Summary
Denna studie utvecklade en icke-invasiv metod i realtid för att utvärdera fördelningen av programmerad dödsligand 1 i hela kroppen, baserat på positronemissionstomografisk avbildning av [68Ga] D-dodekapeptidantagonist. Denna teknik har fördelar jämfört med konventionell immunhistokemi och förbättrar effektiviteten när det gäller att identifiera lämpliga patienter som kommer att dra nytta av immuncheckpointblockadbehandling.
Abstract
Utvecklingen av immuncheckpoint-blockadterapi baserad på programmerat celldödsprotein 1 (PD-1)/programmerad dödsligand 1 (PD-L1) har revolutionerat cancerterapier de senaste åren. Endast en bråkdel av patienterna svarar dock på PD-1/PD-L1-hämmare, på grund av det heterogena uttrycket av PD-L1 i tumörceller. Denna heterogenitet utgör en utmaning när det gäller exakt detektion av tumörceller med den vanliga immunhistokemimetoden (IHC). Denna situation kräver bättre metoder för att stratifiera patienter som kommer att dra nytta av immuncheckpoint-blockadbehandling, för att förbättra behandlingseffekten. Positronemissionstomografi (PET) möjliggör realtidsvisualisering av hela kroppens PD-L1-uttryck på ett icke-invasivt sätt. Därför finns det ett behov av utveckling av radioaktivt märkta spårämnen för att detektera PD-L1-distribution i tumörer genom PET-avbildning.
Jämfört med sina L-motsvarigheter har dextrorotolära (D)-peptider egenskaper som proteolytisk resistens och anmärkningsvärt förlängda metaboliska halveringstider. Denna studie utformade en ny metod för att detektera PD-L1-uttryck baserat på PET-avbildning av 68Ga-märkt PD-L1-riktad D-peptid, en D-dodekapeptidantagonist (DPA), i tumörbärande möss. Resultaten visade att [68Ga]DPA specifikt kan binda till PD-L1-överuttryckande tumörer in vivo, och visade gynnsam stabilitet samt utmärkt avbildningsförmåga, vilket tyder på att [68Ga]DPA-PET är ett lovande tillvägagångssätt för bedömning av PD-L1-status i tumörer.
Introduction
Upptäckten av immuncheckpointproteiner var ett genombrott inom tumörterapi, och har lett till stora framsteg i utvecklingen av immuncheckpointblockadterapi1. Programmerat celldödsprotein 1 (PD-1) och programmerad dödsligand 1 (PD-L1) är potentiella läkemedelsmål med flera antikroppar godkända av Food and Drug Administration (FDA). PD-1 uttrycks av tumörinfiltrerande immunceller, såsom CD4+, CD8+ T-celler och regulatoriska T-celler. PD-L1 är en av PD-1-liganderna, som överuttrycks i en mängd olika tumörceller 2,3. Interaktionen mellan PD-1 och PD-L1 inaktiverar PD-1 och undertrycker därmed antitumörimmunsvaret4. Dessa fynd tyder på att hämning av PD-L1 kan förbättra den dödande effekten av immunceller och eliminera tumörceller5. För närvarande är kromogen immunhistokemi (IHC) den vanligaste metoden för att identifiera patienter som är mest benägna att svara på immuncheckpointterapi 6,7. Men på grund av det heterogena uttrycket av PD-L1 i tumörceller kan IHC-resultat från biopsier inte ge korrekt information om PD-L1-uttryck hos patienter8. Tidigare studier har rapporterat att endast 20%-40% av patienterna får långsiktiga fördelar av immuncheckpointblockadterapi 1,9,10. Det finns därför ett akut behov av att utveckla en ny metod för att kringgå de falskt negativa resultat som orsakas av det heterogena uttrycket av dessa immuncheckpointproteiner.
Molekylär avbildningsteknik, såsom positronemissionstomografi (PET), möjliggör visualisering av hela kroppen i realtid på ett icke-invasivt sätt, och kan därmed överträffa den konventionella IHC-metoden 11,12,13. Radiomärkta antikroppar, peptider och små molekyler är lovande spårämnen för övervakning av PD-L1-uttryck hos cancerpatienter 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . FDA har godkänt tre PD-L1-terapeutiska monoklonala antikroppar: avelumab, atezolizumab och durvalumab26. Immuno-PET-spårämnen baserade på dessa antikroppar är väldokumenterade 27,28,29,30,31,32. Kliniska prövningar i tidig fas har visat begränsat värde för klinisk tillämpning på grund av den ogynnsamma farmakokinetiken30. Jämfört med antikroppar uppvisar peptider snabbare blod- och organclearance från friska organ och kan lätt modifieras kemiskt33. Flera peptider med hög affinitet för PD-1/PD-L1 har rapporterats2; WL12 är en rapporterad peptid som visar specifik bindning till PD-L134. Radiomärkta spårämnen, [64Cu]WL12, [68Ga]WL12 och [18F]FPyWL12, har rapporterats uppvisa hög in vivo-specifik tumörmålsökande förmåga, vilket möjliggör skörd av högkvalitativa bilder av PD-L1-uttryck i tumörer 26,35,36,37. Dessutom har den första utvärderingen av radioaktivt märkt WL12 i människa visat att [68Ga]WL12 (kelaterad av NOTA) har en säker och effektiv potential för klinisk tumöravbildning38. På grund av dess höga hydrofobicitet och höga upptag i den friska levern har WL12 begränsad klinisk användning. Andra radioaktivt märkande peptider, såsom TPP1 och SETSKSF, som specifikt binder till PD-L1, har också visat potentiell stabilitet och specificitet för att visualisera helkropps PD-L1-uttryck39,40. Omodifierade peptider bryts dock lätt ned av proteaser och metaboliseras snabbt av njurarna. Dextrorotära(D)-peptider har använts i stor utsträckning som effektiva mediatorer, på grund av den dåliga stabiliteten hos vänsterhänta (L)-peptider 41,42,43. D-peptider är hyperresistenta mot proteolytisk nedbrytning och har anmärkningsvärt förlängda metaboliska halveringstider. Jämfört med sina L-motsvarigheter visar D-peptider mestadels specifika bindningsförmågor 44,45,46.
Denna studie utformade en ny metod för att detektera PD-L1-uttryck, baserad på PET-avbildning av en 68Ga-märkt PD-L1-riktad D-peptid, D-dodekapeptidantagonist (DPA), i en tumörbärande musmodell47. Stabiliteten hos [68Ga]DPA studerades först i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och musserum, varefter bindningsaffiniteten för [68Ga]DPA i PD-L1-överuttryckande tumörer testades. Därefter utfördes PET-avbildning i glioblastom-xenograftmodeller för att bekräfta om [68Ga]DPA var ett idealiskt PET-spårämne för att övervaka PD-L1-uttryck i tumörer. Kombinationen av PET-avbildning och DPA ger inte bara ett nytt tillvägagångssätt för att övervinna utmaningar i samband med det heterogena uttrycket av PD-L1, utan lägger också grunden för utvecklingen av D-peptidbaserade radiospårämnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De djurexperimentella procedurerna godkändes av djuretikkommittén vid Nanjing Medical University eller National Institutes of Quantum Science and Technology. Mössförsöken utfördes strikt i enlighet med de institutionella riktlinjerna från kommittén för vård och användning av försöksdjur.
