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Cancer Research

इमेजिंग प्रोग्राम्ड डेथ-लिगैंड 1 अभिव्यक्ति के लिए 68गैलियम-लेबल डी-पेप्टाइड पीईटी ट्रेसर का विकास

Published: February 3, 2023 doi: 10.3791/65047
Automatic Translation
*1, *2, 1, 2, 2, 4, *2,3, *3, *1, *2
1Department of Nuclear Medicine, Nanjing First Hospital, Nanjing Medical University, 2State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 3Department of Advanced Nuclear Medicine Sciences, Institute for Quantum Medical Science, National Institutes for Quantum Science and Technology, 4Department of Pharmacy, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology
* These authors contributed equally

Summary

इस अध्ययन ने पूरे शरीर में क्रमादेशित डेथ-लिगैंड 1 के वितरण का मूल्यांकन करने के लिए एक गैर-आक्रामक और वास्तविक समय विधि विकसित की, जो [68जीए] डी-डोडेकेपेप्टाइड विरोधी के पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफिक इमेजिंग पर आधारित है। इस तकनीक में पारंपरिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री पर फायदे हैं और उपयुक्त रोगियों की पहचान करने की दक्षता में सुधार होता है जो प्रतिरक्षा चौकी नाकाबंदी चिकित्सा से लाभान्वित होंगे।

Abstract

प्रोग्राम्ड सेल डेथ-प्रोटीन 1 (पीडी-1)/प्रोग्राम्ड डेथ-लिगैंड 1 (पीडी-एल 1) पर आधारित इम्यून चेकपॉइंट नाकाबंदी थेरेपी के विकास ने हाल के वर्षों में कैंसर उपचारों में क्रांति ला दी है। हालांकि, रोगियों का केवल एक अंश पीडी -1 / पीडी-एल 1 अवरोधकों का जवाब देता है, ट्यूमर कोशिकाओं में पीडी-एल 1 की विषम अभिव्यक्ति के कारण। यह विषमता आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) दृष्टिकोण द्वारा ट्यूमर कोशिकाओं का सटीक पता लगाने में एक चुनौती प्रस्तुत करती है। यह स्थिति रोगियों को स्तरीकृत करने के लिए बेहतर तरीकों की मांग करती है जो उपचार प्रभावकारिता में सुधार के लिए प्रतिरक्षा चौकी नाकाबंदी चिकित्सा से लाभान्वित होंगे। पॉज़िट्रॉन एमिशन टोमोग्राफी (पीईटी) पूरे शरीर के पीडी-एल 1 अभिव्यक्ति के वास्तविक समय के दृश्य को एक गैर-आक्रामक तरीके से सक्षम बनाता है। इसलिए, पीईटी इमेजिंग के माध्यम से ट्यूमर में पीडी-एल 1 वितरण का पता लगाने के लिए रेडियोलेबल ट्रेसर के विकास की आवश्यकता है।

उनके एल-समकक्षों की तुलना में, डेक्सट्रोटरी (डी) -पेप्टाइड्स में प्रोटियोलिटिक प्रतिरोध और उल्लेखनीय रूप से लंबे समय तक चयापचय आधे जीवन जैसे गुण होते हैं। इस अध्ययन ने ट्यूमर-असर चूहों में 68जीए-लेबल पीडी-एल 1-लक्षित डी-पेप्टाइड, डी-डोडेकैपेप्टाइड विरोधी (डीपीए) की पीईटी इमेजिंग के आधार पर पीडी-एल 1 अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए एक नई विधि तैयार की। परिणामों से पता चला कि [68जीए] डीपीए विशेष रूप से विवो में पीडी-एल 1-ओवरएक्सप्रेस ट्यूमर से बंध सकता है, और अनुकूल स्थिरता के साथ-साथ उत्कृष्ट इमेजिंग क्षमता भी दिखाता है, यह सुझाव देता है कि [68जीए] डीपीए-पीईटी ट्यूमर में पीडी-एल 1 स्थिति के आकलन के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है।

Introduction

प्रतिरक्षा चौकी प्रोटीन की खोज ट्यूमर थेरेपी में एक सफलता थी, और प्रतिरक्षा चौकी नाकाबंदी चिकित्सा1 के विकास में प्रमुख प्रगति हुई है। प्रोग्राम्ड सेल डेथ-प्रोटीन 1 (पीडी-1) और प्रोग्राम्ड डेथ-लिगैंड 1 (पीडी-एल 1) खाद्य और औषधि प्रशासन (एफडीए) द्वारा अनुमोदित कई एंटीबॉडी के साथ संभावित दवा लक्ष्य हैं। पीडी -1 ट्यूमर-घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं, जैसे सीडी 4 +, सीडी 8 + टी कोशिकाओं और नियामक टी कोशिकाओं द्वारा व्यक्त किया जाता है। पीडी-एल 1 पीडी -1 लिगेंड में से एक है, जो विभिन्न ट्यूमर कोशिकाओं 2,3 में अतिरंजित है। पीडी -1 और पीडी-एल 1 के बीच बातचीत पीडी -1 को निष्क्रिय करती है, इस प्रकार एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को दबा देती है4. इन निष्कर्षों से पता चलता है कि पीडी-एल 1 के निषेध प्रतिरक्षा कोशिकाओं की हत्या प्रभाव में सुधार कर सकते हैं और ट्यूमर कोशिकाओं को खत्म कर सकतेहैं 5. वर्तमान में, क्रोमोजेनिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) उन रोगियों की पहचान करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला दृष्टिकोण है जो प्रतिरक्षा चेकपॉइंट थेरेपी 6,7 का जवाब देने की सबसे अधिक संभावना रखते हैं। हालांकि, ट्यूमर कोशिकाओं में पीडी-एल 1 की विषम अभिव्यक्ति के कारण, बायोप्सी से आईएचसी परिणाम रोगियों8 में पीडी-एल 1 अभिव्यक्ति के बारे में सटीक जानकारी प्रदान नहीं कर सकते हैं। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि केवल 20% -40% रोगियों को प्रतिरक्षा चौकी नाकाबंदी चिकित्सा 1,9,10 से दीर्घकालिक लाभ प्राप्त होता है। इसलिए, इन प्रतिरक्षा चौकी प्रोटीन की विषम अभिव्यक्ति के कारण होने वाले झूठे-नकारात्मक परिणामों को दरकिनार करने के लिए एक नई विधि विकसित करने की तत्काल आवश्यकता है।

पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) जैसे आणविक इमेजिंग तकनीक, पूरे शरीर के वास्तविक समय के दृश्य को गैर-आक्रामक तरीके से सक्षम बनाती है, और इस प्रकार पारंपरिक आईएचसी विधि 11,12,13से बेहतर प्रदर्शन कर सकती है। रेडियोलेबल्ड एंटीबॉडी, पेप्टाइड्स और छोटे अणु कैंसर रोगियों में पीडी-एल 1 अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए ट्रेसर का वादा कर रहे हैं 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. एफडीए ने तीन पीडी-एल 1 चिकित्सीय मोनोक्लोनल एंटीबॉडी को मंजूरी दी है: एवेलुमाब, एटेज़ोलिज़ुमाब, और ड्यूरवालुमाब26। इन एंटीबॉडी पर आधारित इम्यूनो-पीईटी ट्रेसर को अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है 27,28,29,30,31,32. प्रारंभिक चरण नैदानिक परीक्षणों नैदानिक आवेदन के लिए सीमित मूल्य का पता चला है, क्योंकि प्रतिकूल pharmacokinetics30. एंटीबॉडी के साथ तुलना में, पेप्टाइड्स स्वस्थ अंगों से तेजी से रक्त और अंग निकासी का प्रदर्शन, और आसानी से रासायनिक33 संशोधित किया जा सकता है. पीडी-एल 1 के लिए उच्च संबंध वाले कई पेप्टाइड्स 2 की सूचना दी गईहै; WL12 एक रिपोर्ट किया गया पेप्टाइड है जो PD-L134 के लिए विशिष्ट बंधन दिखाता है। रेडियोलेबल ट्रेसर, [64Cu] WL12, [68Ga] WL12, और [18F] FPyWL12, को विवो विशिष्ट ट्यूमर-लक्ष्यीकरण क्षमता में उच्च दिखाने की सूचना दी गई है, जो ट्यूमर 26,35,36,37 में PD-L1 अभिव्यक्ति की उच्च गुणवत्ता वाली छवियों की फसल की अनुमति देता है। इसके अलावा, रेडियोलेबल वाले WL12 के पहले इन-ह्यूमन मूल्यांकन ने प्रदर्शित किया है कि [68Ga] WL12 (NOTA द्वारा chelated) में नैदानिक ट्यूमर इमेजिंग38 के लिए एक सुरक्षित और कुशल क्षमता है। इसकी उच्च हाइड्रोफोबिसिटी और स्वस्थ यकृत में उच्च उठाव के कारण, WL12 का नैदानिक उपयोग सीमित है। अन्य रेडियोलेबलिंग पेप्टाइड्स, जैसे TPP1 और SETSKSF, जो विशेष रूप से PD-L1 से बंधते हैं, ने भी पूरे शरीर PD-L1 अभिव्यक्ति39,40 की कल्पना करने के लिए संभावित स्थिरता और विशिष्टता दिखाई है। हालांकि, असंशोधित पेप्टाइड्स आसानी से प्रोटीज द्वारा अपमानित होते हैं, और गुर्दे द्वारा तेजी से चयापचय होते हैं। डेक्सट्रोटरी (डी) -पेप्टाइड्स को व्यापक रूप से प्रभावी मध्यस्थों के रूप में उपयोग किया गया है, बाएं हाथ (एल) -पेप्टाइड्स 41,42,43 की खराब स्थिरता के कारण। डी-पेप्टाइड्स प्रोटियोलिटिक गिरावट के लिए हाइपर-प्रतिरोधी हैं और उल्लेखनीय रूप से लंबे समय तक चयापचय आधे जीवन हैं। उनके एल-समकक्षों की तुलना में, डी-पेप्टाइड्स ज्यादातर विशिष्ट बाध्यकारी क्षमताओंको 44,45,46 दिखाते हैं।

इस अध्ययन ने पीडी-एल 1 अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए एक नई विधि तैयार की, जो 68जीए-लेबल पीडी-एल 1-लक्षित डी-पेप्टाइड, डी-डोडेकैपेप्टाइड विरोधी (डीपीए) की पीईटी इमेजिंग पर आधारित है, एक ट्यूमर-असर माउस मॉडल47 में। [68जीए] डीपीए की स्थिरता का अध्ययन पहली बार फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) और माउस सीरम में किया गया था, जिसके बाद पीडी-एल 1-ओवरएक्सप्रेस ट्यूमर में [68जीए] डीपीए की बाध्यकारी आत्मीयता का परीक्षण किया गया था। इसके बाद, पीईटी इमेजिंग ग्लियोब्लास्टोमा ज़ेनोग्राफ्ट मॉडल में किया गया था ताकि यह पुष्टि की जा सके कि ट्यूमर मेंपीडी-एल 1 अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए डीपीए एक आदर्श पीईटी ट्रेसर था या नहीं। पीईटी इमेजिंग और डीपीए का संयोजन न केवल पीडी-एल 1 की विषम अभिव्यक्ति से जुड़ी चुनौतियों को दूर करने के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करता है, बल्कि डी-पेप्टाइड-आधारित रेडियोट्रेसर के विकास के लिए आधार भी देता है।

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Protocol

पशु प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं नानजिंग मेडिकल यूनिवर्सिटी या क्वांटम विज्ञान और प्रौद्योगिकी के राष्ट्रीय संस्थानों की पशु आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया. प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए समिति के संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुपालन में चूहों के प्रयोगों को सख्ती से किया गया था।

1. पेप्टाइड संश्लेषण

  1. हल्के एन2 बुदबुदाहट के तहत 30 मिनट के लिए एन-मिथाइल-2-पाइरोलिडोन (एनएमपी) के 1 एमएल में 100 मिलीग्राम 4-मिथाइलबेनज़हाइड्रायलामाइन (एमबीएचए) राल (0.37 मिमीलो / जी की लोडिंग क्षमता) प्रफुल्लित करें।
  2. एनएमपी के 1 एमएल में एफएमओसी-संरक्षित अमीनो एसिड (5.0 इक्विव), एचसीटीयू (4.9 इक्विव), और डीआईपीईए (10.0 इक्विव) से मिलकर एक ताजा स्टॉक बफर तैयार करें, और राल (100 मिलीग्राम) में जोड़ें। युग्मन प्रतिक्रिया को 1.5-2 घंटे के लिए आगे बढ़ने दें।
  3. एनएमपी में 50% (वॉल्यूम/वॉल्यूम) मॉर्फोलिन से युक्त डिप्रोटेक्शन बफर तैयार करें। अमाइन समूह पर Fmoc समूह को हटाने के लिए प्रत्येक धोने में deprotection बफर के 1 एमएल के साथ राल (100 मिलीग्राम) 2 x 30 मिनट धोएं। 1 मिनट के लिए डाइक्लोरोमेथेन (डीसीएम; 1 एमएल) के साथ राल धो लें, डीसीएम को हटा दें, और एक और 1 मिनट के लिए एनएमपी (1 एमएल) के साथ राल को फिर से धोएं। अगला, एनएमपी को हटा दें और 1 मिनट के लिए डीसीएम के साथ राल को फिर से धोएं।
    नोट: सभी धुलाई प्रक्रियाओं हल्के एन2 बुदबुदाहट के तहत आयोजित कर रहे हैं. उपरोक्त प्रक्रियाओं को अंतिम अमीनो एसिड तक दोहराया जाता है।
  4. पेप्टाइड में 1,4,7,10-टेट्राज़ासाइक्लोडोडेकेन-1,4,7,10-टेट्राएसेटिक एसिड (डीओटीए) जोड़ने के लिए, एन- (3-डाइमिथाइलैमिनोप्रोपाइल) -एन-एथिलकार्बोडाइमाइड हाइड्रोक्लोराइड (ईडीसी ·) के साथ डीओटीए को पूर्व-सक्रिय करें एचसीएल) और एन-हाइड्रॉक्सीसुकिनिमाइड (एनएचएस)। DOTA/EDC के स्टॉक बफर को इनक्यूबेट करें · 3 घंटे के लिए डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ) में 1:1:1 के दाढ़ अनुपात में एचसीएल/एनएचएस, 1 मीटर की अंतिम डीओटीए एकाग्रता के साथ। अगला, राल (100 मिलीग्राम) के लिए स्टॉक बफर (1 एमएल) जोड़ें, और कोमल एन2 बुदबुदाहट के साथ 2 घंटे के लिए आगे बढ़ने के लिए प्रतिक्रिया की अनुमति दें.
    नोट: 1,4,7-triazacyclonane-1,4,7-triacetic एसिड (NOTA) का उपयोग 68Ga जटिलता के लिए एक chelator के रूप में भी किया जा सकता है। नोटा युग्मन के लिए समान प्रक्रियाओं का उपयोग किया जा सकता है।
  5. डीसीएम का उपयोग करके ऊपर से राल को अच्छी तरह से कुल्ला और एक साथ अवशिष्ट प्रतिक्रिया समाधान को हटाने के लिए एक वैक्यूम लागू करें। DCM (1.5 mL) का उपयोग करके राल 3x को कुल्ला, और फिर राल को सिकोड़ने के लिए MeOH (1.5 mL) से कुल्ला करें। राल को रात भर नाइट्रोजन के नीचे, या कम से कम 4 घंटे के लिए उच्च वैक्यूम के नीचे रखें, जब तक कि राल सूख न जाए।
  6. सूखे डीपीए पेप्टाइड युक्त राल को 2 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन कंटेनर में स्क्रू कैप के साथ रखें। उपयुक्त दरार कॉकटेल (95/2.5/2.5 TFA/TIS/H2O मात्रा में; 1 mL/100 mg राल) जोड़ें और स्क्रू कैप का उपयोग करके कंटेनर को कसकर सील करें। धीरे 2 घंटे के लिए 20-25 डिग्री सेल्सियस पर एक धूआं हुड में एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर प्रतिक्रिया आंदोलन.
    चेतावनी: इसकी अत्यधिक संक्षारक प्रकृति के कारण, सुरक्षात्मक कपड़े पहने हुए एक धूआं हुड में ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड (टीएफए) तैयार करें।
  7. धूआं हुड में नाइट्रोजन के तहत वाष्पीकरण द्वारा अधिकांश TFA को हटा दें। डायथाइल ईथर (~ 1.5 एमएल / 100 मिलीग्राम राल) जोड़कर पेप्टाइड्स को अवक्षेपित करें।
  8. भंवर कमरे के तापमान (10,000 × ग्राम, 5 मिनट) पर पेप्टाइड्स और अपकेंद्रित्र triturate करने के लिए मिश्रण. कंटेनर से विलायक को सावधानी से डालें। 1.7-1.8 कदम दोहराएँ.
  9. 10 मिनट के लिए खुले कंटेनर में अवशेषों को हवा में सुखाएं। उत्पादों को भंग करने के लिए 50% (वॉल्यूम/वॉल्यूम) जलीय एसीटोनिट्राइल, और भंवर को 1-2 एस के लिए जोड़ें (1 एमएल/100 मिलीग्राम राल)।
  10. मिश्रण को छानकर राल निकालें, और फिर 50% (वॉल्यूम/वॉल्यूम) जलीय एसीटोनिट्राइल के 0.2 एमएल का उपयोग करके राल 2x धो लें। उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) शुद्धि के लिए छानना मिलाएं। निम्नलिखित एचपीएलसी शर्तों का प्रयोग करें। कॉलम: वाईएमसी-ट्रायट-सी 18 (4.6 मिमी आंतरिक व्यास [आईडी], 150 मिमी, 5 मिमी); विलायक ढाल: विलायक ए-विआयनीकृत पानी; विलायक बी-एसीटोनिट्राइल (0.1% टीएफए); प्रवाह समय: 20 मिनट, एसीटोनिट्राइल के साथ 10% से 90% तक; प्रवाह दर: 1 एमएल/मिनट।
  11. एकत्रित एचपीएलसी एलुएंट्स को रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें और लियोफिलिज़ (-50 डिग्री सेल्सियस और <1 पा) करें। रेडियोलेबलिंग के लिए, स्टॉक बफर के रूप में 1 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम एकाग्रता पर सोडियम एसीटेट बफर (100 मिमी, पीएच 5.0) में ठोस पेप्टाइड को भंग करें।

