Summary
В этом исследовании был разработан неинвазивный метод в режиме реального времени для оценки распределения запрограммированного лиганда смерти 1 во всем организме, основанный на позитронно-эмиссионной томографии антагониста D-додекапептида [68Ga]. Этот метод имеет преимущества по сравнению с обычной иммуногистохимией и повышает эффективность выявления подходящих пациентов, которым будет полезна терапия блокады контрольных точек иммунного ответа.
Abstract
Разработка терапии блокады контрольных точек иммунного ответа на основе белка программируемой клеточной смерти 1 (PD-1)/лиганда запрограммированной смерти 1 (PD-L1) произвела революцию в терапии рака в последние годы. Тем не менее, только часть пациентов реагирует на ингибиторы PD-1/PD-L1 из-за гетерогенной экспрессии PD-L1 в опухолевых клетках. Эта гетерогенность представляет собой проблему точного обнаружения опухолевых клеток с помощью широко используемого иммуногистохимического (ИГХ) подхода. Эта ситуация требует более совершенных методов стратификации пациентов, которым будет полезна терапия блокады контрольных точек иммунного ответа, для повышения эффективности лечения. Позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) позволяет в режиме реального времени визуализировать экспрессию PD-L1 по всему телу неинвазивным способом. В связи с этим возникла необходимость в разработке радиомеченных индикаторов для выявления распределения PD-L1 в опухолях с помощью ПЭТ-визуализации.
По сравнению со своими L-аналогами, декстровращающие (D)-пептиды обладают такими свойствами, как протеолитическая резистентность и значительно более длительный метаболический период полувыведения. В этом исследовании был разработан новый метод обнаружения экспрессии PD-L1 на основе ПЭТ-визуализации 68меченых Ga-меченым PD-L1 D-пептида, антагониста D-додекапептида (DPA), у мышей с опухолями. Результаты показали, что [68Ga]DPA может специфически связываться с опухолями, гиперэкспрессирующими PD-L1 in vivo, и показали благоприятную стабильность, а также отличную способность к визуализации, что позволяет предположить, что [68Ga]DPA-PET является перспективным подходом для оценки статуса PD-L1 в опухолях.
Introduction
Открытие белков контрольных точек иммунного ответа стало прорывом в терапии опухолей и привело к значительному прогрессу в разработке терапии блокады контрольных точек иммунногоответа. Белок программируемой клеточной смерти 1 (PD-1) и лиганд запрограммированной смерти 1 (PD-L1) являются потенциальными мишенями для лекарств с несколькими антителами, одобренными Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA). PD-1 экспрессируется инфильтрирующими опухоль иммунными клетками, такими как CD4+, CD8+ Т-клетки и регуляторные Т-клетки. PD-L1 является одним из лигандов PD-1, который гиперэкспрессируется в различных опухолевых клетках 2,3. Взаимодействие между PD-1 и PD-L1 инактивирует PD-1, тем самым подавляя противоопухолевый иммунный ответ4. Эти данные свидетельствуют о том, что ингибирование PD-L1 может улучшить киллинговый эффект иммунных клеток и устранить опухолевыеклетки. В настоящее время хромогенная иммуногистохимия (ВПХ) является наиболее часто используемым подходом для выявления пациентов, которые с наибольшей вероятностью ответят на терапию контрольными точками иммунного ответа 6,7. Однако из-за гетерогенной экспрессии PD-L1 в опухолевых клетках результаты биопсии ВПХ не могут дать точную информацию об экспрессии PD-L1 у пациентов8. Предыдущие исследования показали, что только 20-40% пациентов получают долгосрочную пользу от терапии блокадой контрольных точек иммунного ответа 1,9,10. Таким образом, существует острая необходимость в разработке нового метода обхода ложноотрицательных результатов, вызванных гетерогенной экспрессией этих белков контрольных точек иммунного ответа.
Технология молекулярной визуализации, такая как позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), позволяет визуализировать все тело в режиме реального времени неинвазивным способом и, таким образом, может превзойти традиционный метод ИГХ 11,12,13. Радиоактивно меченные антитела, пептиды и малые молекулы являются перспективными индикаторами для мониторинга экспрессии PD-L1 у онкологических больных 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило три терапевтических моноклональных антитела PD-L1: авелумаб, атезолизумаб и дурвалумаб26. Иммуно-ПЭТ-индикаторы на основе этих антител были хорошо задокументированы 27,28,29,30,31,32. Ранние фазы клинических испытаний выявили ограниченную ценность для клинического применения из-за неблагоприятной фармакокинетики30. По сравнению с антителами, пептиды демонстрируют более быстрый вывод крови и органов из здоровых органов и могут бытьлегко химически модифицированы. Сообщалось о нескольких пептидах с высоким сродством к PD-1/PD-L12; WL12 является пептидом, который демонстрирует специфическое связывание с PD-L134. Радиомеченные индикаторы [64Cu]WL12, [68Ga]WL12 и [18F]FPyWL12 демонстрируют высокую in vivo специфическую способность к нацеливанию на опухоль, что позволяет получать высококачественные изображения экспрессии PD-L1 в опухолях 26,35,36,37. Более того, первая оценка на людях радиоактивно меченного WL12 продемонстрировала, что [68Ga]WL12 (хелатированный NOTA) обладает безопасным и эффективным потенциалом для клинической визуализации опухолей38. Из-за своей высокой гидрофобности и высокого поглощения здоровой печенью WL12 имеет ограниченное клиническое применение. Другие радиомечущие пептиды, такие как TPP1 и SETSKSF, которые специфически связываются с PD-L1, также показали потенциальную стабильность и специфичность для визуализации экспрессии PD-L1 во всем теле39,40. Однако немодифицированные пептиды легко расщепляются протеазами и быстро метаболизируются почками. Правовращающие(D)-пептиды широко используются в качестве эффективных медиаторов из-за плохой стабильности левосторонних (L)-пептидов 41,42,43. D-пептиды гиперустойчивы к протеолитическому разложению и имеют значительно более длительный метаболический период полувыведения. По сравнению со своими L-аналогами, D-пептиды в основном проявляют специфическую связывающую способность 44,45,46.