1. Syntes av peptider
- Sväll 100 mg 4-metylbenshydrylamin (MBHA) harts (belastningskapacitet på 0,37 mmol/g) i 1 ml N-metyl-2-pyrrolidon (NMP) i 30 minuter under mildN2-bubbla.
- Bered en färsk stambuffert bestående av Fmoc-skyddade aminosyror (5,0 ekv), HCTU (4,9 ekviv) och DIPEA (10,0 ekvivalenter) i 1 ml NMP och tillsätt till hartset (100 mg). Låt kopplingsreaktionen pågå i 1.5-2 timmar.
- Bered skyddsbuffert bestående av 50 % (vol/vol) morfolin i NMP. Tvätta hartset (100 mg) 2 x 30 min med 1 ml avskyddsbuffert i varje tvätt för att ta bort Fmoc-gruppen på amingruppen. Tvätta hartset med diklormetan (DCM; 1 ml) i 1 minut, ta bort DCM och tvätta hartset med NMP (1 ml) i ytterligare 1 minut. Ta sedan bort NMP och tvätta hartset med DCM i 1 min.
OBS: Alla tvättprocedurer utförs under mildN2-bubbla . Ovanstående procedurer upprepas tills den sista aminosyran. - För tillsats av 1,4,7,10-tetraazacykloddodekan-1,4,7,10-tetraättiksyra (DOTA) till peptiden, föraktivera DOTA med N-(3-dimetylaminopropyl)-N-etylkarbodiimidhydroklorid (EDC· HCl) och N-hydroxisuccinimid (NHS). Inkubera lagerbufferten för DOTA/EDC· HCl/NHS vid ett molförhållande på 1:1:1 i dimetylsulfoxid (DMSO) i 3 timmar, med en slutlig DOTA-koncentration på 1 M. Tillsätt sedan stambufferten (1 ml) till hartset (100 mg) och låt reaktionen fortsätta i 2 timmar med försiktigN2-bubbla.
OBS: 1,4,7-triazacyklononan-1,4,7-triättiksyra (NOTA) kan också användas som kelator för 68Ga-komplexbildning. Samma procedurer kan användas för NOTA-koppling. - Skölj hartset noggrant uppifrån med DCM och applicera ett vakuum för att avlägsna kvarvarande reaktionslösning samtidigt. Skölj hartset 3 gånger med DCM (1,5 ml) och skölj sedan med MeOH (1,5 ml) för att krympa hartset. Lägg hartset under kväve över natten, eller under högt vakuum i minst 4 timmar, tills hartset blir torrt.
- Placera det torkade DPA-peptidinnehållande hartset i en 2 ml polypropenbehållare med skruvlock. Tillsätt lämplig klyvningscocktail (95/2,5/2,5 TFA/TIS/H2O i volym; 1 ml/100 mg harts) och förslut behållaren ordentligt med ett skruvlock. Skaka försiktigt om reaktionen på en orbitalskakare i ett dragskåp vid 20-25 °C i 2 timmar.
VARNING: Förbered trifluorättiksyra (TFA) i ett dragskåp med skyddskläder på grund av dess mycket frätande natur. - Ta bort det mesta av TFA genom avdunstning under kväve i dragskåpet. Fäll ut peptiderna genom att tillsätta dietyleter (~1,5 ml/100 mg harts).
- Virvla blandningen för att triturera peptiderna och centrifugera vid rumstemperatur (10 000 × g, 5 min). Häll försiktigt ut lösningsmedlet ur behållaren. Upprepa steg 1.7-1.8.
- Lufttorka återstoden i den öppna behållaren i 10 minuter. Tillsätt 50 % (vol/vol) vattenhaltig acetonitril och virvla i 1-2 s för att lösa upp produkterna (1 ml/100 mg harts).
- Ta bort hartset genom att filtrera blandningen och tvätta sedan hartset 2x med 0,2 ml 50 % (vol/vol) vattenhaltig acetonitril. Blanda filtraten för högpresterande vätskekromatografi (HPLC). Använd följande HPLC-villkor. Kolonn: YMC-Triat-C18 (4,6 mm innerdiameter [i.d.], 150 mm, 5 mm); lösningsmedelsgradient: lösningsmedel A-avjoniserat vatten; lösningsmedel B-acetonitril (0,1 % TFA); flödestid: 20 min, med acetonitril från 10% till 90%; Flödeshastighet: 1 ml/min.
- Frys de uppsamlade HPLC-eluenterna över natten vid -80 °C och frys torkat (-50 °C och <1 pa). För radioaktiv märkning, lös upp den fasta peptiden i natriumacetatbuffert (100 mM, pH 5,0) vid en slutlig koncentration av 1 mg/ml som stambuffert.
2. 68Ga radioaktiv märkning
NOTE 68Ga genererades internt på Nanjing First Hospital (Nanjing, Kina) med hjälp av en 68Ge/68Ga-generator.
- Pipettera över 5 μL stambuffert till en 1,5 ml polypropenbehållare med skruvlock. Tillsätt 200 MBq [68Ga]GaCl3 (400 μL) i behållaren.
- Virvla blandningen i 5 s. Mät pH-värdet med pH-teststickor. Justera pH till 4-4,5 med NaOH (0,1 M).
OBS: Ett lämpligt pH är avgörande för komplexbildning mellan 68Ga och DOTA. - Inkubera lösningen i rumstemperatur i 5-10 min. Utsätt reaktionsblandningen för radio-HPLC för analys av radioaktivt märkning av utbytet under följande förhållanden: kolonn: YMC-Triat-C18 (4,6 mm i.d., 150 mm, 5 mm); lösningsmedelsgradient: lösningsmedel A-avjoniserat vatten; lösningsmedel B-acetonitril (0,1 % TFA); flödestid: 20 min, med acetonitril från 10% till 90%; Flödeshastighet: 1 ml/min.
OBS: Radiotunnskiktskromatografi (TLC) kan användas som ett alternativt tillvägagångssätt för att undersöka radioaktivt märkningsutbyte. Den föreslagna TLC-elueringsbufferten är 0,1 M Na3C6H5O7, pH 4.
3. Stabilitetstest för spårämne
- Stabilitetstest för spårämne i PBS
- Tillsätt [68Ga] DPA (10 μL, 3,7 MBq, i NaOAc) till PBS (990 μL). Inkubera vid 37 °C i 1, 2 och 4 timmar under lätt omrörning.
- Samla upp 200 μl av lösningen vid varje tidpunkt. Injicera den i radio-HPLC för analys.
- Spårämnesstabilitet i musserum
- Tillsätt [68Ga]DPA (10 μL, ~3,7 MBq, i NaOAc) till musserumet (90 μL, nyberedt). Inkubera vid 37 °C i 1, 2 och 4 timmar under lätt omrörning.
