Summary
本研究では、[68Ga] D-ドデカペプチド拮抗薬の陽電子放出断層撮影法に基づき、プログラムされたデスリガンド1の全身分布を評価するための非侵襲的かつリアルタイムな方法を開発しました。この技術は、従来の免疫組織化学よりも利点があり、免疫チェックポイント遮断療法の恩恵を受ける適切な患者を特定する効率を向上させます。
Abstract
近年、プログラム細胞死タンパク質1(PD-1)/プログラム死リガンド1(PD-L1)に基づく免疫チェックポイント遮断療法の開発は、がん治療に革命をもたらしました。しかし、腫瘍細胞におけるPD-L1の発現が不均一であるため、PD-1/PD-L1阻害剤に反応する患者はごくわずかです。この不均一性は、一般的に使用される免疫組織化学(IHC)アプローチによる腫瘍細胞の正確な検出における課題を提示します。この状況では、治療効果を改善するために、免疫チェックポイント遮断療法の恩恵を受ける患者を層別化するためのより良い方法が必要です。陽電子放射断層撮影法(PET)は、全身のPD-L1発現を非侵襲的にリアルタイムに可視化することができます。そのため、PETイメージングにより腫瘍中のPD-L1分布を検出するための放射性標識トレーサーの開発が求められています。
デキストロロータリー(D)-ペプチドは、L型ペプチドと比較して、タンパク質分解耐性や代謝半減期の長期化などの特性を持っています。本研究では、担がんマウスにおけるD-ドデカペプチド拮抗薬(DPA)である 68個のGa標識PD-L1標的D-ペプチドのPETイメージングに基づいて、PD-L1発現を検出する新しい方法を設計しました。その結果、[68Ga]DPAは in vivoでPD-L1過剰発現腫瘍に特異的に結合し、良好な安定性と優れたイメージング能力を示し、[68Ga]DPA-PETが腫瘍におけるPD-L1状態の評価に有望なアプローチであることが示唆されました。
Introduction
免疫チェックポイント蛋白質の発見は、腫瘍治療におけるブレークスルーであり、免疫チェックポイント遮断療法の開発に大きな進歩をもたらしました1。プログラム細胞死タンパク質1(PD-1)およびプログラム死リガンド1(PD-L1)は、食品医薬品局(FDA)によって承認されたいくつかの抗体を持つ潜在的な創薬標的です。PD-1は、CD4+、CD8+ T細胞、制御性T細胞などの腫瘍浸潤免疫細胞によって発現されます。PD-L1はPD-1リガンドの1つであり、さまざまな腫瘍細胞で過剰発現しています2,3。PD-1とPD-L1の相互作用によりPD-1が不活性化され、抗腫瘍免疫応答が抑制される4。これらの知見は、PD-L1を阻害することで免疫細胞の殺傷効果を高め、腫瘍細胞を排除できることを示唆している5。現在、発色性免疫組織化学(IHC)は、免疫チェックポイント療法に反応する可能性が最も高い患者を特定するために最も一般的に使用されているアプローチです6,7。しかし、腫瘍細胞におけるPD-L1の発現は不均一であるため、生検によるIHCの結果は、患者のPD-L1発現に関する正確な情報を提供することはできません8。以前の研究では、患者の20%〜40%のみが免疫チェックポイント遮断療法から長期的な利益を得ることが報告されています1,9,10。したがって、これらの免疫チェックポイントタンパク質の不均一な発現によって引き起こされる偽陰性の結果を回避するための新しい方法の開発が急務です。
陽電子放射断層撮影法(PET)などの分子イメージング技術は、非侵襲的に全身をリアルタイムに可視化できるため、従来のIHC法を凌駕することができます11,12,13。放射性標識抗体、ペプチド、および低分子は、がん患者におけるPD-L1発現をモニタリングするための有望なトレーサーです14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25.FDAは、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブの3つのPD-L1治療用モノクローナル抗体を承認しています26。これらの抗体に基づく免疫PETトレーサーは、十分に文書化されています27、28、29、30、31、32。初期段階の臨床試験では、薬物動態が好ましくないため、臨床応用の価値が限られていることが明らかになっています30。抗体と比較して、ペプチドは健康な臓器からの血液や臓器のクリアランスが速く、化学的に容易に修飾することができる33。PD-1/PD-L1に高い親和性を持つ複数のペプチドが報告されています2;WL12は、PD-L134に特異的結合を示す報告済みのペプチドである。放射性標識トレーサーである[64Cu]WL12、[68Ga]WL12、および[18F]FPyWL12は、in vivo特異的な腫瘍標的化能力が高いことが報告されており、腫瘍26、35、36、37におけるPD-L1発現の高品質画像の収集が可能です。さらに、放射性標識WL12の最初のヒト内評価は、[68Ga]WL12(NOTAによってキレート化)が臨床腫瘍画像化のための安全で効率的な可能性を有することを実証した38。WL12は疎水性が高く、健康な肝臓への取り込みが多いため、臨床使用は限られています。PD-L1に特異的に結合するTPP1やSETSKSFなどの他の放射性標識ペプチドも、全身のPD-L1発現を可視化するための潜在的な安定性と特異性を示しています39,40。しかし、未修飾のペプチドはプロテアーゼによって容易に分解され、腎臓によって急速に代謝されます。デキストロロタリー(D)ペプチドは、左利き(L)ペプチドの安定性が低いため、効果的なメディエーターとして広く使用されています41,42,43。D-ペプチドはタンパク質分解に対して非常に耐性があり、代謝半減期が著しく長くなります。L-ペプチドと比較して、D-ペプチドは主に特異的結合能力を示します44,45,46。