В этом исследовании был разработан новый метод обнаружения экспрессии PD-L1, основанный на ПЭТ-визуализации 68Ga-меченого PD-L1-таргетированного D-пептида, антагониста D-додекапептида (DPA), в мышиной модели47 с опухолью. Стабильность [68Ga]DPA была впервые изучена в фосфатно-солевом буфере (PBS) и сыворотке крови мышей, после чего было проверено сродство связывания [68Ga]DPA в опухолях с гиперэкспрессией PD-L1. После этого была проведена ПЭТ-визуализация на моделях ксенотрансплантатов глиобластомы, чтобы подтвердить, является ли [68Ga]DPA идеальным ПЭТ-индикатором для мониторинга экспрессии PD-L1 в опухолях. Сочетание ПЭТ-визуализации и ДПА не только обеспечивает новый подход к преодолению проблем, связанных с гетерогенной экспрессией PD-L1, но и закладывает основу для разработки радиоиндикаторов на основе D-пептида.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедуры экспериментов на животных были одобрены Комитетом по этике животных Нанкинского медицинского университета или Национальными институтами квантовой науки и технологии. Эксперименты на мышах проводились строго в соответствии с руководящими принципами Комитета по уходу и использованию лабораторных животных.
1. Синтез пептидов
- Набухают 100 мг смолы 4-метилбензидриламина (MBHA) (нагрузочная способность 0,37 ммоль/г) в 1 мл N-метил-2-пирролидона (NMP) в течение 30 мин при слабом барботированииN2.
- Приготовьте свежий бульонный буфер, состоящий из защищенных Fmoc аминокислот (5,0 экв.), HCTU (4,9 экв.) и DIPEA (10,0 экв.) в 1 мл NMP и добавьте в смолу (100 мг). Дайте реакции сцепления протекать в течение 1,5-2 ч.
- Приготовьте буфер для снятия защиты, состоящий из 50% морфолина в NMP. Промывайте смолу (100 мг) 2 x 30 мин с 1 мл буфера для защиты в каждой промывке, чтобы удалить группу Fmoc на аминной группе. Промойте смолу дихлорметаном (DCM; 1 мл) в течение 1 мин, удалите DCM и повторно промойте смолу NMP (1 мл) еще 1 мин. Затем снимите NMP и повторно промойте смолу DCM в течение 1 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры промывки проводятся при мягком пузырьке N2 . Вышеописанные процедуры повторяют до последней аминокислоты. - Для добавления 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты (ДОТА) к пептиду предварительно активируйте DOTA N-(3-диметиламинопропил)-N-этилкарбодиимида гидрохлорид (EDC· HCl) и N-гидроксисукцинимид (NHS). Инкубация биржевого буфера DOTA/EDC· HCl/NHS в молярном соотношении 1:1:1 в диметилсульфоксиде (ДМСО) в течение 3 ч, с конечной концентрацией DOTA 1 М. Затем добавьте бульонный буфер (1 мл) к смоле (100 мг) и дайте реакции продолжаться в течение 2 ч с мягким барботированиемN2.
ПРИМЕЧАНИЕ: 1,4,7-триазациклонан-1,4,7-триуксусная кислота (NOTA) также может быть использована в качестве хелатора для комплексообразования 68Ga. Те же процедуры могут быть использованы для соединения NOTA. - Тщательно промойте смолу сверху с помощью DCM и одновременно примените вакуум, чтобы удалить остаточный реакционный раствор. Промойте смолу 3 раза с помощью DCM (1,5 мл), а затем смойте MeOH (1,5 мл), чтобы смола дала усадку. Поместите смолу под азот на ночь или под высокий вакуум не менее чем на 4 часа, пока смола не высохнет.