- Samla upp 20 μL av lösningen vid varje tidpunkt. Tillsätt MeCN och vatten (100 μL, 1:1, v/v).
- Centrifugera blandningen i 10 minuter (5 000 × g, 25 °C). Analysera supernatanten med hjälp av radio-HPLC.
4. Analys av PD-L1-uttryck med flödescytometri
- Bered odlingsmedium genom att komplettera RPMI-1640-mediet med 10 % (vol/vol) fetalt bovint serum och 1 % penicillin-streptomycin (vol/vol). Återsuspendera U87MG-cellerna i odlingsmedium och frö i 12-brunnars plattor med en densitet av 105 celler/brunn. Placera cellerna i en inkubator (5 % CO2 37 °C) och odla i minst 24 timmar utan att störa.
- Tvätta cellerna med 0,5 ml PBS och tillsätt 250 μl trypsin-EDTA (0,25 %). Sätt tillbaka cellerna i inkubatorn (5 % CO2, 37 ° C) i 2 min.
- Tillsätt 1 ml odlingsmedium för att stoppa celldissociationen. Tillsätt medium till cellerna för att lossa dem från skålen genom att pipettera upp och ner och samla upp dem i 1,5 ml rör. Centrifugera cellerna i 5 minuter (100 × g).
- Ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 1 ml PBS. Centrifugera cellerna i 5 minuter (100 × g). Upprepa detta steg en gång till.
- Späd fluoresceinisotiocyanatet (FITC)-konjugerade PD-L1-antikroppen med 3 % bovint serumalbumin (BSA) till 20 nmol/l. Tillsätt till cellerna och inkubera vid 4 °C i 1 timme.
- Centrifugera cellerna i 5 minuter (100 × g), följt av tvätt med kall PBS två gånger. Analysera de PD-L1-positiva cellerna med hjälp av en flödescytometer och analysprogramvara.
5. Immunocytokemi
- Sådd av U87MG-cellerna i glasbottencellodlingsskålar (35 mm) med en densitet av 2,5 × 105 celler per brunn. När 60 % sammanflöde har uppnåtts, aspirera odlingsmediet och tillsätt 1 ml PBS. Skaka försiktigt flera gånger och aspirera. Utför tvättsteget 3 gånger.
- Tillsätt 500 μL 4 % paraformaldehyd till rätterna. Placera cellerna i rumstemperatur och fixera i 30 min.
- Tvätta cellerna 3 gånger med PBS. Tillsätt 1 ml 3 % BSA (vikt/volym, i PBS) och blockera de fasta cellerna i 2 timmar vid rumstemperatur.
- Ta bort 3 % BSA och inkubera cellerna direkt med primär anti-PD-L1-antikropp (mAb,1:100, utspädd i 3 % BSA) över natten vid 4 °C.
OBS: Efter att ha blockerat cellerna med BSA, tvätta inte med PBS. - Tvätta cellerna 3 gånger med 3 % BSA-buffert. Inkubera cellerna med FITC-konjugerad anti-human IgG Fc sekundär antikropp (1:500, utspädd i PBS) i 1 timme.
- Tvätta cellerna 3 gånger med PBS. Tillsätt 0,5 ml DAPI (1 μg/ml) till cellerna och inkubera i rumstemperatur i 1 timme. Tvätta de färgade cellerna 3x med PBS och observera med konfokalfluorescensmikroskop.
6. Cellulärt upptag och hämningsexperiment
- Experiment med mobilt upptag
- Odla U87MG-cellerna i 12-brunnars plattor tills 80 % sammanflöde uppnås. Ta bort mediet och tvätta cellerna med 0,5 ml PBS.
- Späd [68Ga]DPA i färskt medium till en koncentration av 74 KBq/ml. Tillsätt 0,5 ml av den utspädda [68Ga] DPA-bufferten till varje brunn.
- Inkubera cellerna med [68Ga]DPA vid 37 °C under olika varaktighet (10, 30, 40 och 120 min). Aspirera mediet med hjälp av en pipett. Tvätta cellerna med PBS (0.5 ml) tre gånger.
- Tillsätt NaOH-lösning (0,5 M, 300 μL per brunn) för att lysera cellerna. Efter 30 s samlar du upp de viskösa celllysaten i 1,5 ml rör.
- Tvätta plattan med 0.4 ml PBS två gånger. Samla upp tvättlösningen i ovanstående 1.5 ml rör.
- Starta den inbyggda datorn för den automatiska gammaräknaren; Sätt rören i den inbyggda hyllan. Efter att ha laddat alla samples på transportören, tryck på START-knappen. Resultaten beräknas i den interna programvaran. Avläsningen registrerar det sönderfallskorrelerade antalet per minut (CPM) för varje rör.
- Konkurrenskraftig bindande analys
- Odla U87MG-cellerna i 12-brunnars plattor tills 80 % sammanflöde uppnås. Ta bort mediet och tvätta cellerna med 0,5 ml PBS.
- Späd [68Ga]DPA i färskt medium till en koncentration av 74 KBq/ml. Lös upp en lämplig mängd BMS202-föreningar i 10 % DMSO för att ge en koncentration på 10 mM (400 μL).
- Späd 4 μL 10 mM BMS202 i 396 μL PBS för att erhålla en koncentration på 100 μM. Upprepa detta steg för att ge olika koncentrationer av BMS202 (1 μM, 10 nM, 100 pM och 1 pM).
- Tillsätt 0,5 ml av den utspädda [68Ga] DPA-bufferten till varje brunn (0,37 MBq per brunn). Tillsätt 5 μL av BMS202-lösningarna till varje brunn (tre brunnar för varje koncentration). Inkubera cellerna i en cellinkubator vid 37 °C i 120 minuter.
- Aspirera mediet med hjälp av en pipett. Tvätta cellerna med 3 x 0,5 ml PBS.
- Tillsätt NaOH-lösningen (0,5 M, 300 μL per brunn) för att lysera cellerna. Efter 30 sekunder samlar du upp de viskösa celllysaten i 1,5 ml rör. Tvätta plattan med 2 x 0.4 ml PBS.
- Samla upp tvättlösningen i ovanstående 1.5 ml rör. Sätt rören i den inbyggda hyllan på den automatiska gammaräknaren.
- Följ samma procedurer som steg 6.1.6.
7. PET-avbildning
OBS: Utför PET-avbildning av små djur med hjälp av en mikro-PET-skanner som ger 159 tvärgående axiella sektioner med ett avstånd på 0.796 mm från varandra (mitt-till-mitt), med ett horisontellt synfält på 10 cm och ett axiellt synfält på 12.7 cm. Alla data som samlas in i listläget är organiserade i tredimensionella sinogram. Fouriern sätts sedan ihop till tvådimensionella sinogram (ram × min: 4 × 1, 8 × 2, 8 × 5).
- Använd hanar, 5-8 veckor gamla BALB/C nakna möss i denna studie. Samla in U87MG-cellerna enligt steg 4.1-4.4 och aspirera cellerna i en 0,5 ml spruta. Subkutant injicera cellerna i mössen (1 × 106 celler per tumör, två tumörer per mus). Övervaka tumörtillväxten efter injektion tills tumörvolymen är 100-300 mm3.