本研究は、担がんマウスモデル47において、 68Ga標識PD-L1標的D-ペプチド、D-ドデカペプチド拮抗薬(DPA)のPETイメージングに基づいて、PD-L1発現を検出する新しい方法を設計した47。[68Ga]DPAの安定性は、最初にリン酸緩衝生理食塩水(PBS)とマウス血清で研究され、その後、PD-L1過剰発現腫瘍における[68Ga]DPAの結合親和性がテストされました。その後、膠芽腫異種移植モデルでPETイメージングを行い、[68Ga]DPAが腫瘍におけるPD-L1発現をモニターするのに理想的なPETトレーサーであるかどうかを確認しました。PETイメージングとDPAの組み合わせは、PD-L1の不均一な発現に関連する課題を克服するための新しいアプローチを提供するだけでなく、D-ペプチドベースの放射性トレーサーの開発の基礎を築きます。
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Protocol
動物実験手順は、南京医科大学の動物倫理委員会または国立量子科学技術研究所によって承認されました。マウス実験は、実験動物管理委員会の制度的ガイドラインに従って厳格に行われました。
1. ペプチド合成
- 100 mg の 4-メチルベンズヒドリルアミン (MBHA) 樹脂 (負荷量 0.37 mmol/g) を 1 mL の N-メチル-2-ピロリドン (NMP) 中で 30 分間、穏やかな N2 バブリング下で 30 分間膨潤させます。
- FMP1 mL中にFmoc保護アミノ酸(5.0当量)、HCTU(4.9当量)、DIPEA(10.0当量)からなるフレッシュストックバッファーを調製し、樹脂(100 mg)に添加します。カップリング反応を1.5〜2時間進行させます。
- NMP中に50%(vol/vol)モルホリンからなる脱保護緩衝液を調製します。レジン(100 mg)を1 mLの脱保護バッファーで2 x 30分間洗浄し、アミン基のFmoc基を除去します。レジンをジクロロメタン(DCM;1 mL)で1分間洗浄し、DCMを除去し、NMP(1 mL)でさらに1分間再洗浄します。次に、NMPを除去し、DCMで1分間レジンを再洗浄します。
注意: すべての洗浄手順は、マイルドなN2 バブリング下で行われます。上記の手順を最後のアミノ酸まで繰り返します。 - 1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸(DOTA)をペプチドに添加するには、 N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N-エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC·HCl)および N-ヒドロキシコハク酸イミド(NHS)。Incubate the stock buffer of DOTA/EDC·モル比 1:1:1 のモル比でジメチルスルホキシド (DMSO) 中で 3 時間、最終 DOTA 濃度 1 M の HCl/NHS。次に、ストックバッファー(1 mL)を樹脂(100 mg)に加え、穏やかなN2 バブリングで2時間反応を進行させます。
注:1,4,7-トリアザシクロノナン-1,4,7-トリアチン酸(NOTA)は、 68Ga錯体のキレート剤としても利用できます。NOTAカップリングにも同じ手順を使用できます。 - DCMで上から樹脂をすすぎ、真空をかけると残留反応液が同時に除去されます。DCM(1.5 mL)で樹脂を3回すすぎ、MeOH(1.5 mL)でリンスして樹脂を収縮させます。レジンが乾くまで、レジンを窒素下に一晩、または高真空下に4時間以上置きます。
- 乾燥したDPAペプチド含有樹脂をスクリューキャップ付きの2 mLポリプロピレン製容器に入れます。適切な切断カクテル(容量95/2.5/2.5 TFA/TIS/H2O、樹脂1 mL/100 mg)を加え、スクリューキャップを使用して容器をしっかりと密封します。ドラフト内のオービタルシェーカーで20〜25°Cで2時間静かに攪拌します。
注意: トリフルオロ酢酸(TFA)は腐食性が高いため、防護服を着用してドラフト内で調製してください。 - ドラフト内の窒素下で蒸発させることにより、TFAの大部分を除去します。ジエチルエーテル(~1.5 mL/100 mgの樹脂)を添加してペプチドを沈殿させます。
- 混合物をボルテックスしてペプチドを粉砕し、室温(10,000 × g、5分)で遠心分離します。容器から溶剤を慎重に注ぎます。手順1.7〜1.8を繰り返します。
- 開いた容器で残留物を10分間風乾します。50%(vol/vol)のアセトニトリル水溶液を添加し、1〜2秒間ボルテックスして生成物(1 mL/100 mgの樹脂)を溶解します。
- 混合物を濾過してレジンを除去し、0.2 mLの50%(vol/vol)アセトニトリル水溶液を使用してレジンを2回洗浄します。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)精製用の濾液を混合します。以下のHPLC条件をご使用ください。カラム:YMC-Triat-C18(内径4.6 mm、150 mm、5 mm);溶媒勾配:溶媒A-脱イオン水;溶媒B-アセトニトリル(0.1%TFA);流動時間:20分、アセトニトリルで10%から90%。流速:1mL/分