2. 68गा रेडियोलेबलिंग

नोट 68Ga को 68Ge/68Ga जनरेटर का उपयोग करके नानजिंग फर्स्ट हॉस्पिटल (नानजिंग, चीन) में इन-हाउस उत्पन्न किया गया था।

  1. एक पेंच टोपी के साथ 1.5 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन कंटेनर में स्टॉक बफर के पिपेट 5 माइक्रोन। कंटेनर में 200 MBq [68Ga]GaCl3 (400 μL) जोड़ें।
  2. भंवर 5 एस के लिए मिश्रण को भंवर करें। पीएच परीक्षण स्ट्रिप्स का उपयोग करके पीएच को मापें। NaOH (0.1 M) के साथ pH को 4-4.5 पर समायोजित करें।
    नोट: 68Ga और DOTA के बीच जटिलता के लिए एक उपयुक्त pH महत्वपूर्ण है।
  3. 5-10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर समाधान सेते हैं. निम्नलिखित शर्तों के तहत रेडियोलेबलिंग उपज विश्लेषण के लिए रेडियो-एचपीएलसी के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण का विषय: कॉलम: वाईएमसी-ट्रायट-सी 18 (4.6 मिमी आईडी, 150 मिमी, 5 मिमी); विलायक ढाल: विलायक ए-विआयनीकृत पानी; विलायक बी-एसीटोनिट्राइल (0.1% टीएफए); प्रवाह समय: 20 मिनट, एसीटोनिट्राइल के साथ 10% से 90% तक; प्रवाह दर: 1 एमएल/मिनट।
    नोट: रेडियो पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) रेडियोलेबलिंग उपज की जांच के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। सुझाए गए टीएलसी क्षालन बफर 0.1 एम ना3सी6एच5ओ7, पीएच 4 है।

3. ट्रेसर स्थिरता परीक्षण

  1. पीबीएस में ट्रेसर स्थिरता परीक्षण
    1. पीबीएस (990 माइक्रोन) में [68जीए] डीपीए (10 माइक्रोन, 3.7 एमबीक्यू, एनएओएसी में) जोड़ें। मामूली आंदोलन के साथ 1, 2, और 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. प्रत्येक समय बिंदु पर समाधान के 200 माइक्रोन लीजिए। विश्लेषण के लिए रेडियो-एचपीएलसी में इसे इंजेक्ट करें।
  2. माउस सीरम में ट्रेसर स्थिरता
    1. माउस सीरम (90 μL, हौसले से तैयार) में [68Ga] DPA (10 μL, ~ 3.7 MBq, NaOAc में) जोड़ें। मामूली आंदोलन के साथ 1, 2, और 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. प्रत्येक समय बिंदु पर समाधान के 20 माइक्रोन लीजिए। MeCN और पानी जोड़ें (100 μL, 1:1, v/v)।
    3. 10 मिनट (5,000 × ग्राम, 25 डिग्री सेल्सियस) के लिए मिश्रण अपकेंद्रित्र। रेडियो HPLC का उपयोग सतह पर तैरनेवाला का विश्लेषण.

4. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा पीडी-एल 1 अभिव्यक्ति का विश्लेषण

  1. आरपीएमआई-1640 माध्यम को 10% (वॉल्यूम/वॉल्यूम) भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (वॉल्यूम/वॉल्यूम) के साथ पूरक करके कल्चर माध्यम तैयार करें। संस्कृति माध्यम में U87MG कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और 105 कोशिकाओं/अच्छी तरह से घनत्व पर 12-अच्छी प्लेटों में बीज। कोशिकाओं को एक इनक्यूबेटर (5% सीओ2, 37 डिग्री सेल्सियस) में रखें, और बिना परेशान किए कम से कम 24 घंटे के लिए संस्कृति।
  2. पीबीएस के 0.5 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लें और ट्रिप्सिन-ईडीटीए (0.25%) के 250 माइक्रोन जोड़ें। कोशिकाओं को 2 मिनट के लिए इनक्यूबेटर (5% सीओ2, 37 डिग्री सेल्सियस) में वापस रखें।
  3. सेल पृथक्करण को रोकने के लिए संस्कृति माध्यम के 1 एमएल जोड़ें. कोशिकाओं के लिए मध्यम जोड़ें ऊपर और नीचे pipetting द्वारा व्यंजन से उन्हें अलग करने के लिए और उन्हें 1.5 एमएल ट्यूबों में इकट्ठा. 5 मिनट (100 × ग्राम) के लिए कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र.
  4. सतह पर तैरनेवाला निकालें और पीबीएस के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। 5 मिनट (100 × ग्राम) के लिए कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र. इस चरण को एक बार और दोहराएं।
  5. फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (FITC)-संयुग्मित PD-L1 एंटीबॉडी को 3% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (BSA) के साथ 20 nmol / L तक पतला करें। कोशिकाओं में जोड़ें और 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  6. 5 मिनट (100 × ग्राम) के लिए कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें, इसके बाद दो बार ठंडे पीबीएस से धोएं। फ्लो साइटोमीटर और विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पीडी-एल 1-पॉजिटिव कोशिकाओं का विश्लेषण करें।

5. इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री

  1. बीज U87MG ग्लास नीचे सेल संस्कृति व्यंजन (35 मिमी) में अच्छी तरह से प्रति 2.5 × 105 कोशिकाओं के घनत्व पर. जब 60% संगम तक पहुँच जाता है, संस्कृति माध्यम महाप्राण और पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें. धीरे से कई बार हिलाएं और महाप्राण करें। धुलाई चरण 3x करें।
  2. व्यंजन में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 500 माइक्रोन जोड़ें। कमरे के तापमान पर कोशिकाओं रखें और 30 मिनट के लिए तय.
  3. पीबीएस के साथ कोशिकाओं 3x धो लें. 3% बीएसए (डब्ल्यूटी/वॉल्यूम, पीबीएस में) के 1 एमएल जोड़ें और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए निश्चित कोशिकाओं को ब्लॉक करें।
  4. 3% बीएसए निकालें और सीधे प्राथमिक एंटी-पीडी-एल 1 एंटीबॉडी (एमएबी, 1: 100, 3% बीएसए में पतला) के साथ कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात इनक्यूबेट करें।
    नोट: बीएसए के साथ कोशिकाओं को अवरुद्ध करने के बाद, पीबीएस के साथ धोएं नहीं।
  5. कोशिकाओं को 3% बीएसए बफर के साथ 3x धोएं। FITC संयुग्मित विरोधी मानव IgG एफसी माध्यमिक एंटीबॉडी (1:500, पीबीएस में पतला) 1 घंटे के लिए के साथ कोशिकाओं को सेते हैं.
  6. पीबीएस के साथ कोशिकाओं 3x धो लें. कोशिकाओं में 0.5 एमएल डीएपीआई (1 माइक्रोग्राम/एमएल) जोड़ें और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। पीबीएस के साथ सना हुआ कोशिकाओं 3x धो लें, और फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर निरीक्षण करें।

6. सेलुलर तेज और निषेध प्रयोग

  1. सेलुलर तेज प्रयोग
    1. संस्कृति U87MG कोशिकाओं को 12-अच्छी प्लेटों में 80% संगम तक पहुंचने तक। माध्यम निकालें और पीबीएस के 0.5 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    2. [68Ga]DPA लाई 74 KBq/mL को एकाग्रतामा ताजा माध्यम मा पतला गर्नुहोस्। प्रत्येक अच्छी तरह से पतला [68Ga] DPA बफर के 0.5 एमएल जोड़ें।
    3. विभिन्न अवधि (10, 30, 40, और 120 मिनट) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर [68जीए] डीपीए के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। एक विंदुक का उपयोग कर माध्यम महाप्राण. पीबीएस (0.5 एमएल) के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं।
    4. कोशिकाओं lyse करने के लिए NaOH समाधान (0.5 एम, 300 माइक्रोन प्रति अच्छी तरह से) जोड़ें. 30 एस के बाद, 1.5 एमएल ट्यूबों में चिपचिपा सेल lysates इकट्ठा.
    5. प्लेट को पीबीएस के 0.4 एमएल के साथ दो बार धोएं। उपरोक्त 1.5 एमएल ट्यूब में धोने के समाधान को इकट्ठा करें।
    6. स्वचालित गामा काउंटर के अंतर्निहित कंप्यूटर को प्रारंभ करें; ट्यूबों को बिल्ट-इन शेल्फ में रखें। कन्वेयर पर सभी नमूनों को लोड करने के बाद, स्टार्ट बटन दबाएं। परिणामों की गणना आंतरिक सॉफ्टवेयर में की जाती है। रीड-आउट प्रत्येक ट्यूब के प्रति मिनट (सीपीएम) क्षय-सहसंबद्ध गणना रिकॉर्ड करता है।
  2. प्रतिस्पर्धी बाध्यकारी परख
    1. संस्कृति U87MG कोशिकाओं को 12-अच्छी प्लेटों में 80% संगम तक पहुंचने तक। माध्यम निकालें और पीबीएस के 0.5 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    2. [68Ga]DPA को ताजा माध्यम में 74 KBq/mL की सांद्रता में पतला करें। 10% DMSO में BMS202 यौगिकों की उचित मात्रा को भंग करने के लिए 10 मिमी एकाग्रता (400 μL) प्राप्त करें।
    3. 100 माइक्रोन की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पीबीएस के 396 माइक्रोन में 10 एमएम बीएमएस202 के 4 माइक्रोन को पतला करें। BMS202 (1 माइक्रोन, 10 एनएम, 100 पीएम, और 1 पीएम) की विभिन्न सांद्रता प्राप्त करने के लिए इस चरण को दोहराएं।
    4. प्रत्येक कुएं में पतला [68जीए] डीपीए बफर के 0.5 एमएल जोड़ें (अच्छी तरह से 0.37 एमबीक्यू)। प्रत्येक अच्छी तरह से BMS202 समाधान के 5 माइक्रोन जोड़ें (प्रत्येक एकाग्रता के लिए तीन कुओं). 120 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते हैं।
    5. एक विंदुक का उपयोग कर माध्यम महाप्राण. पीबीएस के 3 x 0.5 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    6. कोशिकाओं को लाइज़ करने के लिए NaOH समाधान (0.5 M, 300 μL प्रति कुआं) जोड़ें। 30 एस के बाद, चिपचिपा सेल lysates 1.5 एमएल ट्यूबों में इकट्ठा. पीबीएस के 2 x 0.4 एमएल के साथ प्लेट धो लें।
    7. उपरोक्त 1.5 एमएल ट्यूब में धोने के समाधान को इकट्ठा करें। ट्यूबों को स्वचालित गामा काउंटर के अंतर्निर्मित शेल्फ में रखें।
    8. चरण 6.1.6 के रूप में एक ही प्रक्रियाओं का पालन करें।

7. पीईटी इमेजिंग

नोट: 10 सेमी के देखने के क्षैतिज क्षेत्र और 12.7 सेमी के अक्षीय क्षेत्र के साथ 0.796 मिमी अलग (केंद्र-से-केंद्र) 159 अनुप्रस्थ अक्षीय वर्गों को प्रदान करने वाले माइक्रो पीईटी स्कैनर का उपयोग करके छोटे जानवर पीईटी इमेजिंग करें। सूची मोड में एकत्र किए गए सभी डेटा को त्रि-आयामी सिनोग्राम में व्यवस्थित किया जाता है। फूरियर को फिर दो-आयामी सिनोग्राम (फ्रेम × मिनट: 4 × 1, 8 × 2, 8 × 5) में फिर से इकट्ठा किया जाता है।