- Bedöva mössen med 1%-2% (v/v) isofluran (1 ml/min). Slå på värmeanordningen och håll djurbädden av PET vid 37 °C.
- Placera de sövda mössen i rätt position på PET-maskinens djurbädd. Applicera ögonsalva i båda ögonen för att förhindra torrhet.
VARNING: Håll mössen i bukläge för att undvika dödsfall under skanningen. Under hela avbildningsprocessen, administrera isofluranflöde (1,0 ml/min) via näsan med hjälp av en förinstallerad slang. - Justera djurbäddens position via kontrollpanelen. Injicera spårämnena (10-17 MBq/100-200 μL) intravenöst genom en förinstallerad svansvenskateter.
- Skapa ett skanningsarbetsflöde i en värddator med hjälp av den refererade programvaran (se Materialförteckning) Skapa en studiemapp och ställ in förvärvsprotokollet enligt tillverkarens protokoll. Utför dynamiska skanningar (60 min för varje mus) på alla möss i 3D-listläge.
- Definiera ett histogramprotokoll och ett rekonstruktionsprotokoll enligt tillverkarens protokoll. Använd Hannings filter med en Nyquist-cutoff på 0,5 cykel/pixel för att rekonstruera dynamiska PET-bilder (25-30 min och 55-60 min) genom filtrerad bakprojektion. Generera MIP-bilder (Maximum Intensity Projection) för alla möss.
- Kombinera protokollen i ett arbetsflöde och kör arbetsflödet. Analysera de resulterande tredimensionella bilderna med hjälp av programvaran, enligt tillverkarens protokoll.
OBS: Använd simuleringsprogrammet för att välja de volymer som är av intresse. Radioaktiviteten sönderfallskorrigeras till injektionstidpunkten och presenteras som den procentuella andelen av den totala injektionsdosen/per gram vävnad (% ID/g).
8. Biodistribution ex vivo
- Administrera [68Ga]DPA (1,85 MBq/100 μL) till de U87MG-bärande nakna BALB/C-mössen genom injektion av svansvenen. Bedöva mössen med 1%-2% (v/v) isofluran (1 ml/min) och offra sedan tre möss via cervikal luxation efter injektion i 5, 30, 60 och 120 minuter.
OBS: De personer som demonstrerar denna procedur bör utbildas i de tekniska färdigheterna för cervikal luxation för att säkerställa att medvetslösheten snabbt induceras. Detta kommer att säkerställa att alla eutanasiprocedurer i detta experiment utförs på ett humant sätt. - När döden har bekräftats öppnar du mössens bröstvägg. Öppna sedan hjärtat. Använd en 1 ml spruta för att dra blod; pressa ut blodet från sprutan i ett radioimmunoassay (RIA) rör (13 mm i diameter) för gammaräknaren.
- Punktisera de viktigaste organen och tumörerna och placera dem i RIA-rör (13 mm i diameter) för gammaräknaren. Viktiga organ inkluderar det totala blodet, hjärtat, brässen, levern, mjälten, benet, magen, njurarna, musklerna, tarmlymfkörtlarna, tunntarmen, bukspottkörteln, testiklarna, hjärnan och lungorna. Väg alla organ.
- Mät radioaktiviteten i de insamlade organen med hjälp av en autogammaräknare och sönderfallskorrigera värdena. Beräkna den procentuella andelen injicerad dos per gram våt vävnad (% ID/g).
9. Immunhistokemi
- Samla ihop gliomvävnaderna och tvätta dem 3 gånger med PBS. Lägg de färska servetterna i 4 % paraformaldehyd och fixera över natten vid 4 °C.
- Bädda in de fixerade vävnaderna i paraffin och dela dem till en tjocklek av 10 μm. Placera sektionerna i en inkubator (60 °C) och inkubera i 2 timmar. Avvaxa och hydrera sektionerna genom att inkubera i 10 minuter vardera i följande: xylen (två gånger), absolut alkohol, 95 % alkohol, 90 % alkohol, 80 % alkohol, 75 % alkohol.
- Lägg sektionerna i 0,01 M natriumcitrat och värm dem till 92-95 °C. Håll temperaturen i 40 minuter för att uppnå antigenhämtning.
- Tillsätt 200 μl H2O2 lösning (3 %) till snitten och inaktivera endoperoxidaserna i 10 minuter vid rumstemperatur. Blockera de icke-specifika ställena genom behandling med 3 % BSA i 2 timmar vid rumstemperatur.
- Inkubera snitten i primär anti-PD-L1-antikropp (mAb, 1:100, utspädd i 3 % BSA) över natten vid 4 °C.
OBS: Efter blockering med BSA, tvätta inte med PBS. - Tvätta sektionerna 3 gånger med PBS. Inkubera sektionerna med HRP-märkt getantikanin sekundär antikropp (1:500, utspädd i PBS) vid rumstemperatur i 1 timme.
- Tvätta cellerna 3 gånger med PBS. Tillsätt 200 μl 3,3-diaminobensidin (DAB) arbetslösning (lösning A: lösning B: lösning C = 1:1:18) till snitten och inkubera i 5 minuter i mörker.
- Tvätta sektionerna 3 gånger med PBS. Tillsätt 500 μL hematoxylinlösning (100%) och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur. Tvätta sektionerna med vatten i 30 s. Lägg sektionerna i differentieringslösning (75 % alkohol: HCL = 99:1) i 30 s. Tvätta sektionerna med vatten i 1 min.
- Torka proverna genom sekventiell inkubation med 75 % alkohol, 80 % alkohol, 90 % alkohol, 95 % alkohol, absolut alkohol och xylen (två gånger) (10 minuter vardera). Montera alla sektioner med neutralt harts och observera dem under ett optiskt mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
[68Ga]DPA radiomärkning och stabilitet
Modellpeptiden, DPA, är en effektiv PD-L1-antagonist. DOTA-DPA erhölls med >95 % renhet och ett utbyte på 68 %. Massan av DOTA-DPA observeras experimentellt vid 1 073,3 ([M+2H]2+). 68Gallium anses vara en lämplig radionuklid för att märka peptider för PET-avbildning, och valdes därför för denna studie. För radiomärkning av DPA med 68Ga (halveringstid: 68 min) syntetiserades DOTA-PEG3-DPA (figur 1A). DOTA användes som kelator för radiomärkning av 68Ga. För att skapa utrymme för DOTA och DPA användes PEG3 som länkare. [68Ga]-DOTA-PEG3-DPA (benämnd [68Ga]DPA i följande text) uppvisade ett högt radiokemiskt utbyte (>95 %) och radiokemisk renhet (>95 %) (tabell 1). Ett spårämnesstabilitetstest utfördes också med HPLC, och resultaten visade att [68Ga]DPA hade stor stabilitet både i PBS och musserum. Nedbrytningen av 68Ga eller peptidhydrolys detekterades inte efter en 4 timmars inkubation vid 37 °C (figur 1B).