- 採取したHPLC溶離液を-80°Cで一晩凍結し、凍結乾燥(-50°C、<1 pa)します。放射性標識の場合は、固体ペプチドを酢酸ナトリウム緩衝液(100 mM、pH 5.0)に最終濃度1 mg/mLでストック緩衝液として溶解します。
2. 68Gaの放射性標識
注 68Gaは、南京第一病院(中国・南京市)の院内製で、 68Ge/68Ga発生装置を用いて生成した。
- 5 μLのストックバッファーをスクリューキャップ付きの1.5 mLポリプロピレン製容器にピペットで移します。容器に200 MBq [68Ga]GaCl3 (400 μL)を添加します。
- 混合物を5秒間ボルテックスします。pHテストストリップを使用してpHを測定します。NaOH(0.1 M)でpHを4〜4.5に調整します。
注:適切なpHは、 68GaとDOTAの間の錯体形成にとって重要です。 - 溶液を室温で5〜10分間インキュベートします。反応混合物を放射性HPLCにかけ、以下の条件下で放射性標識収率分析を行います:カラム:YMC-Triat-C18(内径4.6 mm、150 mm、5 mm)。溶媒勾配:溶媒A-脱イオン水;溶媒B-アセトニトリル(0.1%TFA);流動時間:20分、アセトニトリルで10%から90%。流速:1mL/分
注:放射性薄層クロマトグラフィー(TLC)は、放射性標識の収率を調べるための代替アプローチとして使用できます。推奨されるTLC溶出緩衝液は、0.1 M Na3C6H5O7、pH 4です。
3. トレーサー安定性試験
- PBSにおけるトレーサー安定性試験
- PBS(990 μL)に [68Ga]DPA(10 μL、3.7 MBq、NaOAc)を添加します。37°Cで1時間、2時間、4時間、わずかに撹拌しながらインキュベートします。
- 各時点で200μLの溶液を回収します。分析のためにラジオHPLCに注入します。
- マウス血清中のトレーサー安定性
- [68Ga]DPA(10 μL、~3.7 MBq、NaOAc中)をマウス血清(90 μL、新たに調製)に加えます。37°Cで1時間、2時間、4時間、わずかに撹拌しながらインキュベートします。
- 各時点で20 μLの溶液を回収します。MeCNと水(100 μL、1:1、v/v)を加えます。
- 混合物を10分間遠心分離します(5,000 × g、25°C)。上清をラジオHPLCで分析します。
4. フローサイトメトリーによるPD-L1発現の解析
- RPMI-1640培地に10%(vol/vol)のウシ胎児血清と1%ペニシリン-ストレプトマイシン(vol/vol)を添加して培地を調製します。U87MG細胞を培地に再懸濁し、105 細胞/ウェルの密度で12ウェルプレートに播種します。細胞をインキュベーター(5%CO2、37°C)に入れ、乱さずに少なくとも24時間培養します。
- 細胞を0.5 mLのPBSで洗浄し、250 μLのトリプシン-EDTA(0.25%)を添加します。細胞をインキュベーター(5% CO2、37°C)に2分間戻します。
- 1 mLの培地を加えて、細胞の解離を停止します。細胞に培地を添加し、ピペッティングで上下させて皿から分離し、1.5 mLチューブに集めます。細胞を5分間遠心分離します(100×g)。
- 上清を除去し、細胞を1 mLのPBSに再懸濁します。細胞を5分間遠心分離します(100× g)。この手順をもう一度繰り返します。
- フルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識PD-L1抗体を3%ウシ血清アルブミン(BSA)で20 nmol/Lに希釈します。 細胞に添加し、4°Cで1時間インキュベートします。
- 細胞を5分間遠心分離(100× g)した後、冷たいPBSで2回洗浄します。PD-L1陽性細胞をフローサイトメーターと解析ソフトウェアを用いて解析します。
5. 免疫細胞化学
- U87MG細胞をガラス底の細胞培養皿(35 mm)に2.5 × 105個の細胞 の密度で播種します。60%のコンフルエントに達したら、培地を吸引し、PBSを1 mL添加します。静かに数回振って吸引します。洗浄ステップを3回実行します。
- 500μLの4%パラホルムアルデヒドを皿に加えます。セルを室温に置き、30分間固定します。
- 細胞をPBSで3回洗浄します。1 mL の 3% BSA(wt/vol、PBS 中)を加え、固定細胞を室温で 2 時間ブロッキングします。
- 3% BSAを除去し、一次抗PD-L1抗体(mAb、1:100、3% BSAで希釈)とともに細胞を直接インキュベートし、4°Cで一晩インキュベートします。
注:BSAで細胞をブロックした後は、PBSで洗浄しないでください。 - 細胞を3%BSA緩衝液で3回洗浄します。FITC標識抗ヒトIgG Fc二次抗体(1:500、PBSで希釈)と細胞を1時間インキュベートします。
- 細胞をPBSで3回洗浄します。0.5 mLのDAPI(1 μg/mL)を細胞に加え、室温で1時間インキュベートします。染色した細胞をPBSで3回洗浄し、共焦点蛍光顕微鏡で観察します。
6. 細胞の取り込み・阻害実験
- 細胞取り込み実験
- U87MG細胞を12ウェルプレートで80%のコンフルエントに達するまで培養します。培地を取り除き、0.5 mLのPBSで細胞を洗浄します。
