade en stor tumörstorlek på dag 10, (C) tumörstorleken minskade signifikant efter resektion på dag 11 och (D) tumörstorleken ökade efter resektion på dag 25 i GBM-modellen efter resektion. Kontrollgruppen inkluderade GBM-återfall efter resektionsmodellmöss utan behandling. Totalt användes 42 möss i denna studie. Skalstänger: 100 μm. Denna siffra har modifierats från Sun et al.10. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: H&E-färgningsbild av hjärnvävnad från GBM-modellen efter resektion. (A) En H&E-färgningsbild som visar resektionshålan, kvarvarande tumör och normal hjärnvävnad. Hjärnvävnaden samlades 1 dag efter resektionen. (B) En H&E-färgningsbild som visar den återkommande tumören och den normala hjärnvävnaden. Hjärnvävnaden samlades på dag 12 efter resektionen. Skalstänger: 100 μm. Denna siffra har modifierats från Sun et al.10. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Kirurgi är fortfarande förstahandsvalet för de flesta GBM-patienter11. På grund av karaktäristiken för invasiv tillväxt av GBM kvarstår fortfarande ett litet antal tumörceller efter mikroneurokirurgiska tekniker, vilket resulterar i eventuell tumöråterfall12. Hur man hämmar återfall av GBM efter operation har blivit fokus för GBM-relaterad forskning. På grund av hjärnvävnadens komplexa anatomiska struktur har konstruktionen av en lämplig postoperativ GBM-modell blivit det primära problemet som ska lösas inom detta område.
Denna studie utvecklade en GBM-återfallsmodell efter resektion. I processen att konstruera denna modell är konstruktionen av den ortotopiska intrakraniella GBM-modellen kritisk. Efter att denna modell har utvecklats framgångsrikt måste resektionen utföras vid rätt tidpunkt. Den rekommenderade tiden är när fluorescensvärdet för tumörstorleken är ca 6,5 × 105. För att minska dödligheten hos mössen utfördes resektion under anestesi med 40 mg/kg 1% pentobarbitalnatrium genom intraperitoneal injektion. Resektionen var dock svår att utföra, och mössen rörde sig ofta på grund av den lilla dosen av bedövningsmedlet. På grundval av detta ökades dosen av bedövningsmedlet till 50 mg/kg. Efter att ha ökat anestesidosen försvann mössens intraoperativa svar och resektionen utfördes framgångsrikt. Isoflurangas kan också användas i detta protokoll.
I denna studie användes GL261-Luci-celler för att utveckla modellen; därför måste fler GBM-cellinjer användas för att validera protokollet i framtiden. För att göra protokollet mer övertygande måste olika GBM-musmodeller, såsom genetiskt modifierade GBM-musmodeller, användas. Dessutom kan MR vara det bästa sättet att upptäcka återkommande tumörer efter operationen.
Sammanfattningsvis har i detta arbete en GBM-återfallsmodell efter resektion utvecklats. I denna modell övervakas tumöråterfall genom att bedöma den kvarvarande tumörens tillväxt efter resektion. Även om denna modell inte kan anses helt efterlikna tumöråterfall, liknar resektionsstilen i denna modell standarden för maximalt säker kirurgi vid klinisk behandling av GBM-patienter. Detta arbete ger en bekväm och genomförbar metod för att konstruera GBM-återfallsmodellen efter resektion och representerar ett framsteg inom forskningen om GBM-återfall efter resektion.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av projektbidrag från The National Natural Science Foundation of China (82071767 och 82171781).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gentian violet | Sigma | C6158 | |
| GL261-Luci | Shanghai Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co.,Ltd. | ZQ0932 | |
| In vivo bioluminescent imaging system | Tanon | Tanon ABL X6 | |
| Laboratory animal shaver | Beyotime Biotechnology | FS600 | |
| Mice | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | ||
| Micro curette | Belevor Medical Co.,Ltd. | ||
| Micro scalpel | Belevor Medical Co.,Ltd. | ||
| Microscope | Shanghai Xiangfan Instrument Co., Ltd | JSZ5A/B | |
| Microsyringe | Hamilton | 87943 | |
| Mini cranial drill | RWD | 78001 | |
| Nonabsorbable surgical suture | Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd. | ||
| Pentobarbital sodium | ChemSrc | 57-33-0 | |
| PVA-TSPBA hydrogel | Aladdin | 9002-89-5 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD | 68043 |
References
- Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C., Weller, M. Current state of immunotherapy for glioblastoma. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (7), 422-442 (2018).
- Wang, X., et al. In situ targeting nanoparticles-hydrogel hybrid system for combined chemo-immunotherapy of glioma. Journal of Controlled Release. 345, 786-797 (2022).
- Binder, Z. A., O'Rourke, D. M. Glioblastoma: The current state of biology and therapeutic strategies. Cancer Research. 82 (5), 769-772 (2022).
- Kauer, T. M., Figueiredo, J. L., Hingtgen, S., Shah, K. Encapsulated therapeutic stem cells implanted in the tumor resection cavity induce cell death in gliomas. Nature Neuroscience. 15 (2), 197-204 (2011).
- Jiang, X., et al. Nanoparticle engineered TRAIL-overexpressing adipose-derived stem cells target and eradicate glioblastoma via intracranial delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (48), 13857-13862 (2016).
- Quail, D. F., Joyce, J. A.
- Zhang, J., et al. Immunostimulant hydrogel for the inhibition of malignant glioma relapse post-resection. Nature Nanotechnology. 16 (5), 538-548 (2021).
- Ruan, H., et al. A dual-bioresponsive drug-delivery depot for combination of epigenetic modulation and immune checkpoint blockade. Advanced Materials. 31 (17), 1806957 (2019).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Sun, S., et al. Immunostimulant in situ hydrogel improves synergetic radioimmunotherapy of malignant glioblastoma relapse post-resection. Advanced Functional Materials. 32 (43), 2205038 (2022).
- Liu, D. K., Sulman, E. P., Wen, P. Y., Kurz, S. C.
- Mellinghoff, I. K., Cloughesy, T. F. Balancing risk and efficiency in drug development for rare and challenging tumors: A new paradigm for glioma. Journal of Clinical Oncology. 40 (30), 3510-3519 (2022).