Uttryck av PD-L1 i U87MG-celler
En tidigare studie visade att ett ökat uttryck av PD-L1 korrelerade med dålig patientöverlevnad i glioblastomtumörer, vilket indikerar att PD-L1 kan vara en anmärkningsvärd prognostisk biomarkör och terapeutiskt mål vid glioblastom48. Därför användes en human glioblastomcellinje, U87MG, för att etablera en tumörmodell för att bestämma effekten av [68Ga] DPA i PET/CT för PD-L1 tumöravbildning. Flödescytometriresultaten tydde på att cirka 60 % av U87MG-cellerna var PD-L1-positiva (Figur 2A). Dessutom bekräftade immunofluorescensfärgning det starka uttrycket av PD-L1 i U87MG-cellerna (Figur 2B). Sammantaget visade dessa data att U87MG-cellinjen var lämplig för denna studie.
Cellulärt upptag och specificitet för [68Ga] DPA
Upptaget av [68Ga] DPA av U87MG-celler uppvisade ett tidsberoende mönster. När en PD-L1-hämmare, BMS202, användes som blockerande medel minskade bindningsdelen och upptaget av [68Ga] DPA signifikant (Figur 3A). En kompetitiv bindningsanalys undersökte vidare bindningsaffiniteten (Ki) för BMS202 till U87MG-cellerna. Den uppskattade bindningsaffiniteten var 43,8 ± 8,6 nmol/L för BMS202 när [68Ga]DPA användes som konkurrent (figur 3B).
[68Ga]DPA PET-avbildning av tumörmodeller
PET-avbildning av [68Ga] DPA utfördes på U87MG tumörbärande BALB/C nakna möss. [68Ga] DPA administrerades genom intravenös injektion tills tumören U87MG växte till 100mm3. Helkropps-PET-bilder visade hög [68Ga] DPA-ackumulering i tumören efter 30 och 60 minuters injektion och visade den högsta ackumuleringen i njure och urinblåsa (Figur 4A). För att bekräfta om [68Ga]DPA specifikt ackumulerades i PD-L1-positiva tumörer användes en annan musmodell med PanNET-cellinjen Bon-1 som negativ kontroll. Ett parallellt experiment visade liten [68Ga] DPA-ackumulering i Bon-1-tumörer 60 minuter efter injektion (Figur 4B).
För att klargöra denna skillnad genomfördes immunhistokemisk färgning för att analysera PD-L1-uttryck i tumörvävnader. Resultaten visade att U87MG-cellerna uppvisade ett betydande PD-L1-uttryck (Figur 5A,C), men inte Bon-1-tumören (Figur 5B,C). Dessa data överensstämde med PET-resultaten. Därför är det möjligt att de olika tumörcellernas tillväxtstatus resulterade i olika PD-L1-uttryck (t.ex. vävnadsnekros). För att verifiera detta utfördes färgning av hematoxylin och eosin (H&E). Som förväntat observerades en liknande cellmorfologi mellan de två tumörvävnaderna (Figur 5D).
Ex vivo biodistribution av [68Ga] DPA i U87MG-tumörer
Ex vivo-studien av biodistribution utfördes också på möss med U87MG (tabell 2). Resultaten visade en snabb eliminering i blodet och de flesta analyserade organ, inklusive hjärta, lever, lunga och muskler. Njuren ackumulerade den högsta mängden radioaktivitet och uppvisade en clearancefrekvens på 0,12 % ID/(g∙min) från 5 min till 120 min. Tumören uppvisade det näst högsta spårämnesupptaget vid alla tidpunkter. Dessutom, från 5 minuter till 60 minuter efter injektionen, uppvisade tumören en lägre spårämnesclearance på 0,027 % ID/(g∙min). För blod var clearancefrekvensen 0,069 % ID/(g∙min), medan clearance för muskler var 0,037 % ID/(g∙min).
Figur 1: [68Ga]DPA radiomärkning och stabilitet. (A) Den kemiska strukturen hos [68Ga] DPA och den schematiska representationen av dess bindning till PD-L1-uttryckande tumörceller. B) HPLC-kurvor som visar radioaktiviteten hos [68Ga]DPA efter inkubation med PBS eller musserum i 0,5, 2 och 4 timmar. Denna siffra har modifierats från Hu et al.47. Förkortningar: DPA = dodekapeptidantagonist; PD-L1 = programmerad dödsligand 1; PBS = fosfatbuffrad koksaltlösning, HPLC = vätskekromatografi med hög prestanda. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Uttryck av PD-L1 i U87MG-cellinjen. (A) Uttrycket av PD-L1 i U87MG-cellinjen mättes genom flödescytometrianalys. (B) Uttrycket av PD-L1 i U87MG-celler mättes med immunofluorescensfärgningsanalys. Skalstapel = 100 μm. Denna siffra har modifierats från Hu et al.47. Förkortningar: PD-L1 = programmerad dödsligand 1; SSC = sidospridning; FITC = fluoresceinisotiocyanat. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Cellulärt upptag och hämning av [68Ga] DPA. A) Upptaget av U87MG-celler vid inkubation med [68Ga]DPA (0,74 MBq/ml) eller [68Ga] DPA (0,74 MBq /ml) + BMS202 (100 μmol/l) under olika varaktighet. (B) Kompetitiv bindning av [68Ga]DPA (0,74 MBq /ml) till U87MG-cellerna efter inkubation med BMS202. Ki-värdet visas i panelen. Denna siffra har modifierats från Hu et al.47. Förkortningar: DPA = dodekapeptidantagonist; %AD = administrerad dos (med avseende på bindningsdelen). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: PET-avbildning av [68Ga]DPA i PD-L1-överuttryckande U87MG-tumörer. (A,B) PET-CT-bilder som visar fördelningen av [68Ga]DPA i U87MG-bärande möss (A) och Bon-1-bärande möss (negativ kontroll, B) efter intravenös injektion (~18,5 MBq) i 30 minuter och 60 minuter. Representativ maxintensitetsprojektion (MIP) (övre panelen) och tvärgående PET-CT-bilder (nedre panelen) presenteras. Tumörpositionerna är markerade med vita streckade cirklar. Denna siffra har modifierats från Hu et al.47. Förkortningar: DPA = dodekapeptidantagonist; PD-L1 = programmerad dödsligand 1; PET-CT = positronemissionstomografi-datortomografi; MIP = prognos för maximal intensitet, P.I. = efter injektion. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Immunhistokemisk analys av [68Ga] DPA-behandlade tumörer. (A,B) Immunhistokemiska helsnittsbilder av PD-L1 i (A) U87MG och (B) Bon-1 tumörer. (C) Förstorade bilder av de markerade områdena i A och B. (D) H&E-färgning av U87MG och Bon-1 tumör. Skalstaplar = 100 μm (C,D). Denna siffra har modifierats från Hu et al.47. Förkortningar: DPA = dodekapeptidantagonist; PD-L1 = programmerad dödsligand 1; H&E = hematoxylin och eosin. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Spårämnen | [68Ga] DPA |
| Radiokemiskt utbyte (%) | >95 |
| Molär aktivitet (GBq μmol-1) | 37 ± 8 |
| Radiokemisk renheta (%) | >95 |
Tabell 1: Radiomärkning och kvalitetskontroll av [68Ga]DPA. Radiokemiskt utbyte, molaktivitet och radiokemisk renhet för [68Ga] DPA. Data representeras som medelvärdet ± SD (n = 7). Denna tabell har modifierats från Hu et al.47. Förkortning: DPA = dodekapeptidantagonist. EnRadiokemisk renhet av [68Ga] DPA analyserades med omvänd fas HPLC under ett optimerat tillstånd: 1) kolonn: YMC-Triat-C18 (4,6 mm id, 150 mm, 5 mm); 2) lösningsmedelsgradient: lösningsmedel A-avjoniserat vatten; lösningsmedel B-acetonitril (0,1 % trifluorättiksyra); flödestid: 20 min, med acetonitril från 10% till 90%; flödeshastighet på 1 ml/min.