- Поместите высушенную пептидсодержащую смолу DPA в полипропиленовый контейнер объемом 2 мл с завинчивающейся крышкой. Добавьте соответствующий коктейль для расщепления (95/2,5/2,5 TFA/TIS/H2O в объеме; 1 мл/100 мг смолы) и плотно закройте контейнер завинчивающейся крышкой. Осторожно перемешайте реакцию на орбитальном шейкере в вытяжном шкафу при температуре 20-25 °C в течение 2 ч.
ВНИМАНИЕ: Готовьте трифторуксусную кислоту (ТЖК) в вытяжном шкафу, надев защитную одежду из-за ее высокой коррозионной природы. - Удалите большую часть ТЖК путем испарения под азотом в вытяжном шкафу. Осаждают пептиды, добавляя диэтиловый эфир (~1,5 мл/100 мг смолы).
- Смешайте смесь для растирания пептидов и центрифугируйте при комнатной температуре (10 000 × г, 5 мин). Осторожно вылейте растворитель из емкости. Повторите шаги 1.7-1.8.
- Остатки высушить на воздухе в открытой емкости в течение 10 минут. Добавьте 50% (об./об.) водного ацетонитрила и встряхивайте в течение 1-2 с для растворения продуктов (1 мл/100 мг смолы).
- Удалите смолу, процедив смесь, а затем промойте смолу 2 раза, используя 0,2 мл 50% (об./об.) водного ацетонитрила. Смешайте фильтраты для высокоэффективной очистки с помощью жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Используйте следующие условия ВЭЖХ. Колонна: YMC-Triat-C18 (внутренний диаметр 4,6 мм, 150 мм, 5 мм); градиент растворителя: растворитель А-деионизированная вода; растворитель В-ацетонитрил (0,1% ТЖК); время течения: 20 мин, с ацетонитрилом от 10% до 90%; Скорость потока: 1 мл/мин.
- Собранные элюенты ВЭЖХ замораживают на ночь при -80 °C и лиофилизируют (-50 °C и <1 Па). Для радиоактивного мечения растворяют твердый пептид в буфере из ацетата натрия (100 мМ, рН 5,0) в конечной концентрации 1 мг/мл в качестве исходного буфера.
2. Радиомаркировка 68Ga
ПРИМЕЧАНИЕ 68Ga был сгенерирован в Первой больнице Нанкина (Нанкин, Китай) с использованием генератора 68Ge/68Ga.
- Пипетку 5 мкл буфера для заготовки в полипропиленовый контейнер объемом 1,5 мл с завинчивающейся крышкой. Добавьте в контейнер 200 MBq [68Ga]GaCl3 (400 мкл).
- Перемешайте смесь в течение 5 с. Измерьте рН с помощью тест-полосок. Отрегулируйте pH до 4-4,5 с NaOH (0,1 M).
ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующий pH имеет решающее значение для комплексообразования между 68Ga и DOTA. - Выдерживают раствор при комнатной температуре 5-10 мин. Подвергнуть реакционную смесь радио-ВЭЖХ для анализа выхода радиомечения в следующих условиях: колонка: YMC-Triat-C18 (внутренний диаметр 4,6 мм, 150 мм, 5 мм); градиент растворителя: растворитель А-деионизированная вода; растворитель В-ацетонитрил (0,1% ТЖК); время течения: 20 мин, с ацетонитрилом от 10% до 90%; Скорость потока: 1 мл/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Радиотонкослойная хроматография (ТСХ) может быть использована в качестве альтернативного подхода к изучению выхода радиомечения. Рекомендуемый буфер для элюирования ТСХ составляет 0,1 M Na3C6H5O7, pH 4.
3. Испытание на стабильность трассировщика
- Тест на стабильность трассировщика в PBS
- Добавьте [68Ga]DPA (10 мкл, 3,7 МБк, в NaOAc) к PBS (990 мкл). Инкубируют при 37 °C в течение 1, 2 и 4 ч при легком перемешивании.
- Собирайте по 200 мкл раствора в каждый момент времени. Введите его в радио-ВЭЖХ для анализа.
- Стабильность индикаторов в сыворотке крови мышей
- Добавьте [68Ga]DPA (10 мкл, ~3,7 MBq, в NaOAc) в сыворотку мышей (90 мкл, свежеприготовленная). Инкубируют при 37 °C в течение 1, 2 и 4 ч при легком перемешивании.
- Собирайте по 20 мкл раствора в каждый момент времени. Добавьте MeCN и воду (100 мкл, 1:1, v/v).
- Центрифужируют смесь в течение 10 мин (5 000 × г, 25 °C). Анализ надосадочной жидкости с помощью радио-ВЭЖХ.
4. Анализ экспрессии PD-L1 методом проточной цитометрии
- Приготовьте питательную среду, добавив среду RPMI-1640 10% (об./об.) фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллин-стрептомицин (об./об.). Ресуспендируйте клетки U87MG в питательной среде и засевайте в 12-луночные планшеты при плотности10-5 клеток/лунку. Поместите клетки в инкубатор (5% CO2, 37 °C) и культивируйте не менее 24 ч, не беспокоя.
- Промойте клетки 0,5 мл PBS и добавьте 250 мкл трипсина-ЭДТА (0,25%). Поместите клетки обратно в инкубатор (5% CO2, 37 °C) на 2 минуты.