- [68Ga]DPAを新鮮な培地で74 KBq/mLの濃度に希釈します。希釈した[68Ga]DPAバッファー0.5 mLを各ウェルに加えます。
- 細胞を[68Ga]DPAで37°Cで異なる時間(10分、30分、40分、120分)インキュベートします。ピペットを使用して培地を吸引します。細胞をPBS(0.5 mL)で3回洗浄します。
- NaOH溶液(0.5 M、ウェルあたり300 μL)を添加して細胞を溶解します。30秒後、粘性細胞ライセートを1.5 mLチューブに回収します。
- プレートを0.4 mLのPBSで2回洗浄します。洗浄液を上記の1.5mLチューブに集めます。
- 自動ガンマカウンターの内蔵コンピューターを起動します。チューブを内蔵棚に入れます。すべてのサンプルをコンベアにセットしたら、STARTボタンを押します。結果は内部ソフトウェアで計算されます。読み出しには、各チューブの毎分(CPM)の減衰相関カウントが記録されます。
- 競合結合アッセイ
- U87MG細胞を12ウェルプレートで80%のコンフルエントに達するまで培養します。培地を取り除き、0.5 mLのPBSで細胞を洗浄します。
- [68Ga]DPAを新鮮な培地で74 KBq/mLの濃度に希釈します。適量のBMS202化合物を10%DMSOに溶解し、10 mMの濃度(400 μL)にします。
- 4 μL の 10 mM BMS202 を 396 μL の PBS で希釈し、濃度 100 μM にします。 このステップを繰り返して、さまざまな濃度の BMS202(1 μM、10 nM、100 pM、1 pM)を得ます。
- 希釈した[68Ga]DPAバッファー0.5 mLを各ウェル(ウェルあたり0.37 MBq)に添加します。5 μL の BMS202 溶液を各ウェル(各濃度に 3 つのウェル)に加えます。細胞インキュベーター内で37°Cで120分間インキュベートします。
- ピペットを使用して培地を吸引します。細胞を 3 x 0.5 mL の PBS で洗浄します。
- NaOH溶液(0.5 M、ウェルあたり300 μL)を加えて細胞を溶解します。30秒後、粘性細胞ライセートを1.5 mLチューブに回収します。プレートを 2 x 0.4 mL の PBS で洗浄します。
- 洗浄液を上記の1.5mLチューブに集めます。チューブを自動ガンマカウンターの内蔵棚に入れます。
- 手順 6.1.6 と同じ手順に従います。
7. PETイメージング
注:0.796 mm間隔(中心から中心)に159の横方向の軸断面を提供し、水平視野10 cm、軸方向視野12.7 cmのマイクロPETスキャナーを使用して、小動物PETイメージングを実行します。リストモードで収集されたすべてのデータは、3次元サイノグラムに編成されます。次に、フーリエは2次元サイノグラムに再構成されます(フレーム×分:4 × 1、8 × 2、8、× 5)。
- この研究では、5〜8週齢の雄のBALB / Cヌードマウスを使用します。ステップ4.1〜4.4に従ってU87MG細胞を回収し、細胞を0.5 mLシリンジに吸引します。細胞をマウスに皮下注射する(1腫瘍あたり1×106 細胞、マウス1匹あたり2つの腫瘍)。腫瘍の体積が100〜300 mmになるまで、注射後の腫瘍の成長を監視します3。
- 1%-2%(v / v)イソフルラン(1 mL / min)を使用してマウスを麻酔します。.加熱装置の電源を入れ、PETの動物床を37°Cに保ちます。
- 麻酔をかけたマウスをPET装置の動物用ベッドの正しい位置に置きます。乾燥を防ぐために両目に眼軟膏を塗ります。
注意: スキャン中にマウスが死なないように、マウスをうつ伏せの位置に置いてください。イメージングプロセス全体を通して、事前に取り付けられたチューブを使用して鼻 から イソフルラン流量(1.0 mL/分)を投与します。 - コントロールパネル から 動物のベッドの位置を調整します。トレーサー(10-17 MBq/100-200 μL)を、あらかじめ取り付けられた尾静脈カテーテルから静脈内注射します。
- 参照ソフトウェアを使用して、ホストコンピュータでスキャンワークフローを作成します( 材料表を参照)。 スタディフォルダを作成し、メーカーのプロトコルに従って取得プロトコルを設定します。 3Dリストモードですべてのマウスに対して動的スキャン(マウスごとに60分)を実行します。
- ヒストグラムプロトコルと再構成プロトコルをメーカーのプロトコルに従って定義します。ナイキストカットオフが0.5サイクル/ピクセルのハニングフィルターを使用して、フィルターバックプロジェクションでPET動的画像(25〜30分および55〜60分)を再構成します。すべてのマウスの最大強度投影 (MIP) イメージを生成します。
- ワークフロー内のプロトコルを結合し、ワークフローを実行します。得られた3次元画像を、メーカーのプロトコルに従って、ソフトウェアを使用して解析します。
注: シミュレーション ソフトウェアを使用して、目的のボリュームを選択します。放射能は注射時間に合わせて崩壊補正され、総注入線量/グラム組織あたりのパーセンテージ(%ID / g)として表示されます。.
8. 生体外で の生体内分布
- 尾静脈注射により、U87MG含有BALB/Cヌードマウスに[68Ga]DPA(1.85 MBq/100 μL)を投与する。1%-2%(v / v)イソフルラン(1 mL / min)を使用してマウスを麻酔し、注射後に子宮頸部脱臼を介して3匹のマウスを5、30、60、および120分間犠牲にします。.