  1. इस अध्ययन में पुरुष, 5-8 सप्ताह के बीएएलबी / सी नग्न चूहों का प्रयोग करें। चरण 4.1-4.4 के बाद U87MG कोशिकाओं को इकट्ठा करें और कोशिकाओं को 0.5 एमएल सिरिंज में महाप्राण करें। चमड़े के नीचे चूहों में कोशिकाओं को इंजेक्ट करें (1 × 106 कोशिकाएं प्रति ट्यूमर, प्रति माउस दो ट्यूमर)। इंजेक्शन के बाद ट्यूमर के विकास की निगरानी करें जब तक कि ट्यूमर की मात्रा 100-300 मिमी3 न हो।
  2. 1% -2% (वी / वी) आइसोफ्लुरेन (1 एमएल / मिनट) का उपयोग करके चूहों को एनेस्थेटाइज करें। हीटिंग डिवाइस चालू करें और पीईटी के पशु बिस्तर को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  3. पीईटी मशीन के पशु बिस्तर पर सही स्थिति में संवेदनाहारी चूहों रखो. सूखापन को रोकने के लिए दोनों आंखों पर नेत्र मरहम लगाएं।
    चेतावनी: स्कैनिंग के दौरान मौत से बचने के लिए प्रवण स्थिति में चूहों रखें. पूरी इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान, एक पूर्वस्थापित ट्यूब का उपयोग कर नाक के माध्यम से isoflurane प्रवाह (1.0 एमएल / मिनट) प्रशासन.
  4. नियंत्रण कक्ष के माध्यम से पशु बिस्तर की स्थिति को समायोजित करें। ट्रेसर (10-17 MBq/100-200 μL) को एक पूर्वस्थापित पूंछ शिरा कैथेटर के माध्यम से अंतःशिरा रूप से इंजेक्ट करें।
  5. संदर्भित सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके होस्ट कंप्यूटर में स्कैनिंग वर्कफ़्लो बनाएं ( सामग्री की तालिकादेखें) एक अध्ययन फ़ोल्डर बनाएं और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार अधिग्रहण प्रोटोकॉल सेट करें। 3 डी सूची मोड में सभी चूहों पर गतिशील स्कैन (प्रत्येक माउस के लिए 60 मिनट) प्रदर्शन करें।
  6. निर्माता प्रोटोकॉल के बाद एक हिस्टोग्राम प्रोटोकॉल और एक पुनर्निर्माण प्रोटोकॉल को परिभाषित करें। फ़िल्टर किए गए बैक-प्रोजेक्शन के माध्यम से पीईटी गतिशील छवियों (25-30 मिनट और 55-60 मिनट) के पुनर्निर्माण के लिए 0.5 चक्र / पिक्सेल के Nyquist कटऑफ के साथ हैनिंग के फ़िल्टर का उपयोग करें। सभी चूहों के लिए अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (एमआईपी) छवियों उत्पन्न.
  7. प्रोटोकॉल को वर्कफ़्लो में संयोजित करें और वर्कफ़्लो चलाएँ. निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके परिणामी त्रि-आयामी छवियों का विश्लेषण करें।
    नोट: ब्याज की मात्रा का चयन करने के लिए सिमुलेशन सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। रेडियोधर्मिता क्षय इंजेक्शन समय के लिए सही है और कुल इंजेक्शन खुराक के प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत किया है/प्रति ग्राम ऊतक (% आईडी /

8. पूर्व विवो बायोडिस्ट्रीब्यूशन

  1. [68Ga]DPA (1.85 MBq/100 μL) को U87MG-असर वाले BALB/C नग्न चूहों को टेल वेन इंजेक्शन के माध्यम से प्रशासित करें। 1% -2% (वी / वी) isoflurane (1 एमएल / मिनट) का उपयोग चूहों एनेस्थेटाइज, तो 5, 30, 60, और 120 मिनट के लिए इंजेक्शन के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से तीन चूहों बलिदान.
    नोट: इस प्रक्रिया का प्रदर्शन करने वाले व्यक्तियों को गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के तकनीकी कौशल में प्रशिक्षित किया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि चेतना का नुकसान तेजी से प्रेरित हो। यह सुनिश्चित करेगा कि इस प्रयोग में इच्छामृत्यु प्रक्रियाएं सभी मानवीय रूप से की जाती हैं।
  2. मौत की पुष्टि होने के बाद चूहों की छाती की दीवार खोल दें। फिर, दिल खोलो। रक्त खींचने के लिए 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करें; गामा काउंटर के लिए एक रेडियोइम्यूनोसे (आरआईए) ट्यूब (व्यास में 13 मिमी) में सिरिंज से रक्त निचोड़ें।
  3. प्रमुख अंगों और ट्यूमर को एक्साइज करें और उन्हें गामा काउंटर के लिए आरआईए ट्यूबों (व्यास में 13 मिमी) में रखें। प्रमुख अंगों में कुल रक्त, हृदय, थाइमस, यकृत, प्लीहा, हड्डी, पेट, गुर्दे, मांसपेशी, आंतों के लिम्फ नोड, छोटी आंत, अग्न्याशय, वृषण, मस्तिष्क और फेफड़े शामिल हैं। सभी अंगों का वजन करें।
  4. एक autogamma काउंटर का उपयोग कर एकत्रित अंगों के भीतर रेडियोधर्मिता को मापने और क्षय मूल्यों सही. गीले ऊतक के प्रति ग्राम इंजेक्शन खुराक के प्रतिशत की गणना करें (% आईडी /

9. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

  1. ग्लियोमा ऊतकों को इकट्ठा करें और उन्हें पीबीएस के साथ 3x धो लें। ताजा ऊतकों को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में रखें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करें।
  2. पैराफिन में तय ऊतकों एम्बेड और 10 माइक्रोन की मोटाई के लिए उन्हें खंड. एक इनक्यूबेटर (60 डिग्री सेल्सियस) में वर्गों रखें और 2 घंटे के लिए सेते हैं. निम्नलिखित में प्रत्येक 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करके वर्गों को डीवैक्स और हाइड्रेट करें: xylene (दो बार), पूर्ण शराब, 95% शराब, 90% शराब, 80% शराब, 75% शराब।
  3. वर्गों को 0.01 एम सोडियम साइट्रेट में रखें और उन्हें 92-95 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। एंटीजन पुनर्प्राप्ति प्राप्त करने के लिए 40 मिनट के लिए तापमान बनाए रखें।
  4. वर्गों में एच2ओ2 समाधान (3%) के 200 माइक्रोन जोड़ें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए एंडोपरोक्सीडेस को निष्क्रिय करें। कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए 3% बीएसए के साथ उपचार द्वारा गैर-विशिष्ट साइटों को ब्लॉक करें।
  5. प्राथमिक एंटी-पीडी-एल 1 एंटीबॉडी (एमएबी, 1:100, 3% बीएसए में पतला) में वर्गों को रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: बीएसए के साथ अवरुद्ध करने के बाद, पीबीएस से न धोएं।
  6. पीबीएस के साथ वर्गों 3x धो लें. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एचआरपी लेबल बकरी विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी (1:500, पीबीएस में पतला) के साथ वर्गों को इनक्यूबेट करें।
  7. पीबीएस के साथ कोशिकाओं 3x धो लें. वर्गों में 3,3-डायमिनोबेंज़िडाइन (डीएबी) काम करने वाले समाधान (समाधान ए: समाधान बी: समाधान सी = 1:1:18) के 200 माइक्रोन जोड़ें और अंधेरे में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  8. पीबीएस के साथ वर्गों 3x धो लें. हेमेटोक्सिलिन समाधान (100%) के 500 माइक्रोन जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 5 मिन के लिए इनक्यूबेट करें। 30 एस के लिए पानी के साथ वर्गों धो लें. 30 एस के लिए भेदभाव समाधान (75% शराब: एचसीएल = 99: 1) में वर्गों रखो. 1 मिनट के लिए पानी का उपयोग कर वर्गों धो लें.
  9. क्रमिक 75% शराब, 80% शराब, 90% शराब, 95% शराब, निरपेक्ष शराब, और xylene (दो बार) (10 मिनट प्रत्येक) के साथ सेते द्वारा नमूनों निर्जलीकरण. तटस्थ राल का उपयोग करके सभी वर्गों को माउंट करें और उन्हें ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के नीचे देखें।

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Representative Results

[68Ga]DPA रेडियोलेबलिंग और स्थिरता
मॉडल पेप्टाइड, डीपीए, एक प्रभावी पीडी-एल 1 विरोधी है। DOTA-DPA >95% शुद्धता और 68% की उपज के साथ प्राप्त किया गया था। DOTA-DPA का द्रव्यमान प्रयोगात्मक रूप से 1,073.3 ([M+2H]2+) पर देखा जाता है। 68गैलियम पीईटी इमेजिंग के लिए पेप्टाइड्स लेबल करने के लिए एक उपयुक्त रेडियोन्यूक्लाइड माना जाता है, और इसलिए इस अध्ययन के लिए चुना गया था। 68Ga (आधा जीवन: 68 मिनट) के साथ radiolabel DPA करने के लिए, DOTA-PEG3-DPA संश्लेषित किया गया था(चित्रा 1A). DOTA का उपयोग 68Ga रेडियोलेबलिंग के लिए एक chelator के रूप में किया गया था। DOTA और DPA को स्थान देने के लिए, PEG3 का उपयोग लिंकर के रूप में किया गया था। [68Ga]-DOTA-PEG3-DPA (निम्नलिखित पाठ में [68Ga] DPA के रूप में संदर्भित) ने उच्च रेडियोकेमिकल उपज (>95%) और रेडियोकेमिकल शुद्धता (>95%) (तालिका 1) दिखाई। एचपीएलसी का उपयोग करके एक ट्रेसर स्थिरता परीक्षण भी किया गया था, और परिणामों से पता चला कि [68जीए] डीपीए में पीबीएस और माउस सीरम दोनों में बहुत स्थिरता थी। 68गा अपघटन या पेप्टाइड हाइड्रोलिसिस 37 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 1 बी) पर एक 4 घंटे इनक्यूबेशन के बाद पता नहीं चला था.