- Добавьте 1 мл питательной среды, чтобы остановить диссоциацию клеток. Добавьте среду в клетки, чтобы отделить их от посуды путем пипетирования вверх и вниз, и собрать их в пробирки по 1,5 мл. Центрифугируют клетки в течение 5 мин (100 × г).
- Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 1 мл PBS. Центрифугируют клетки в течение 5 мин (100 × г). Повторите этот шаг еще раз.
- Флуоресцеин-изотиоцианат (FITC)-конъюгированное антитело PD-L1 с 3% бычьим сывороточным альбумином (BSA) до 20 нмоль/л. Добавляют к клеткам и инкубируют при 4 °C в течение 1 ч.
- Центрифугируют клетки в течение 5 мин (100 × г) с последующей промывкой холодным ПБС дважды. Анализ PD-L1-положительных клеток с помощью проточного цитометра и аналитического программного обеспечения.
5. Иммуноцитохимия
- Высевают клетки U87MG в чашки для культивирования клеток со стеклянным дном (35 мм) при плотности 2,5 × 105 клеток на лунку. При достижении 60% слияния проводят аспирацию питательной среды и добавляют 1 мл PBS. Аккуратно встряхните несколько раз и аспирируйте. Выполните этап стирки 3 раза.
- Добавьте в посуду 500 мкл 4% параформальдегида. Поместите клетки при комнатной температуре и зафиксируйте на 30 минут.
- Промойте клетки 3 раза с помощью PBS. Добавьте 1 мл 3% BSA (масс./об., в PBS) и заблокируйте неподвижные ячейки на 2 ч при комнатной температуре.
- Удалите 3% BSA и непосредственно инкубируйте клетки с первичными антителами к PD-L1 (mAb, 1:100, разбавленные 3% BSA) в течение ночи при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: После блокировки ячеек БСА не промывать ПБС. - Промойте клетки 3 раза 3% буфером BSA. Инкубируют клетки с FITC-конъюгированными вторичными антителами IgG Fc (1:500, разведенные в PBS) в течение 1 ч.
- Промойте клетки 3 раза с помощью PBS. Добавьте 0,5 мл DAPI (1 мкг/мл) к клеткам и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 ч. Промыть окрашенные клетки 3 раза PBS и наблюдать с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа.
6. Эксперимент по клеточному поглощению и ингибированию
- Эксперимент по клеточному поглощению
- Культивирование клеток U87MG в 12-луночных планшетах до достижения 80% слияния. Удалите средство и промойте ячейки 0,5 мл PBS.
- Разбавьте [68Ga]DPA в свежей среде до концентрации 74 KBq/мл. Добавьте 0,5 мл разбавленного буфера [68Ga]DPA в каждую лунку.
- Инкубируют клетки с [68Ga]DPA при 37 °C в течение разной продолжительности (10, 30, 40 и 120 минут). Аспирируйте среду с помощью пипетки. Промойте клетки PBS (0,5 мл) три раза.
- Добавьте раствор NaOH (0,5 М, 300 мкл на лунку) для лизировки клеток. Через 30 с соберите вязкие клеточные лизаты в пробирки по 1,5 мл.
- Дважды вымойте планшет 0,4 мл PBS. Соберите промывочный раствор в вышеуказанную пробирку объемом 1,5 мл.
- Запустить встроенный компьютер автоматического гамма-счетчика; Поместите тюбики во встроенную полку. После загрузки всех образцов на конвейер нажмите кнопку СТАРТ. Результаты рассчитываются во внутреннем программном обеспечении. Считывание записывает коррелированное количество в минуту (CPM) каждой пробирки.
- Конкурентный анализ связующего
- Культивирование клеток U87MG в 12-луночных планшетах до достижения 80% слияния. Удалите средство и промойте ячейки 0,5 мл PBS.
- Разбавляют [68Ga]DPA в свежей среде до концентрации 74 КБк/мл. Растворите соответствующее количество соединений BMS202 в 10% ДМСО до получения концентрации 10 мМ (400 мкл).
- Разбавьте 4 мкл 10 мМ BMS202 в 396 мкл PBS до получения концентрации 100 мкМ. Повторите этот шаг, чтобы получить различные концентрации BMS202 (1 мкМ, 10 нМ, 100 пМ и 1 пМ).
- Добавьте 0,5 мл разбавленного буфера [68Ga]DPA в каждую лунку (0,37 MBq на лунку). Добавьте 5 мкл раствора BMS202 в каждую лунку (по три лунки для каждой концентрации). Инкубируют клетки в клеточном инкубаторе при температуре 37 °C в течение 120 мин.
- Аспирируйте среду с помощью пипетки. Промойте клетки 3 x 0,5 мл PBS.
- Добавьте раствор NaOH (0,5 М, 300 мкл на лунку) для лизиса клеток. Через 30 с соберите вязкоклеточные лизаты в пробирки по 1,5 мл. Вымойте планшет 2 x 0,4 мл PBS.