| [68Ga] DPA | ||||||||
| 5 minuter | 30 minuter | 60 minuter | 120 minuter | |||||
| blod | 3.89 | ±0.43 | 1.55 | ±1.07 | 0.11 | ±0.02 | 0.05 | ±0.01 |
| hjärta | 1.19 | ±0.39 | 0.52 | ±0.33 | 0.06 | ±0.02 | 0.05 | ±0.02 |
| lever | 1.06 | ±0.26 | 0.59 | ±0.43 | 0.19 | ±0.02 | 0.16 | ±0.04 |
| mjälte | 0.98 | ±0.14 | 0.68 | ±0,67 | 0.14 | ±0.06 | 0.09 | ±0.03 |
| lunga | 1.64 | ±0.42 | 1.03 | ±0.9 | 0.13 | ±0.05 | 0.09 | ±0.02 |
| njure | 19.23 | ±1,95 | 16.13 | ±1.51 | 11.5 | ±0.44 | 5.2 | ±0.31 |
| mage | 1.54 | ±0.1 | 0.61 | ±0,35 | 0.08 | ±0.01 | 0.08 | ±0.03 |
| inälvs | 0.72 | ±0.27 | 0.47 | ±0,35 | 0.08 | ±0.02 | 0.06 | ±0.03 |
| bukspottkörtel | 1.88 | ±0.28 | 0.77 | ±0,75 | 0.16 | ±0.03 | 0.13 | ±0.03 |
| muskel | 2.21 | ±0.27 | 0.71 | ±0.37 | 0.18 | ±0.02 | 0.14 | ±0.04 |
| ben | 2.18 | ±0.11 | 0.85 | ±0.51 | 0.26 | ±0.09 | 0.14 | ±0.06 |
| hjärna | 0.19 | ±0.04 | 0.11 | ±0.08 | 0.03 | ±0.01 | 0.02 | ±0.01 |
| tumör | 4.5 | ±0.32 | 3.77 | ±0.27 | 2.99 | ±0.03 | 0.89 | ±0.19 |
| fett | 2.09 | ±0.49 | 0.81 | ±0.12 | 0.27 | ±0.07 | 0.1 | ±0.07 |
Tabell 2: Biodistribution av [68Ga]DPA i tumörbärande möss med U87MG efter administrering under olika varaktighet (n = 3 per tidpunkt). Denna tabell är modifierad från Hu et al.47. Förkortning: DPA = dodekapeptidantagonist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiska stegen som beskrivs i denna metod inkluderar effektiv märkning av 68Ga till DPA och val av ett lämpligt tidsfönster för PET-avbildning, som perfekt måste matcha det farmakodynamiska mönstret för DPA i tumören.
Till skillnad från IHC möjliggör PET-avbildning realtidsdetektering av helkropps PD-L1-uttryck på ett icke-invasivt sätt, vilket möjliggör visualisering av varje positivt område i en heterogen tumör 6,7. Peptider valdes som ligander för att undvika nackdelarna med antikroppar och små molekyler. Antikroppar med stora molekylvikter har i allmänhet långa cirkulerande halveringstider, vilket orsakar högre toxicitet för friska organ. Clearance av små molekyler är vanligtvis för snabb för att uppnå den nödvändiga tumörretentionen. Molekylvikten för peptider varierar mellan antikroppar och små molekyler. Detta gör det möjligt för peptidbaserade radiotracers att uppnå både långsiktig tumörretention och god vävnadspenetration med minimal toxicitet 13,49,50,51,52,53. Viktigt är att användbarheten av D-peptid DPA, snarare än de vanligen rapporterade L-peptiderna, ger [68Ga] DPA med en anmärkningsvärt förlängd metabolisk halveringstid. Dessutom är DPA positivt laddad och hydrofil in vivo, och har därför hög löslighet och kan undvika ospecifik målsökning i blod, vilket underlättar generering av PET-bilder med hög bildkvalitet.
Noterbart är att framgångsrik radiomärkning av 68Ga kräver ett specifikt pH och ingen interferens från övergångsmetalljoner, såsom Cu (II) och Fe (III) katjoner. I vissa fall leder Cu2+ -kontaminationen till lågt radiokemiskt utbyte. Därför är det viktigt att se till att alla behållare och pipettspetsar inte är förorenade. Dessutom, i denna metod, användes U87MG för tumörinokulering. Även om PD-L1-uttryck i U87MG-xenografter har verifierats i tidigare studier, varierar dess uttryck mellan enskilda djur. Därför varierade det absoluta upptaget av spårämnet i U87MG-tumörerna mellan enskilda möss. För att säkerställa ett effektivt upptag av spårämnen i tumörerna måste djur med lämplig tumörstorlek (500 mm3 < volym < 100 mm3) väljas ut för PET-skanning.
En av begränsningarna med [68Ga]DPA är att bindningsaffiniteten för DPA till PD-L1 är relativt låg jämfört med flera andra PD-L1-målsökande peptider, såsom WL12, vilket gör den olämplig för tumörer med relativt lågt PD-L1-uttryck26,47. Ytterligare modifiering av D-peptiden kommer att förbättra dess specifika bindningsförmåga. Dessutom, för att förbättra avbildningseffekten av [68Ga] DPA, kan formuleringen av injektionsstrategin optimeras, till exempel genom att samtidigt injicera omärkt DPA före [68Ga] DPA för att blockera de ospecifika bindningsställena 54,55,56.