U87MG कोशिकाओं में PD-L1 की अभिव्यक्ति
पिछले एक अध्ययन से पता चला है कि पीडी-एल 1 की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति ग्लियोब्लास्टोमा ट्यूमर में खराब रोगी अस्तित्व के साथ सहसंबद्ध है, यह दर्शाता है कि पीडी-एल 1 ग्लियोब्लास्टोमा48 में एक उल्लेखनीय रोगनिरोधी बायोमार्कर और चिकित्सीय लक्ष्य हो सकता है। इसलिए, एक मानव ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइन, U87MG, का उपयोग PD-L1 ट्यूमर इमेजिंग के लिए PET/CT में [68Ga] DPA की प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए एक ट्यूमर मॉडल स्थापित करने के लिए किया गया था। प्रवाह साइटोमेट्री परिणामों ने सुझाव दिया कि U87MG कोशिकाओं का लगभग 60% पीडी-एल 1 सकारात्मक (चित्रा 2 ए) था। इसके अलावा, इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला U87MG कोशिकाओं(चित्रा 2B)में पीडी-एल 1 की मजबूत अभिव्यक्ति की पुष्टि की। साथ में, इन आंकड़ों ने प्रदर्शित किया कि U87MG सेल लाइन इस अध्ययन के लिए उपयुक्त थी।

सेलुलर तेज और [68Ga] DPA की विशिष्टता
U87MG कोशिकाओं द्वारा [68Ga] DPA के उत्थान ने एक समय-निर्भर पैटर्न प्रस्तुत किया। जब एक पीडी-एल 1 अवरोधक, बीएमएस 202, एक अवरुद्ध एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया गया था, तो बाध्यकारी भाग और [68जीए] डीपीए के तेज काफी कम हो गए थे(चित्रा 3ए)। एक प्रतिस्पर्धी बाध्यकारी परख ने U87MG कोशिकाओं के लिए BMS202 की बाध्यकारी आत्मीयता (Ki) की जांच की। BMS202 के लिए अनुमानित बाध्यकारी आत्मीयता 43.8 ± 8.6 nmol/L थी जब [68Ga] DPA को एक प्रतियोगी (चित्र 3B) के रूप में इस्तेमाल किया गया था।

[68जीए] ट्यूमर मॉडल की डीपीए पीईटी इमेजिंग
[68Ga] DPA की पीईटी इमेजिंग U87MG ट्यूमर-असर BALB/C नग्न चूहों में की गई थी। [68जीए] डीपीए को अंतःशिरा इंजेक्शन के माध्यम से प्रशासित किया गया था जब तक कि U87MG ट्यूमर 100 मिमी3 तक नहीं बढ़ गया। पूरे शरीर पीईटी छवियों इंजेक्शन के 30 और 60 मिनट के बाद ट्यूमर में उच्च [68जीए] डीपीए संचय का पता चला, और गुर्दे और मूत्राशय(चित्रा 4ए)में उच्चतम संचय दिखाया. यह पुष्टि करने के लिए कि क्या [68जीए] डीपीए विशेष रूप से पीडी-एल 1-पॉजिटिव ट्यूमर में जमा हुआ है, पैननेट सेल लाइन बॉन -1 को प्रभावित करने वाले एक अन्य माउस मॉडल को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। एक समानांतर प्रयोग ने 60 मिनट के बाद इंजेक्शन(चित्रा 4बी)पर बॉन-1 ट्यूमर में थोड़ा [68जीए] डीपीए संचय का प्रदर्शन किया।

इस अंतर को स्पष्ट करने के लिए, ट्यूमर के ऊतकों में पीडी-एल 1 अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला हो गया था। परिणामों से पता चला कि U87MG कोशिकाओं ने काफी पीडी-एल 1 अभिव्यक्ति (चित्रा 5 ए, सी) प्रस्तुत की, लेकिन बॉन-1 ट्यूमर (चित्रा 5 बी, सी) नहीं। ये डेटा पीईटी परिणामों के अनुरूप थे। इसलिए, यह संभव है कि विभिन्न ट्यूमर सेल विकास स्थितियों के परिणामस्वरूप अलग-अलग पीडी-एल 1 अभिव्यक्ति (जैसे, ऊतक परिगलन) हुई। यह सत्यापित करने के लिए, hematoxylin और eosin (एच एंड ई) धुंधला प्रदर्शन किया गया था. जैसा कि अपेक्षित था, दो ट्यूमर ऊतकों (चित्रा 5 डी) के बीच एक समान सेल आकृति विज्ञान मनाया गया था।

U68MG ट्यूमर में [87 Ga] DPA का पूर्व विवो बायोडिस्ट्रीब्यूशन
पूर्व विवो बायोडिस्ट्रीब्यूशन अध्ययन भी U87MG-असर वाले चूहों (तालिका 2) का उपयोग करके आयोजित किया गया था। परिणामों ने रक्त में तेजी से निकासी और हृदय, यकृत, फेफड़े और मांसपेशियों सहित अधिकांश विश्लेषण अंगों को दिखाया। गुर्दे ने रेडियोधर्मिता की उच्चतम मात्रा जमा की और 5 मिनट से 120 मिनट तक 0.12% ID/(g∙min) की निकासी दर दिखाई। ट्यूमर ने सभी समय बिंदुओं पर दूसरे उच्चतम अनुरेखक तेज का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, इंजेक्शन के बाद 5 मिनट से 60 मिनट तक, ट्यूमर ने 0.027% आईडी/(जी∙मिन) की कम ट्रेसर क्लीयरेंस दर प्रस्तुत की। रक्त के लिए, निकासी दर 0.069% ID/(g∙min) थी, जबकि मांसपेशियों के लिए, निकासी दर 0.037% ID/(g∙min) थी।