- Соберите промывочный раствор в вышеуказанную пробирку объемом 1,5 мл. Поместите пробирки во встроенную полку автоматического гамма-счетчика.
- Выполните те же процедуры, что и на шаге 6.1.6.
7. Позитронно-эмиссионная томография
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте ПЭТ-визуализацию мелких животных с помощью микро-ПЭТ-сканера, который обеспечивает 159 поперечных осевых срезов, расположенных на расстоянии 0,796 мм друг от друга (от центра к центру), с горизонтальным полем зрения 10 см и осевым полем зрения 12,7 см. Все данные, собранные в режиме списка, организованы в трехмерные синограммы. Затем Фурье собирается в двумерные синограммы (кадр × мин.: 4 × 1, 8 × 2, 8 × 5).
- В этом исследовании использовали голых мышей BALB/C мужского пола в возрасте 5-8 недель. Соберите клетки U87MG, выполнив шаги 4.1-4.4, и аспирируйте клетки в шприц объемом 0,5 мл. Подкожно вводят клетки мышам (1 × 106 клеток на опухоль, две опухоли на мышь). Контролируйте рост опухоли после инъекции до тех пор, пока объем опухоли не составит 100-300мм3.
- Обезболивайте мышей 1%-2% (v/v) изофлураном (1 мл/мин). Включите нагревательный прибор и держите подстилку животного из ПЭТ при температуре 37 °C.
- Поместите мышей под наркозом в правильное положение на подстилку животного ПЭТ-аппарата. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить сухость.
ВНИМАНИЕ: Держите мышей в положении лежа, чтобы избежать смерти во время сканирования. В течение всего процесса визуализации вводите поток изофлурана (1,0 мл/мин) через нос с помощью предварительно установленной трубки. - Отрегулируйте положение лежанки животного с помощью панели управления. Вводят индикаторы (10-17 MBq/100-200 мкл) внутривенно через предварительно установленный катетер для хвостовой вены.
- Создание рабочего процесса сканирования на главном компьютере с помощью указанного программного обеспечения (см. Таблицу материалов) Создайте учебную папку и установите протокол сбора данных в соответствии с протоколом производителя. Выполняйте динамическое сканирование (60 минут для каждой мыши) на всех мышах в режиме 3D-списка.
- Определите протокол гистограммы и протокол реконструкции в соответствии с протоколом производителя. Используйте фильтр Хэннинга с отсечкой по Найквисту 0,5 цикла/пиксель для реконструкции динамических изображений ПЭТ (25-30 мин и 55-60 мин) с помощью фильтрованной обратной проекции. Генерация проекционных изображений максимальной интенсивности (MIP) для всех мышей.
- Объедините протоколы в рабочий процесс и запустите его. Проанализируйте полученные трехмерные изображения с помощью программного обеспечения, следуя протоколу производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте программное обеспечение для моделирования для выбора интересующих объемов. Радиоактивность корректируется с поправкой на время инъекции и представляется в виде процента от общей дозы инъекции на грамм ткани (% ID/г).
8. Биораспределение ex vivo
- Вводят [68Ga]DPA (1,85 MBq/100 мкл) голым мышам BALB/C, содержащим U87MG, через инъекцию в хвостовую вену. Обезболивайте мышей с помощью 1%-2% (v/v) изофлурана (1 мл/мин), затем жертвуйте трех мышей через вывих шейки после инъекции в течение 5, 30, 60 и 120 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лица, демонстрирующие эту процедуру, должны быть обучены техническим навыкам вывиха шейки матки, чтобы обеспечить быструю потерю сознания. Это гарантирует, что все процедуры эвтаназии в этом эксперименте будут выполнены гуманно. - После того, как смерть будет подтверждена, вскройте грудную стенку мышей. Затем откройте сердце. Используйте шприц объемом 1 мл для забора крови; выдавить кровь из шприца в пробирку для радиоиммунного анализа (РИА) (диаметром 13 мм) для гамма-счетчика.
- Иссеките основные органы и опухоли и поместите их в пробирки РИА (диаметром 13 мм) для гамма-счетчика. Основные органы включают общую кровь, сердце, тимус, печень, селезенку, кости, желудок, почки, мышцы, кишечные лимфатические узлы, тонкую кишку, поджелудочную железу, яички, мозг и легкие. Взвесьте все органы.
- Измерьте радиоактивность в собранных органах с помощью автогамма-счетчика и скорректируйте значения по затуханию. Рассчитайте процент введенной дозы на грамм влажной ткани (% ID/г).
9. Иммуногистохимия
- Соберите ткани глиомы и промойте их 3 раза PBS. Положите свежие салфетки в 4% параформальдегид и зафиксируйте на ночь при температуре 4 °C.
- Заделайте неподвижные ткани в парафин и разрежьте их до толщины 10 мкм. Поместите срезы в инкубатор (60 °C) и инкубируйте в течение 2 ч. Удалите и увлажните срезы, инкубируя в течение 10 минут каждый в следующих средах: ксилол (дважды), абсолютный спирт, 95% спирт, 90% спирт, 80% спирт, 75% спирт.