注:この手順を実演する個人は、意識喪失が急速に誘発されるように、子宮頸部脱臼の技術的スキルの訓練を受ける必要があります。これにより、この実験における安楽死の手続きがすべて人道的に行われることが保証されます。 - 死亡が確認されたら、マウスの胸壁を開きます。そして、心を開いてください。1 mLのシリンジを使用して採血します。シリンジからガンマカウンター用のラジオイムノアッセイ(RIA)チューブ(直径13 mm)に血液を絞ります。.
- 主要な臓器と腫瘍を切除し、ガンマカウンター用のRIAチューブ(直径13 mm)に入れます。主な臓器には、総血液、心臓、胸腺、肝臓、脾臓、骨、胃、腎臓、筋肉、腸リンパ節、小腸、膵臓、精巣、脳、肺などがあります。すべての臓器の重さを量ります。
- 採取した臓器内の放射能をオートガンマカウンターで測定し、その値を減衰補正します。ウェットティッシュのグラムあたりの注射用量のパーセンテージ(%ID / g)を計算します。.
9. 免疫組織化学
- 神経膠腫組織を採取し、PBSで3回洗浄します。新鮮な組織を4%パラホルムアルデヒドに入れ、4°Cで一晩固定します。
- 固定組織をパラフィンに包埋し、厚さ10μmに切片します。切片をインキュベーター(60°C)に入れ、2時間インキュベートします。キシレン(2回)、無水アルコール、95%アルコール、90%アルコール、80%アルコール、75%アルコールでそれぞれ10分間インキュベートすることにより、切片を脱ワックスして水和させます。
- 切片を0.01 Mクエン酸ナトリウムに入れ、92〜95°Cに加熱します。 40分間温度を維持して、抗原賦活化を実現します。
- 200μLのH2O2 溶液(3%)を切片に加え、室温で10分間エンドペルオキシダーゼを不活性化する。室温で2時間3%BSAで処理することにより、非特異的部位を遮断します。
- 一次抗PD-L1抗体(モノクローナル抗体、1:100、3% BSAで希釈)中の切片を4°Cで一晩インキュベートします。
注:BSAでブロッキングした後は、PBSで洗浄しないでください。 - 切片をPBSで3回洗浄します。切片をHRP標識ヤギ抗ウサギ二次抗体(1:500、PBSで希釈)とともに室温で1時間インキュベートします。
- 細胞をPBSで3回洗浄します。200 μLの3,3-ジアミノベンジジン(DAB)ワーキング溶液(溶液A:溶液B:溶液C = 1:1:18)を切片に加え、暗所で5分間インキュベートします。
- 切片をPBSで3回洗浄します。500μLのヘマトキシリン溶液(100%)を加え、室温で5分間インキュベートします。切片を水で30秒間洗浄します。切片を分化溶液(75%アルコール:HCL = 99:1)に30秒間入れます。水で1分間切片を洗います。
- アルコール75%、アルコール80%、アルコール90%、アルコール95%、無水アルコール、キシレン(各10分)で順次インキュベートして、サンプルを脱水します。すべての切片を中性樹脂で取り付け、光学顕微鏡で観察します。
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Representative Results
[68Ga]DPA放射性標識と安定性
モデルペプチドであるDPAは、PD-L1アンタゴニストとして有効です。DOTA-DPAは、純度>95%、収率68%で得られました。DOTA-DPAの質量は1,073.3([M + 2H] 2 +)で実験的に観察されます。 68名ガリウムは、PETイメージング用のペプチドを標識するのに適した放射性核種であると考えられるため、この研究に選ばれました。DPA を 68Ga(半減期:68 分)で放射性標識するために、DOTA-PEG3-DPA を合成しました(図 1A)。DOTAは、 68Ga放射性標識のキレート剤として使用されました。DOTAとDPAの間隔を空けるために、PEG3をリンカーとして使用しました。[68Ga]-DOTA-PEG3-DPA(次のテキストでは[68Ga]DPAと呼びます)は、高い放射化学的収率(>95%)と放射化学的純度(>95%)を示しました(表1)。HPLCを用いたトレーサー安定性試験も実施し、[68Ga]DPAはPBSとマウス血清の両方で優れた安定性を有することが示されました。 68Gaの分解またはペプチド加水分解は、37°Cで4時間のインキュベート後に検出されませんでした(図1B)。
U87MG細胞におけるPD-L1の発現
以前の研究では、PD-L1の発現の増加が神経膠芽腫腫瘍における患者の生存率の低下と相関していることが示され、PD-L1が膠芽腫の顕著な予後バイオマーカーおよび治療標的である可能性があることが示されました48。そこで、ヒト膠芽腫細胞株U87MGを用いて腫瘍モデルを確立し、PD-L1腫瘍イメージングにおけるPET/CTにおける[68Ga]DPAの有効性を決定しました。フローサイトメトリーの結果から、U87MG細胞の約60%がPD-L1陽性であることが示唆されました(図2A)。さらに、免疫蛍光染色により、U87MG細胞におけるPD-L1の強い発現が確認されました(図2B)。これらのデータを総合すると、U87MG細胞株がこの研究に適していることが実証されました。
[68Ga]DPAの細胞内取り込みと特異性
U87MG細胞による[68Ga]DPAの取り込みは、時間依存的なパターンを示しました。PD-L1阻害剤であるBMS202をブロッキング剤として使用したところ、結合部分と[68Ga]DPAの取り込みが有意に減少しました(図3A)。競合的結合アッセイにより、U87MG細胞に対するBMS202の結合親和性(Ki)をさらに調べました。BMS202 の推定結合親和性は、[68Ga]DPA を競合製品として使用した場合、43.8 ± 8.6 nmol/L でした(図 3B)。
[68Ga]DPA PETによる腫瘍モデルのイメージング
[68Ga]DPAのPETイメージングは、U87MG担がんBALB/Cヌードマウスで実施されました。[68ガマ]DPAは、U87MG腫瘍が100mm3に成長するまで静脈内注射で投与されました。全身PET画像では、30分および60分の注射後に腫瘍に高い[68Ga]DPA蓄積が示され、腎臓と膀胱に最も高い蓄積が示されました(図4A)。[68Ga]DPAがPD-L1陽性腫瘍に特異的に蓄積するかどうかを確認するために、PanNET細胞株Bon-1を有する別のマウスモデルをネガティブコントロールとして使用しました。並行実験では、注射後60分でBon-1腫瘍に[68Ga]DPAがほとんど蓄積しないことが示されました(図4B)。