Figure 1
चित्रा 1: [68जीए] डीपीए रेडियोलेबलिंग और स्थिरता। (ए) [68जीए] डीपीए की रासायनिक संरचना और ट्यूमर कोशिकाओं को व्यक्त करने वाले पीडी-एल 1 के लिए इसके बंधन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (बी) एचपीएलसी वक्र 0.5, 2, और 4 घंटे के लिए पीबीएस या माउस सीरम के साथ इनक्यूबेशन के बाद [68जीए] डीपीए की रेडियोधर्मिता दिखा रहा है। यह आंकड़ा हू एट अल 47 से संशोधित किया गया था। संक्षिप्ताक्षर: डीपीए = डोडेकैपेप्टाइड विरोधी; पीडी-एल 1 = क्रमादेशित मृत्यु-लिगैंड 1; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर खारा; एचपीएलसी = उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: U87MG सेल लाइन में पीडी-एल 1 की अभिव्यक्ति। (ए) U87MG सेल लाइन में पीडी-एल 1 की अभिव्यक्ति प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के माध्यम से मापा गया था। (बी)U87MG कोशिकाओं में पीडी-एल 1 की अभिव्यक्ति इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला परख द्वारा मापा गया था। स्केल बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा हू एट अल 47 से संशोधित किया गया था। संक्षिप्ताक्षर: पीडी-एल 1 = क्रमादेशित मृत्यु-लिगैंड 1; एसएससी = साइड स्कैटर; FITC = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सेलुलर तेज और [68जीए] डीपीए का निषेध। (ए) U87MG कोशिकाओं का उठाव जब विभिन्न अवधियों के लिए [68Ga] DPA (0.74 MBq/mL) या [68Ga] DPA (0.74 MBq /mL) + BMS202 (100 μmol/L) के साथ इनक्यूबेट किया जाता है। (बी) BMS202 के साथ इनक्यूबेशन के बाद U87MG कोशिकाओं के लिए [68Ga] DPA (0.74 MBq /mL) का प्रतिस्पर्धी बंधन। Ki मान पैनल में दिखाया गया है। यह आंकड़ा हू एट अल 47 से संशोधित किया गया था। संक्षिप्ताक्षर: डीपीए = डोडेकैपेप्टाइड विरोधी; % AD = प्रशासित खुराक (बाध्यकारी भाग के संबंध में)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: पीडी-एल 1-ओवरएक्सप्रेस यू 87 एमजी ट्यूमर में [68जीए] डीपीए की पीईटी इमेजिंग। (ए, बी) पीईटी-सीटी छवियां 30 मिनट और 60 मिनट के लिए अंतःशिरा इंजेक्शन (~ 18.5 एमबीक्यू) के बाद U87MG-असर चूहों (ए) और बॉन-1-असर चूहों (नकारात्मक नियंत्रण, बी) में [68जीए] डीपीए का वितरण दिखा रही हैं। प्रतिनिधि मैक्सियमम-तीव्रता प्रक्षेपण (एमआईपी) (शीर्ष पैनल) और अनुप्रस्थ पीईटी-सीटी छवियां (नीचे पैनल) प्रस्तुत की जाती हैं। ट्यूमर की स्थिति सफेद धराशायी हलकों द्वारा चिह्नित हैं। यह आंकड़ा हू एट अल से संशोधित किया गया था।47. संक्षिप्ताक्षर: डीपीए = डोडेकैपेप्टाइड विरोधी; पीडी-एल 1 = क्रमादेशित मृत्यु-लिगैंड 1; पीईटी-सीटी = पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी-गणना टोमोग्राफी; एमआईपी = अधिकतम-तीव्रता प्रक्षेपण; पी.आई. = इंजेक्शन के बाद। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: [68जीए] डीपीए-उपचारित ट्यूमर का इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण। (ए, बी) पीडी-एल 1 की पूरी-खंड इम्यूनोहिस्टोकेमिकल छवियां (ए) यू 87 एमजी और (बी) बॉन -1 ट्यूमर में। (C) A और B में चिह्नित क्षेत्रों के बढ़े हुए चित्र। (डी) U87MG और बॉन -1 ट्यूमर के एच एंड ई धुंधला। स्केल बार = 100 माइक्रोन (सी, डी)। यह आंकड़ा हू एट अल 47 से संशोधित किया गया था। संक्षिप्ताक्षर: डीपीए = डोडेकैपेप्टाइड विरोधी; पीडी-एल 1 = क्रमादेशित मृत्यु-लिगैंड 1; H&E = हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

ट्रेसर [68जीए] डीपीए
रेडियोकेमिकल उपज (%) >95
मोलर गतिविधि (GBq μmol-1) 37 ± 8
रेडियोकेमिकल शुद्धताa (%) >95

तालिका 1: रेडियोलेबलिंग और [68Ga] DPA का गुणवत्ता नियंत्रण। रेडियोकेमिकल उपज, दाढ़ गतिविधि, और [68जीए] डीपीए की रेडियोकेमिकल शुद्धता। डेटा को एसडी (एन = 7) ± माध्य के रूप में दर्शाया जाता है। इस तालिका को हू एट अल.47 से संशोधित किया गया था। संक्षिप्त: डीपीए = डोडेकेपेप्टाइड प्रतिपक्षी। एक[68जीए] डीपीए की रेडियोकेमिकल शुद्धता का विश्लेषण रिवर्स-फेज एचपीएलसी द्वारा एक अनुकूलित स्थिति के तहत किया गया था: 1) कॉलम: वाईएमसी-ट्रायट-सी 18 (4.6 मिमी आईडी, 150 मिमी, 5 मिमी); 2) विलायक ढाल: विलायक ए-विआयनीकृत पानी; विलायक बी-एसीटोनिट्राइल (0.1% ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड); प्रवाह समय: 20 मिनट, एसीटोनिट्राइल के साथ 10% से 90% तक; 1 एमएल / मिनट की प्रवाह दर।

[68जीए] डीपीए
5 मिन 30 मिण्ट 60 मिण्ट 120 मि
रुधिर 3.89 ±0.43 1.55 ±1.07 0.11 ±0.02 0.05 ±0.01
हृदय 1.19 ±0.39 0.52 ±0.33 0.06 ±0.02 0.05 ±0.02
कलेजी 1.06 ±0.26 0.59 ±0.43 0.19 ±0.02 0.16 ±0.04
गु़स्‍सा 0.98 ±0.14 0.68 ±0.67 0.14 ±0.06 0.09 ±0.03
फेफड़ा 1.64 ±0.42 1.03 ±0.9 0.13 ±0.05 0.09 ±0.02
गुर्दा 19.23 ±1.95 16.13 ±1.51 11.5 ±0.44 5.2 ±0.31
पेट 1.54 ±0.1 0.61 ±0.35 0.08 ±0.01 0.08 ±0.03
आंत्र 0.72 ±0.27 0.47 ±0.35 0.08 ±0.02 0.06 ±0.03
अग्न्याशय 1.88 ±0.28 0.77 ±0.75 0.16 ±0.03 0.13 ±0.03
मांसपेशियां 2.21 ±0.27 0.71 ±0.37 0.18 ±0.02 0.14 ±0.04
हडि्‌डयाँ निकालना 2.18 ±0.11 0.85 ±0.51 0.26 ±0.09 0.14 ±0.06
मस्तिष्क 0.19 ±0.04 0.11 ±0.08 0.03 ±0.01 0.02 ±0.01
ट्यूमर 4.5 ±0.32 3.77 ±0.27 2.99 ±0.03 0.89 ±0.19
चरबी 2.09 ±0.49 0.81 ±0.12 0.27 ±0.07 0.1 ±0.07

तालिका 2: विभिन्न अवधि के लिए प्रशासन के बाद U87MG ट्यूमर-असर चूहों में [68Ga] DPA का जैव वितरण (n = 3 प्रति समय बिंदु)। यह तालिका हू एट अल.47 से संशोधित है। संक्षिप्त: डीपीए = डोडेकेपेप्टाइड प्रतिपक्षी।

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Discussion

इस विधि में वर्णित महत्वपूर्ण कदमों में डीपीए के लिए 68जीए की कुशल लेबलिंग और पीईटी इमेजिंग के लिए उपयुक्त समय खिड़की चुनना शामिल है, जो ट्यूमर में डीपीए के फार्माकोडायनामिक पैटर्न से पूरी तरह मेल खाना चाहिए।

आईएचसी के विपरीत, पीईटी इमेजिंग एक विषम ट्यूमर 6,7 में प्रत्येक सकारात्मक क्षेत्र के दृश्य की अनुमति देता है, एक noninvasive तरीके से पूरे शरीर पीडी-एल 1 अभिव्यक्ति के वास्तविक समय का पता लगाने में सक्षम बनाता है. एंटीबॉडी और छोटे अणुओं के नुकसान से बचने के लिए पेप्टाइड्स को लिगेंड के रूप में चुना गया था। बड़े आणविक भार वाले एंटीबॉडी में आमतौर पर लंबे समय तक आधे जीवन का संचार होता है, जो स्वस्थ अंगों को उच्च विषाक्तता का कारण बनता है। छोटे अणुओं की निकासी आमतौर पर आवश्यक ट्यूमर प्रतिधारण प्राप्त करने के लिए बहुत तेज होती है। पेप्टाइड्स का आणविक भार एंटीबॉडी और छोटे अणुओं के बीच होता है। यह पेप्टाइड आधारित रेडियोट्रेसर को न्यूनतम विषाक्तता 13,49,50,51,52,53 के साथ दीर्घकालिक ट्यूमर प्रतिधारण और अच्छे ऊतक प्रवेश दोनों को प्राप्त करने में सक्षम बनाता है। महत्वपूर्ण रूप से, आमतौर पर रिपोर्ट किए गए एल-पेप्टाइड्स के बजाय डी-पेप्टाइड डीपीए की उपयोगिता, [68जीए] डीपीए को उल्लेखनीय रूप से लंबे समय तक चयापचय आधे जीवन के साथ प्रदान करती है। इसके अलावा, डीपीए को विवो में सकारात्मक रूप से चार्ज और हाइड्रोफिलिक किया जाता है, और इसलिए इसमें उच्च घुलनशीलता होती है और यह रक्त में निरर्थक लक्ष्यीकरण से बच सकता है, जिससे उच्च इमेजिंग गुणवत्ता के साथ पीईटी छवियों की पीढ़ी की सुविधा मिलती है।