- Поместите срезы в 0,01 М цитрата натрия и нагрейте их до 92-95 °С. Поддерживайте температуру в течение 40 минут для получения антигена.
- Добавить 200 мкл раствораН2О2(3%) к срезам и инактивировать эндопероксидазы в течение 10 мин при комнатной температуре. Блокируют неспецифические участки обработкой 3% БСА в течение 2 ч при комнатной температуре.
- Инкубируют срезы в первичных антителах к PD-L1 (мАТ, 1:100, разбавленные 3% БСА) в течение ночи при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: После блокировки BSA не мойте PBS. - Промойте срезы 3 раза с помощью PBS. Инкубируют срезы с мечеными HRP вторичными антикроличьими антителами к козам (1:500, разведенные в PBS) при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Промойте клетки 3 раза с помощью PBS. Добавьте 200 мкл рабочего раствора 3,3-диаминобензидина (DAB) (раствор А: раствор Б: раствор С = 1:1:18) к срезам и инкубируйте в течение 5 мин в темноте.
- Промойте срезы 3 раза с помощью PBS. Добавить 500 мкл раствора гематоксилина (100%) и инкубировать 5 мин при комнатной температуре. Промыть срезы водой в течение 30 с. Поместите срезы в дифференцирующий раствор (75% спирт:HCL = 99:1) на 30 с. Промойте срезы водой в течение 1 мин.
- Обезвоживают образцы путем последовательной инкубации с 75% спиртом, 80% спиртом, 90% спиртом, 95% спиртом, абсолютным спиртом и ксилолом (дважды) (по 10 мин каждый). Смонтируйте все секции с помощью нейтральной смолы и рассмотрите их под оптическим микроскопом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
[68Ga]Радиомаркировка и стабильность DPA
Модельный пептид DPA является эффективным антагонистом PD-L1. DOTA-DPA получен с чистотой >95% и выходом 68%. Масса DOTA-DPA экспериментально наблюдается на уровне 1 073,3 ([M+2H]2+). до 68Галлий считается подходящим радионуклидом для мечения пептидов для ПЭТ-визуализации, поэтому был выбран для данного исследования. Для радиомечения DPA с 68Ga (период полувыведения: 68 мин) синтезировали DOTA-PEG3-DPA (рис. 1A). DOTA был использован в качестве хелатора для радиомечения 68Ga. Для размещения DOTA и DPA в качестве линкера использовался PEG3. [68Ga]-DOTA-PEG3-DPA (далее [68Ga]DPA) показали высокий радиохимический выход (>95%) и радиохимическую чистоту (>95%) (табл. 1). Также был проведен тест на стабильность индикаторов с использованием ВЭЖХ, и результаты показали, что [68Ga]DPA обладает высокой стабильностью как в PBS, так и в сыворотке крови мышей. Разложение 68Ga или пептидный гидролиз не были обнаружены после 4-часовой инкубации при 37 °C (рис. 1B).
Экспрессия PD-L1 в клетках U87MG
Предыдущее исследование показало, что повышенная экспрессия PD-L1 коррелирует с низкой выживаемостью пациентов при опухолях глиобластомы, что указывает на то, что PD-L1 может быть замечательным прогностическим биомаркером и терапевтической мишенью при глиобластоме48. Таким образом, клеточная линия глиобластомы человека, U87MG, была использована для создания модели опухоли для определения эффективности [68Ga]DPA в ПЭТ/КТ для визуализации опухолей PD-L1. Результаты проточной цитометрии показали, что примерно 60% клеток U87MG были PD-L1-положительными (рис. 2A). Более того, иммунофлуоресцентное окрашивание подтвердило сильную экспрессию PD-L1 в клетках U87MG (рис. 2B). В совокупности эти данные продемонстрировали, что клеточная линия U87MG подходит для этого исследования.
Клеточное поглощение и специфичность [68Ga]DPA
Поглощение [68Ga]DPA клетками U87MG имело нестационарную картину. При использовании ингибитора PD-L1 BMS202 в качестве блокирующего агента связывающая часть и поглощение [68Ga]DPA значительно снижались (рис. 3A). Конкурентный анализ связывания дополнительно изучил сродство связывания (Ki) BMS202 с клетками U87MG. Расчетное сродство связывания составило 43,8 ± 8,6 нмоль/л для BMS202 при использовании [68Ga]DPA в качестве конкурента (рис. 3B).
[68Ga]DPA ПЭТ-визуализация моделей опухолей
ПЭТ-визуализация [68Ga]DPA проводилась на голых мышах с опухолью U87MG BALB/C. [68млрд лет] ДПА вводили внутривенно до тех пор, пока опухоль U87MG не выросла до 100мм3. На ПЭТ-изображениях всего тела было выявлено высокое накопление [68Ga]DPA в опухоли после 30 и 60 минут инъекции, а также наибольшее накопление в почках и мочевом пузыре (рис. 4A). Чтобы подтвердить, что [68Ga]DPA специфически накапливается в PD-L1-положительных опухолях, в качестве отрицательного контроля была использована другая мышиная модель, содержащая клеточную линию PanNET Bon-1. Параллельный эксперимент продемонстрировал незначительное накопление [68Ga]DPA в опухолях Bon-1 через 60 минут после инъекции (рис. 4B).