この違いを明らかにするために、免疫組織化学的染色を行い、腫瘍組織におけるPD-L1の発現を解析しました。その結果、U87MG細胞はPD-L1の発現が有意であったが(図5A、C)、Bon-1腫瘍は発現しなかった(図5B、C)ことが明らかになった。これらのデータはPETの結果と一致していた。したがって、異なる腫瘍細胞の増殖状態は、異なるPD-L1発現(例えば、組織壊死)をもたらした可能性がある。これを検証するために、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を実施しました。予想通り、2つの腫瘍組織間で同様の細胞形態が観察されました(図5D)。
U87MG腫瘍における[68 Ga]DPAの生体外内分布
ex vivoの生体内分布試験は、U87MG担持マウスを用いても実施された(表2)。その結果、血液と、心臓、肝臓、肺、筋肉など、ほとんどの分析された臓器の迅速なクリアランスが示されました。腎臓は最も多くの放射能を蓄積し、5分から120分まで0.12%ID/(g・min)のクリアランス率を示しました。腫瘍は、すべての時点で2番目に高いトレーサー取り込みの取り込みを示しました。さらに、注射後5分から60分後まで、腫瘍は0.027%ID/(g∙min)のより低いトレーサークリアランス率を示しました。血液のクリアランス率は0.069%ID/(g・min)であったが、筋肉のクリアランス率は0.037%ID/(g・min)であった。
図1:[68Ga]DPAの放射性標識と安定性。 (A)[68Ga]DPAの化学構造と、PD-L1を発現する腫瘍細胞への結合の模式図。(B)PBSまたはマウス血清と0.5時間、2時間、4時間インキュベートした後の[68Ga]DPAの放射能を示すHPLC曲線。この図はHu et al.47から修正されたものである。略語:DPA =ドデカペプチド拮抗薬;PD-L1 = プログラム死リガンド 1;PBS = リン酸緩衝生理食塩水;HPLC = 高速液体クロマトグラフィー。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:U87MG細胞株におけるPD-L1の発現。 (A)U87MG細胞株におけるPD-L1の発現をフローサイトメトリー解析により測定した。(B)U87MG細胞におけるPD-L1の発現を免疫蛍光染色アッセイにより測定した。スケールバー = 100 μm。この図はHu et al.47から修正されたものである。略語: PD-L1 = プログラム死リガンド 1;SSC = 側方散乱;FITC = フルオレセイン イソチオシアネート。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:細胞への取り込みと[68Ga]DPAの阻害。 (A)[68Ga]DPA(0.74 MBq/mL)または[68Ga]DPA(0.74 MBq/mL)+ BMS202(100 μmol/L)と異なる期間インキュベートした場合のU87MG細胞の取り込み。(B)BMS202とのインキュベーション後のU87MG細胞への[68Ga]DPA(0.74 MBq / mL)の競合的結合。Ki 値がパネルに表示されます。この図はHu et al.47から修正されたものである。略語:DPA =ドデカペプチド拮抗薬;%AD = 投与量(結合部分に関して)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:PD-L1過剰発現U87MG腫瘍における[68Ga]DPAのPETイメージング。 (A,B)30分および60分間の静脈内注射(~18.5 MBq)後のU87MG担持マウス(A)およびBon-1担持マウス(ネガティブコントロール、B)の[68Ga]DPAの分布を示すPET-CT画像。代表的な最大強度投影(MIP)(上パネル)と横方向PET-CT画像(下パネル)が提示されます。腫瘍の位置は白い破線の円でマークされています。この図はHu et al.47.略語:DPA =ドデカペプチド拮抗薬;PD-L1 = プログラム死リガンド 1;PET-CT = 陽電子放射断層撮影法 - コンピュータ断層撮影法;MIP = maxiumum-intensity projection;P.I. = 注射後。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:[68Ga]DPA処理腫瘍の免疫組織化学的分析。 (A,B)(A)U87MGおよび(B)Bon-1腫瘍におけるPD-L1の全切片免疫組織化学的画像。(C) A と Bのマーク部分の拡大写真。(D)U87MGおよびBon-1腫瘍のH&E染色。スケールバー = 100 μm (C,D)。この図はHu et al.47から修正されたものである。略語:DPA =ドデカペプチド拮抗薬;PD-L1 = プログラム死リガンド 1;H&E = ヘマトキシリンとエオシン。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| トレーサー | [68ガマ]DPAの |
| 放射化学収率(%) | >95 |
| モル活性(GBq μmol-1) | 8±37 |
| 放射化学的純度a (%) | >95 |
表1:[68Ga]DPAの放射性標識と品質管理。 [68Ga]DPAの放射化学的収率、モル活性、および放射化学的純度。データは平均± SD (n = 7) として表されます。この表はHu et al.47から修正したものである。略語:DPA = ドデカペプチド拮抗薬。 ある[68Ga]DPAの放射化学的純度を逆相HPLCで最適化された条件下で分析しました:1)カラム:YMC-Triat-C18(内径4.6 mm、150 mm、5 mm);2)溶媒勾配:溶媒A-脱イオン水。溶媒B-アセトニトリル(0.1%トリフルオロ酢酸);流動時間:20分、アセトニトリルで10%から90%。流速1mL/分。
| [68ガマ]DPAの | ||||||||
| 5分 | 30分 | 60分 | 120分 | |||||
| 血 | 3.89 | ±0.43 | 1.55 | ±1.07 | 0.11 | ±0.02 | 0.05 | ±0.01 |
| 心 | 1.19 | ±0.39 | 0.52 | ±0.33 | 0.06 | ±0.02 | 0.05 | ±0.02 |
| 肝臓 | 1.06 | ±0.26 | 0.59 | ±0.43 | 0.19 | ±0.02 | 0.16 | ±0.04 |