Sammanfattningsvis utvecklade denna studie en icke-invasiv metod i realtid för att spåra PD-L1-distribution i hela kroppen hos levande djur med hjälp av [68Ga] DPA som radiotracer. Resultaten avslöjade en relativt hög, in vivo-specifik bindningsaffinitet, gynnsam stabilitet och utmärkt avbildningskapacitet för [68Ga]DPA, vilket tyder på att [68Ga]DPA-PET är ett lovande tillvägagångssätt för att visualisera PD-L1-överuttryckande tumörer. Dessutom kan denna teknik också tillämpas på behandling av PD-L1-positiva tumörer vid märkning av DPA med andra radionuklider, såsom 177Lu och 225Ac. Därför övervinner DPA-radiomärkningstekniken inte bara begränsningen av IHC-beroende diagnos, utan ger också ett nytt alternativ för behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga motstridiga intressen deklareras.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av den ideella Central Research Institute Fund of Chinese Academy of Medical Sciences (nr 2022-RC350-04) och CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (nr 2021-I2M-1-026, 2022-I2M-1-026-1, 02120101, 02130101 och 2022-I2M-2-002).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) | Merck | 60239-18-1 | 68Ga chelation |
| 3,3-diaminobenzidine (DAB) Kit | Sigma-Aldrich | D7304-1SET | Immunohistochemistry |
| anti-PD-L1 monoclonal antibody | Wuhan Proteintech | 17952-1-ap | Immunohistochemistry: primary antibody |
| BMS202 | Selleck | 1675203-84-5 | Competitive binding assay: inhibitor |
| BSA | Merck | V900933 | Immunofluorescent : blocking |
| DAPI | Merck | D9542 | Immunofluorescent: staining of nucleus |
| Dichloromethane (DCM) | Merck | 34856 | Solvent |
| DIPEA | Merck | 3439 | Peptide coupling |
| EDC·HCl | Merck | E6383 | Activation of DOTA |
| FBS | Gibco | 10099 | Cell culture: supplement |
| FITC-conjugated anti-human IgG Fc Antibody | Biolegend | 409310 | Immunofluorescent: secondary antibody |
| FITC-conjugated anti PD-L1 antibody | Biolegend | 393606 | Flow cytometry: direct antibody |
| HCTU | Energy Chemical | E070004-25g | Peptide coupling |
| HRP labeled goat anti-rabbit antibody | Servicebio | GB23303 | Immunohistochemistry: secondary antibody |
| Hydroxysuccinimide (NHS) | Merck | 130672 | Activation of DOTA |
| MeCN | Merck | PHR1551 | Solvent |
| Morpholine | Merck | 8.06127 | Fmoc- deprotection |
| NMP | Merck | 8.06072 | Solevent |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Fixation of tissues |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture: buffer |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 10378016 | Cell culture: supplement |
| RIA tube | PolyLab | P10301A | As tissue sample container |
| RPMI-1640 medium | Gibco | 11875093 | Cell culture: basic medium |
| Sodium acetate | Merck | 1.06264 | Salt for buffer |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Cell culture: dissociation agent |
| U87MG cell line | Procell Life Science & Technology Co | CL-0238 | Cell model |
| Equipment | |||
| 68Ge/68Ga generator | Isotope Technologies Munich, ITM | Not applicable | Generation of [68Ga] |
| Autogamma counter | Perkin Elmer | Wizard2 | Detection of radioactivity |
| Confocal fluorescent microscopy | Keyence | Observation of immunofluorescent results | |
| Flow cytometer | Becton Dickinson, BD | LSRII | Monitoring the PD-L1 positive cells |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | SHIMAZU | LC-20AT | Purification of DPA peptide |
| PET scanner | Siemens Medical Solutions | Inveon MultiModality System | PET imaging |
| Optical microscopy | Nikon | Eclipse E100 | Observation of immunohistochemistry results |
| Solid phase peptide synthesizer | Promega Vac-Man Laboratory Vacuum Manifold | LOT#11101 | Synthesis of DPA-DOTA peptide |
| Software | |||
| ASIPro | Siemens Medical Solutions | Not applicable | Analysis of PET-CT results |
| FlowJo | Becton Dickinson, BD | FlowJo 7.6.1 | Analysis of the flow cytometer results |
| Inveon Acquisition Workplace (IAW) | Siemens Medical Solutions | Not applicable | Management of PET mechine |
| Prism | Graphpad | Prism 8.0 | Analysis of the data |
References
- Doroshow, D. B., et al. PD-L1 as a biomarker of response to immune-checkpoint inhibitors. Natire Reviews Clinical Oncology. 18 (6), 345-362 (2021).
- Krutzek, F., Kopka, K., Stadlbauer, S. Development of radiotracers for imaging of the PD-1/PD-L1 axis. Pharmaceuticals. 15 (6), 747 (2022).
- Topalian, S. L., Drake, C. G., Pardoll, D. M. Immune checkpoint blockade: a common denominator approach to cancer therapy. Cancer Cell. 27 (4), 450-461 (2015).
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Xiao, Z., et al. PEIGel: A biocompatible and injectable scaffold with innate immune adjuvanticity for synergized local immunotherapy. Materials Today Bio. 15, 100297 (2022).
- Teng, M. W. L., Ngiow, S. F., Ribas, A., Smyth, M. J. Classifying cancers based on T-cell infiltration and PD-L1. Cancer Research. 75 (11), 2139-2145 (2015).
- Dolled-Filhart, M., et al. Development of a companion diagnostic for pembrolizumab in non-small cell lung cancer using immunohistochemistry for programmed death ligand-1. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 140 (11), 1243-1249 (2016).
- Meng, X. J., Huang, Z. Q., Teng, F. F., Xing, L. G., Yu, J. M. Predictive biomarkers in PD-1/PD-L1 checkpoint blockade immunotherapy. Cancer Treatment Reviews. 41 (10), 868-876 (2015).
- Hakozaki, T., Hosomi, Y., Kitadai, R., Kitagawa, S., Okuma, Y. Efficacy of immune checkpoint inhibitor monotherapy for patients with massive non-small-cell lung cancer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 146 (11), 2957-2966 (2020).
- Haslam, A., Prasad, V. Estimation of the percentage of US patients with cancer who are eligible for and respond to checkpoint inhibitor immunotherapy drugs. Jama Network Open. 2 (5), 192535 (2019).
- Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S.
- Zhang, L., et al. Recent developments on PET radiotracers for TSPO and their applications in neuroimaging. Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (2), 373-393 (2021).
- Sun, J., et al. Imaging-guided targeted radionuclide tumor therapy: From concept to clinical translation. Advanced Drug Delivery Reviews. 190, 114538 (2022).
- Xu, M., et al. Preclinical study of a fully human Anti-PD-L1 antibody as a theranostic agent for cancer immunotherapy. Molecular Pharmaceutics. 15 (10), 4426-4433 (2018).
- Niemeijer, A. N., et al. Whole body PD-1 and PD-L1 positron emission tomography in patients with non-small-cell lung cancer. Nature Communications. 9 (1), 4664 (2018).
- Mayer, A. T., et al. Practical immuno-PET radiotracer design considerations for human immune checkpoint imaging. Journal of Nuclear Medicine. 58 (4), 538-546 (2017).
- Lv, G., et al. PET Imaging of tumor PD-L1 expression with a highly specific nonblocking single-domain antibody. Journal of Nuclear Medicine. 61 (1), 117-122 (2020).
- Li, D., et al. Immuno-PET imaging of 89Zr labeled anti-PD-L1 domain antibody. Molecular Pharmaceutics. 15 (4), 1674-1681 (2018).
- Lesniak, W. G., et al. PD-L1 detection in tumors using [(64)Cu]Atezolizumab with PET. Bioconjugate Chemistry. 27 (64), 2103-2110 (2016).