Для выяснения этой разницы было проведено иммуногистохимическое окрашивание для анализа экспрессии PD-L1 в опухолевых тканях. Результаты показали, что клетки U87MG демонстрировали значительную экспрессию PD-L1 (рис. 5A, C), но не опухоль Bon-1 (рис. 5B, C). Эти данные согласуются с результатами ПЭТ. Таким образом, возможно, что различные статусы роста опухолевых клеток приводили к разной экспрессии PD-L1 (например, некроз тканей). Для проверки этого было проведено окрашивание гематоксилином и эозином (H&E). Как и ожидалось, между двумя опухолевыми тканями наблюдалась сходная морфология клеток (рис. 5D).
Ex vivo биораспределение [68Ga]DPA в опухолях U87MG
Исследование биораспределения ex vivo также проводилось на мышах, содержащих U87MG (табл. 2). Результаты показали быстрое очищение крови и большинства анализируемых органов, включая сердце, печень, легкие и мышцы. Почка накапливала наибольшее количество радиоактивности и показывала скорость клиренса 0,12% ID/(г∙мин) от 5 мин до 120 мин. Опухоль показала поглощение второго по величине индикатора поглощения во все моменты времени. Кроме того, через 5–60 минут после инъекции опухоль демонстрировала более низкую скорость клиренса индикаторов — 0,027% ID/(г∙мин). Для крови скорость клиренса составила 0,069% ID/(г∙мин), в то время как для мышц скорость клиренса составила 0,037% ID/(г∙мин).
Рисунок 1: Радиометка и стабильность [68Ga]DPA. (A) Химическая структура [68Ga]DPA и схематическое изображение его связывания с опухолевыми клетками, экспрессирующими PD-L1. (B) Кривые ВЭЖХ, показывающие радиоактивность [68Ga]DPA после инкубации с PBS или сывороткой крови мышей в течение 0,5, 2 и 4 ч. Эта цифра была изменена из Hu et al.47. Сокращения: DPA = антагонист додекапептидов; PD-L1 = запрограммированный смертельный лиганд 1; PBS = фосфатно-солевой буфер; ВЭЖХ = высокоэффективная жидкостная хроматография. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Экспрессия PD-L1 в клеточной линии U87MG. (A) Экспрессию PD-L1 в клеточной линии U87MG измеряли методом проточной цитометрии. (B) Экспрессию PD-L1 в клетках U87MG измеряли методом иммунофлуоресцентного окрашивания. Масштабная линейка = 100 мкм. Эта цифра была изменена из Hu et al.47. Сокращения: PD-L1 = программируемый смертельный лиганд 1; SSC = боковой разброс; FITC = флуоресцеина изотиоцианат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Клеточное поглощение и ингибирование [68Ga]DPA. (A) Поглощение клеток U87MG при инкубации с [68Ga]DPA (0,74 MBq/мл) или [68Ga]DPA (0,74 MBq/мл) + BMS202 (100 мкмоль/л) в течение различной продолжительности. (B) Конкурентное связывание [68Ga]DPA (0,74 MBq /мл) с клетками U87MG после инкубации с BMS202. Значение Ki отображается на панели. Эта цифра была изменена из Hu et al.47. Сокращения: DPA = антагонист додекапептидов; % AD = введенная доза (по отношению к связывающей части). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: ПЭТ-визуализация [68Ga]DPA в опухолях с избыточной экспрессией PD-L1 U87MG. (A,B) ПЭТ-КТ-изображения, показывающие распределение [68Ga]DPA у мышей с U87MG (A) и Bon-1 (отрицательный контроль, B) после внутривенной инъекции (~18,5 MBq) в течение 30 мин и 60 мин. Представлены репрезентативные проекции максимальной интенсивности (MIP) (верхняя панель) и поперечные изображения ПЭТ-КТ (нижняя панель). Расположение опухоли отмечено белыми пунктирными кружками. Эта цифра была изменена из Hu et al.47. Аббревиатуры: DPA = антагонист додекапептидов; PD-L1 = запрограммированный смертельный лиганд 1; ПЭТ-КТ = позитронно-эмиссионная томография-компьютерная томография; MIP = проекция максимальной интенсивности; p.i. = постинъекционный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Иммуногистохимический анализ опухолей, обработанных [68Ga]DPA. (А,Б) Иммуногистохимические изображения PD-L1 в срезе опухолей (A) U87MG и (B) Bon-1. (В) Увеличенные изображения отмеченных областей в пунктах А и Б. (D) H&E-окрашивание опухоли U87MG и Bon-1. Масштабные линейки = 100 мкм (C,D). Эта цифра была изменена из Hu et al.47. Сокращения: DPA = антагонист додекапептидов; PD-L1 = запрограммированный смертельный лиганд 1; H&E = гематоксилин и эозин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Индикаторов | [68млрд лет] ДПА |
| Радиохимический выход (%) | >95 |
| Молярная активность (GBq мкмоль-1) | 37 ± 8 |
| Радиохимическая чистотаa (%) | >95 |
Таблица 1: Радиомаркировка и контроль качества [68Ga]DPA. Радиохимический выход, молярная активность и радиохимическая чистота [68Ga]DPA. Данные представлены в виде среднего ± SD (n = 7). Эта таблица была изменена по сравнению с Hu et al.47. Аббревиатура: DPA = антагонист додекапептидов. aРадиохимическую чистоту [68Ga]DPA анализировали методом обратнофазовой ВЭЖХ в оптимизированных условиях: 1) колонка: YMC-Triat-C18 (4,6 мм i.d., 150 мм, 5 мм); 2) градиент растворителя: растворитель А-деионизированная вода; растворитель В-ацетонитрил (0,1% трифторуксусная кислота); время течения: 20 мин, с ацетонитрилом от 10% до 90%; расход 1 мл/мин.