| 脾臓 | 0.98 | ±0.14 | 0.68 | ±0.67 | 0.14 | ±0.06 | 0.09 | ±0.03 |
| 肺 | 1.64 | ±0.42 | 1.03 | ±0.9 | 0.13 | ±0.05 | 0.09 | ±0.02 |
| 腎臓 | 19.23 | ±1.95 | 16.13 | ±1.51 | 11.5 | ±0.44 | 5.2 | ±0.31 |
| 胃 | 1.54 | ±0.1 | 0.61 | ±0.35 | 0.08 | ±0.01 | 0.08 | ±0.03 |
| 腸 | 0.72 | ±0.27 | 0.47 | ±0.35 | 0.08 | ±0.02 | 0.06 | ±0.03 |
| 膵臓 | 1.88 | ±0.28 | 0.77 | ±0.75 | 0.16 | ±0.03 | 0.13 | ±0.03 |
| 筋肉 | 2.21 | ±0.27 | 0.71 | ±0.37 | 0.18 | ±0.02 | 0.14 | ±0.04 |
| 骨 | 2.18 | ±0.11 | 0.85 | ±0.51 | 0.26 | ±0.09 | 0.14 | ±0.06 |
| 脳 | 0.19 | ±0.04 | 0.11 | ±0.08 | 0.03 | ±0.01 | 0.02 | ±0.01 |
| 腫瘍 | 4.5 | ±0.32 | 3.77 | ±0.27 | 2.99 | ±0.03 | 0.89 | ±0.19 |
| 脂肪 | 2.09 | ±0.49 | 0.81 | ±0.12 | 0.27 | ±0.07 | 0.1 | ±0.07 |
表2:異なる期間の投与後のU87MG担癌マウスにおける[68Ga] DPAの生体内分布 (n = 3/時点)。この表は Hu et al.47 から修正されたものです。略語:DPA = ドデカペプチド拮抗薬。
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Discussion
この方法で説明する重要なステップには、 68GaからDPAへの効率的な標識と、腫瘍内のDPAの薬力学的パターンと完全に一致するPETイメージングに適した時間枠の選択が含まれます。
IHCとは対照的に、PETイメージングは、全身のPD-L1発現を非侵襲的にリアルタイムに検出することを可能にし、不均一な腫瘍における各陽性領域の可視化を可能にします6,7。ペプチドは、抗体や低分子の欠点を回避するためにリガンドとして選択されました。分子量の大きい抗体は一般に循環半減期が長いため、健康な臓器に対する毒性が高くなります。通常、低分子のクリアランスは速すぎて必要な腫瘍保持を達成できません。ペプチドの分子量は、抗体と低分子の分子量の範囲です。これにより、ペプチドベースの放射性トレーサーは、最小限の毒性で長期的な腫瘍保持と良好な組織浸透の両方を達成することができます13,49,50,51,52,53。重要なことは、一般的に報告されているL-ペプチドではなく、D-ペプチドDPAの有用性により、[68Ga]DPAの代謝半減期が大幅に延長されることです。さらに、DPAは生体内で正電荷を帯び、親水性であるため、溶解性が高く、血液中での非特異的ターゲティングを回避できるため、高画質のPET画像の生成が容易になります。
特に、 68Gaの放射性標識を成功させるには、特定のpHが必要であり、Cu(II)やFe(III)カチオンなどの遷移金属イオンからの干渉がないことが必要です。場合によっては、Cu2+ 汚染は放射化学的収率の低下につながります。したがって、すべての容器とピペットチップが汚染されていないことを確認することが重要です。また、この方法では、腫瘍接種にU87MGを使用しました。U87MG異種移植片におけるPD-L1の発現は以前の研究で検証されていますが、その発現は個々の動物によって異なります。したがって、U87MG腫瘍におけるトレーサーの絶対取り込みは、個々のマウスによって異なっていた。腫瘍におけるトレーサーの効果的な取り込みを確実にするために、適切な腫瘍サイズ(体積500 mm3 < 100 mm3) [68Ga]DPAの限界の1つは、DPAのPD-L1への結合親和性が、WL12などの他のいくつかのPD-L1標的ペプチドと比較して比較的低いため、PD-L1発現が比較的低い腫瘍には適さないことです26,47。D-ペプチドをさらに修飾すると、その特異的結合能が向上します。さらに、[68Ga]DPAのイメージング効果を高めるために、注入戦略の定式化を最適化することができ、例えば、非特異的結合部位をブロックするために[68Ga]DPAの前に非標識DPAを同時に注入することによって、54、55、56。 結論として、本研究は、[68Ga]DPAを放射性トレーサーとして使用し、生きている動物の全身におけるPD-L1分布を追跡するための非侵襲的でリアルタイムな方法を開発しました。その結果、[68Ga]DPAは、in vivo特異的な結合親和性が比較的高く、安定性が良好で、イメージング能力に優れていることが明らかになり、[68Ga]DPA-PETがPD-L1過剰発現腫瘍を可視化するための有望なアプローチであることが示唆されました。さらに、この技術は、DPAを177Luや225Acなどの他の放射性核種で標識する場合のPD-L1陽性腫瘍の治療にも適用できます。したがって、DPA放射性標識技術は、IHC依存性診断の限界を克服するだけでなく、治療のための新しい選択肢を提供します。
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Disclosures
競合する利害関係は宣言されていません。
Acknowledgments
本研究は、中国医学院非営利中央研究所基金(no. 2022-RC350-04)およびCAMS Innovation Fund for Medical Sciences(nos. 2021-I2M-1-026, 2022-I2M-1-026-1, 02120101, 02130101, and 2022-I2M-2-002)の支援を受けて行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) | Merck | 60239-18-1 | 68Ga chelation |
| 3,3-diaminobenzidine (DAB) Kit | Sigma-Aldrich | D7304-1SET | Immunohistochemistry |