विशेष रूप से, सफल 68Ga रेडियोलेबलिंग के लिए एक विशिष्ट pH और संक्रमण धातु आयनों, जैसे Cu (II) और Fe (III) धनायनों से कोई हस्तक्षेप नहीं होता है। कुछ मामलों में, Cu2+ संदूषण कम रेडियोकेमिकल उपज की ओर जाता है। इसलिए, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि सभी कंटेनर और विंदुक युक्तियाँ दूषित नहीं हैं। इसके अलावा, इस पद्धति में, U87MG का उपयोग ट्यूमर टीकाकरण के लिए किया गया था। हालांकि U87MG xenografts में पीडी-एल 1 अभिव्यक्ति पिछले अध्ययनों में सत्यापित किया गया था, इसकी अभिव्यक्ति व्यक्तिगत जानवरों में भिन्न होती है। इसलिए, U87MG ट्यूमर में ट्रेसर का पूर्ण तेज व्यक्तिगत चूहों में भिन्न होता है। ट्यूमर में प्रभावी ट्रेसर तेज सुनिश्चित करने के लिए, उपयुक्त ट्यूमर आकार (500 मिमी3 < मात्रा < 100 मिमी3) वाले जानवरों को पीईटी स्कैनिंग के लिए चुना जाना चाहिए।

[68जीए] डीपीए की सीमाओं में से एक यह है कि पीडी-एल 1 के लिए डीपीए की बाध्यकारी संबंध कई अन्य पीडी-एल 1 लक्ष्यीकरण पेप्टाइड्स, जैसे डब्ल्यूएल 12 की तुलना में अपेक्षाकृत कम है, जो इसे अपेक्षाकृत कम पीडी-एल 1 अभिव्यक्ति26,47 के साथ ट्यूमर के लिए अनुपयुक्त बनाता है। डी-पेप्टाइड के आगे संशोधन से इसकी विशिष्ट बाध्यकारी क्षमता में सुधार होगा। इसके अलावा, [68Ga] DPA के इमेजिंग प्रभाव को बढ़ाने के लिए, इंजेक्शन रणनीति के निर्माण को अनुकूलित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, गैर-विशिष्ट बाध्यकारी साइटों को ब्लॉक करने के लिए [68Ga] DPA से पहले बिना लेबल वाले DPA को समवर्ती रूप से इंजेक्ट करके 54,55,56।

अंत में, इस अध्ययन ने रेडियोट्रेसर के रूप में [68Ga] DPA का उपयोग करके जीवित जानवरों के पूरे शरीर में PD-L1 वितरण को ट्रैक करने के लिए एक गैर-आक्रामक और वास्तविक समय विधि विकसित की। परिणामों ने विवो विशिष्ट बाध्यकारी आत्मीयता, अनुकूल स्थिरता और [68जीए] डीपीए की उत्कृष्ट इमेजिंग क्षमता में अपेक्षाकृत उच्च का खुलासा किया, यह सुझाव देते हुए कि [68जीए] डीपीए-पीईटी पीडी-एल 1-ओवरएक्सप्रेस ट्यूमर की कल्पना करने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है। इसके अलावा, इस तकनीक को पीडी-एल 1 पॉजिटिव ट्यूमर के उपचार के लिए भी लागू किया जा सकता है जब डीपीए को अन्य रेडियोन्यूक्लाइड, जैसे 177लू और 225एसी के साथ लेबल किया जाता है। इसलिए, डीपीए रेडियोलेबलिंग तकनीक न केवल आईएचसी निर्भर निदान की सीमा को पार करती है, बल्कि उपचार के लिए एक नया विकल्प भी प्रदान करती है।

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Disclosures

कोई प्रतिस्पर्धी हित घोषित नहीं किया जाता है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को गैर-लाभकारी सेंट्रल रिसर्च इंस्टीट्यूट फंड ऑफ चाइनीज एकेडमी ऑफ मेडिकल साइंसेज (संख्या 2022-RC350-04) और चिकित्सा विज्ञान के लिए CAMS इनोवेशन फंड (संख्या 2021-I2M-1-026, 2022-I2M-1-026-1, 02120101, 02130101, और 2022-I2M-2-002) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) Merck 60239-18-1 68Ga  chelation
3,3-diaminobenzidine (DAB) Kit Sigma-Aldrich D7304-1SET Immunohistochemistry
anti-PD-L1 monoclonal antibody Wuhan Proteintech 17952-1-ap Immunohistochemistry: primary antibody
BMS202 Selleck 1675203-84-5 Competitive binding assay: inhibitor
BSA Merck V900933 Immunofluorescent : blocking 
DAPI Merck D9542 Immunofluorescent: staining of nucleus
Dichloromethane (DCM) Merck 34856 Solvent
DIPEA Merck 3439 Peptide coupling
EDC·HCl Merck E6383 Activation of DOTA
FBS Gibco 10099 Cell culture: supplement
FITC-conjugated anti-human IgG Fc Antibody Biolegend 409310 Immunofluorescent: secondary antibody
FITC-conjugated anti PD-L1 antibody Biolegend 393606 Flow cytometry: direct antibody
HCTU Energy Chemical E070004-25g Peptide coupling
HRP labeled goat anti-rabbit antibody Servicebio GB23303 Immunohistochemistry: secondary antibody
Hydroxysuccinimide (NHS) Merck 130672 Activation of DOTA
MeCN Merck PHR1551 Solvent
Morpholine Merck 8.06127 Fmoc- deprotection
NMP Merck 8.06072 Solevent
Paraformaldehyde Merck 30525-89-4 Fixation of tissues
PBS Gibco 10010023 Cell culture: buffer
Penicillin-streptomycin  Gibco 10378016 Cell culture: supplement
RIA tube PolyLab P10301A As tissue sample container
RPMI-1640 medium Gibco 11875093 Cell culture: basic medium
Sodium acetate Merck 1.06264 Salt for buffer
Trypsin-EDTA Gibco 25200056 Cell culture: dissociation agent
U87MG cell line Procell Life Science & Technology Co CL-0238 Cell model
Equipment
68Ge/68Ga generator Isotope Technologies Munich, ITM Not applicable Generation of [68Ga]
Autogamma counter Perkin Elmer  Wizard2 Detection of radioactivity
Confocal fluorescent microscopy Keyence Observation of immunofluorescent results
Flow cytometer Becton Dickinson, BD LSRII Monitoring the PD-L1 positive cells
High-performance liquid chromatography (HPLC) SHIMAZU LC-20AT  Purification of DPA peptide
PET scanner Siemens Medical Solutions Inveon MultiModality System PET imaging
Optical microscopy Nikon  Eclipse E100 Observation of immunohistochemistry results
Solid phase peptide synthesizer Promega Vac-Man Laboratory Vacuum Manifold LOT#11101 Synthesis of DPA-DOTA peptide
Software
ASIPro Siemens Medical Solutions Not applicable Analysis of PET-CT results
FlowJo Becton Dickinson, BD FlowJo 7.6.1 Analysis of the flow cytometer results
Inveon Acquisition Workplace (IAW) Siemens Medical Solutions Not applicable Management of PET mechine
Prism Graphpad Prism 8.0 Analysis of the data 

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