- Kristensen, L. K., et al. CD4(+) and CD8a(+) PET imaging predicts response to novel PD-1 checkpoint inhibitor: studies of Sym021 in syngeneic mouse cancer models. Theranostics. 9 (26), 8221-8238 (2019).
- Christensen, C., Kristensen, L. K., Alfsen, M. Z., Nielsen, C. H., Kjaer, A. Quantitative PET imaging of PD-L1 expression in xenograft and syngeneic tumour models using a site-specifically labelled PD-L1 antibody. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 47 (5), 1302-1313 (2020).
- Bensch, F., et al. 89Zr-atezolizumab imaging as a non-invasive approach to assess clinical response to PD-L1 blockade in cancer. Nature Medicine. 24 (12), 1852-1858 (2018).
- Gonzalez Trotter, D. E., et al. In vivo imaging of the programmed death ligand 1 by 18F PET. Journal of Nuclear Medicine. 58 (11), 1852-1857 (2017).
- Lv, G., et al. Promising potential of a 18F-labelled small-molecular radiotracer to evaluate PD-L1 expression in tumors by PET imaging. Bioorganic Chemistry. 115, 105294 (2021).
- Miao, Y., et al. One-step radiosynthesis and initial evaluation of a small molecule PET tracer for PD-L1 imaging. Bioorganic & Medicinal Chemical Letters. 30 (24), 127572 (2020).
- Kumar, D., et al. Peptide-based PET quantifies target engagement of PD-L1 therapeutics. The Journal of Clinical Investigation. 129 (2), 616-630 (2019).
- Powles, T., et al. MPDL3280A (anti-PD-L1) treatment leads to clinical activity in metastatic bladder cancer. Nature. 515 (7528), 558-562 (2014).
- Herbst, R. S., et al. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature. 515 (7528), 563-567 (2014).
- Marciscano, A. E., Gulley, J. L. Avelumab demonstrates promise in advanced NSCLC. Oncotarget. 8 (61), 102767-102768 (2017).
- Vaddepally, R. K., Kharel, P., Pandey, R., Garje, R., Chandra, A. B. Review of indications of FDA-approved immune checkpoint inhibitors per NCCN guidelines with the level of evidence. Cancers. 12 (3), 738 (2020).
- Antonia, S. J., et al. Durvalumab after chemoradiotherapy in stage III non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 377 (20), 1919-1929 (2017).
- Wang, D. Y., et al. Fatal toxic effects associated with immune checkpoint inhibitors: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 4 (12), 1721-1728 (2018).
- Sgouros, G., Bodei, L., McDevitt, M. R., Nedrow, J. R. Radiopharmaceutical therapy in cancer: clinical advances and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (9), 589-608 (2020).
- (US) M. M. M, et al. Macrocyclic inhibitors of the pd-1/pd-l1 and cd80(b7-1)/pd-l1 protein/protein interactions. United States patent. , US-2017260237-A1 (2014).
- Chatterjee, S., et al. Rapid PD-L1 detection in tumors with PET using a highly specific peptide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 258-263 (2017).
- De Silva, R. A., et al. Peptide-based 68Ga-PET radiotracer for imaging PD-L1 expression in cancer. Molecular Pharmaceutics. 15 (9), 3946-3952 (2018).
- Lesniak, W. G., et al. Development of [18F]FPy-WL12 as a PD-L1 specific PET imaging peptide. Molecular Imaging. 18, 1536012119852189 (2019).
- Zhou, X., et al. First-in-humans evaluation of a PD-L1-binding peptide PET radiotracer in non-small cell lung cancer patients. Journal of Nuclear Medicine. 63 (4), 536-542 (2022).
- Hu, K., et al. Developing native peptide-based radiotracers for PD-L1 PET imaging and improving imaging contrast by pegylation. Chemical Communications. 55 (29), 4162-4165 (2019).
- Liu, H., et al. A novel small cyclic peptide-based 68Ga-Radiotracer for positron emission tomography imaging of PD-L1 expression in tumors. Molecular Pharmaceutics. 19 (1), 138-147 (2022).
- Rabideau, A. E., Pentelute, B. L. A D-amino acid at the N-terminus of a protein abrogates its degradation by the N-end rule pathway. ACS Central Science. 1 (8), 423-430 (2015).
- Uppalapati, M., et al. A potent D-protein antagonist of VEGF-A is nonimmunogenic, metabolically stable, and longer-circulating in vivo. ACS Chemical Biology. 11 (4), 1058-1065 (2016).
- Garton, M., et al. Method to generate highly stable D-amino acid analogs of bioactive helical peptides using a mirror image of the entire PDB. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1505-1510 (2018).
- Jia, F. J., et al. D-amino acid substitution enhances the stability of antimicrobial peptide polybia-CP. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (10), 916-925 (2017).
- Carmona, G., Rodriguez, A., Juarez, D., Corzo, G., Villegas, E. Improved protease stability of the antimicrobial peptide Pin2 substituted with D-amino acids. Protein Journal. 32 (6), 456-466 (2013).
- Feng, Z., Xu, B. Inspiration from the mirror: D-amino acid containing peptides in biomedical approaches. Biomolecular Concepts. 7 (3), 179-187 (2016).
- Hu, K., et al. Whole-body PET tracking of a d-dodecapeptide and its radiotheranostic potential for PD-L1 overexpressing tumors. Acta Pharmaceutica Sinica. B. 12 (3), 1363-1376 (2022).
- Qiu, X. Y., et al. PD-L1 confers glioblastoma multiforme malignancy via Ras binding and Ras/Erk/EMT activation. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864, 1754-1769 (2018).
- Hu, K., et al. Development of a stable peptide-based PET tracer for detecting CD133-expressing cancer cells. ACS Omega. 7 (1), 334-341 (2021).
- Jin, Z. -H., et al. Radiotheranostic agent 64Cu-cyclam-RAFT-c(-RGDfK-)4 for management of peritoneal metastasis in ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 26 (23), 6230-6241 (2020).
- Hu, K., et al. Harnessing the PD-L1 interface peptide for positron emission tomography imaging of the PD-1 immune checkpoint. RSC Chemical Biology. 1 (4), 214-224 (2020).
- Hu, K., et al. PET imaging of VEGFR with a novel 64Cu-labeled peptide. ACS Omega. 5 (15), 8508-8514 (2020).
- Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
- Zhao, J., et al. Concurrent injection of unlabeled antibodies allows positron emission tomography imaging of programmed cell death ligand 1 expression in an orthotopic pancreatic tumor model. ACS Omega. 5 (15), 8474-8482 (2020).
- Moroz, A., et al. A preclinical assessment of 89Zr-atezolizumab identifies a requirement for carrier added formulations not observed with 89Zr-C4. Bioconjugate Chemistry. 29 (10), 3476-3482 (2018).
- Nedrow, J. R., et al. Imaging of programmed cell death ligand 1: impact of protein concentration on distribution of anti-PD-L1 SPECT agents in an immunocompetent murine model of melanoma. Journal of Nuclear Medicine. 58 (10), 1560-1566 (2017).