| anti-PD-L1 monoclonal antibody | Wuhan Proteintech | 17952-1-ap | Immunohistochemistry: primary antibody |
| BMS202 | Selleck | 1675203-84-5 | Competitive binding assay: inhibitor |
| BSA | Merck | V900933 | Immunofluorescent : blocking |
| DAPI | Merck | D9542 | Immunofluorescent: staining of nucleus |
| Dichloromethane (DCM) | Merck | 34856 | Solvent |
| DIPEA | Merck | 3439 | Peptide coupling |
| EDC·HCl | Merck | E6383 | Activation of DOTA |
| FBS | Gibco | 10099 | Cell culture: supplement |
| FITC-conjugated anti-human IgG Fc Antibody | Biolegend | 409310 | Immunofluorescent: secondary antibody |
| FITC-conjugated anti PD-L1 antibody | Biolegend | 393606 | Flow cytometry: direct antibody |
| HCTU | Energy Chemical | E070004-25g | Peptide coupling |
| HRP labeled goat anti-rabbit antibody | Servicebio | GB23303 | Immunohistochemistry: secondary antibody |
| Hydroxysuccinimide (NHS) | Merck | 130672 | Activation of DOTA |
| MeCN | Merck | PHR1551 | Solvent |
| Morpholine | Merck | 8.06127 | Fmoc- deprotection |
| NMP | Merck | 8.06072 | Solevent |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Fixation of tissues |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture: buffer |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 10378016 | Cell culture: supplement |
| RIA tube | PolyLab | P10301A | As tissue sample container |
| RPMI-1640 medium | Gibco | 11875093 | Cell culture: basic medium |
| Sodium acetate | Merck | 1.06264 | Salt for buffer |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Cell culture: dissociation agent |
| U87MG cell line | Procell Life Science & Technology Co | CL-0238 | Cell model |
| Equipment | |||
| 68Ge/68Ga generator | Isotope Technologies Munich, ITM | Not applicable | Generation of [68Ga] |
| Autogamma counter | Perkin Elmer | Wizard2 | Detection of radioactivity |
| Confocal fluorescent microscopy | Keyence | Observation of immunofluorescent results | |
| Flow cytometer | Becton Dickinson, BD | LSRII | Monitoring the PD-L1 positive cells |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | SHIMAZU | LC-20AT | Purification of DPA peptide |
| PET scanner | Siemens Medical Solutions | Inveon MultiModality System | PET imaging |
| Optical microscopy | Nikon | Eclipse E100 | Observation of immunohistochemistry results |
| Solid phase peptide synthesizer | Promega Vac-Man Laboratory Vacuum Manifold | LOT#11101 | Synthesis of DPA-DOTA peptide |
| Software | |||
| ASIPro | Siemens Medical Solutions | Not applicable | Analysis of PET-CT results |
| FlowJo | Becton Dickinson, BD | FlowJo 7.6.1 | Analysis of the flow cytometer results |
| Inveon Acquisition Workplace (IAW) | Siemens Medical Solutions | Not applicable | Management of PET mechine |
| Prism | Graphpad | Prism 8.0 | Analysis of the data |
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