| [68млрд лет] ДПА | ||||||||
| 5 мин | 30 мин | 60 мин | 120 мин | |||||
| кровь | 3.89 | ±0.43 | 1.55 | ±1.07 | 0.11 | ±0,02 | 0.05 | ±0,01 |
| сердце | 1.19 | ±0.39 | 0.52 | ±0,33 | 0.06 | ±0,02 | 0.05 | ±0,02 |
| печень | 1.06 | ±0,26 | 0.59 | ±0.43 | 0.19 | ±0,02 | 0.16 | ±0,04 |
| селезенка | 0.98 | ±0,14 | 0.68 | ±0.67 | 0.14 | ±0.06 | 0.09 | ±0.03 |
| легкое | 1.64 | ±0,42 | 1.03 | ±0,9 | 0.13 | ±0,05 | 0.09 | ±0,02 |
| почка | 19.23 | ±1.95 | 16.13 | ±1.51 | 11.5 | ±0.44 | 5.2 | ±0.31 |
| желудок | 1.54 | ±0.1 | 0.61 | ±0,35 | 0.08 | ±0,01 | 0.08 | ±0.03 |
| кишечный | 0.72 | ±0,27 | 0.47 | ±0,35 | 0.08 | ±0,02 | 0.06 | ±0.03 |
| поджелудочная железа | 1.88 | ±0,28 | 0.77 | ±0,75 | 0.16 | ±0.03 | 0.13 | ±0.03 |
| мышца | 2.21 | ±0,27 | 0.71 | ±0.37 | 0.18 | ±0,02 | 0.14 | ±0,04 |
| кость | 2.18 | ±0.11 | 0.85 | ±0.51 | 0.26 | ±0.09 | 0.14 | ±0.06 |
| мозг | 0.19 | ±0,04 | 0.11 | ±0.08 | 0.03 | ±0,01 | 0.02 | ±0,01 |
| опухоль | 4.5 | ±0,32 | 3.77 | ±0,27 | 2.99 | ±0.03 | 0.89 | ±0,19 |
| жир | 2.09 | ±0.49 | 0.81 | ±0,12 | 0.27 | ±0,07 | 0.1 | ±0,07 |
Таблица 2: Биораспределение [68Ga]DPA у мышей с опухолью U87MG после введения в течение разной продолжительности ( n = 3 на момент времени). Эта таблица изменена по сравнению с Hu et al.47. Аббревиатура: DPA = антагонист додекапептидов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Важнейшие этапы, описанные в этом методе, включают эффективное мечение 68Ga в DPA и выбор подходящего временного окна для ПЭТ-визуализации, которое должно идеально соответствовать фармакодинамической картине DPA в опухоли.
В отличие от ИГХ, ПЭТ-визуализация позволяет в режиме реального времени обнаруживать экспрессию PD-L1 по всему телу неинвазивным способом, позволяя визуализировать каждую положительную область в гетерогенной опухоли 6,7. Пептиды были выбраны в качестве лигандов, чтобы избежать недостатков антител и малых молекул. Антитела с большой молекулярной массой, как правило, имеют длительный период полураспада, что приводит к более высокой токсичности для здоровых органов. Клиренс малых молекул обычно слишком быстрый, чтобы достичь требуемой задержки опухоли. Молекулярная масса пептидов колеблется между массой антител и малых молекул. Это позволяет радиоиндикаторам на основе пептидов достигать как длительной задержки опухоли, так и хорошего проникновения в ткани с минимальной токсичностью 13,49,50,51,52,53. Важно отметить, что полезность D-пептида DPA, в отличие от обычно сообщаемых L-пептидов, придает [68Ga]DPA значительно более длительный метаболический период полувыведения. Кроме того, DPA положительно заряжен и гидрофилен in vivo, и, следовательно, обладает высокой растворимостью и может избежать неспецифического воздействия в крови, облегчая получение ПЭТ-изображений с высоким качеством визуализации.
Примечательно, что для успешного радиомечения 68Ga требуется определенный pH и отсутствие помех со стороны ионов переходных металлов, таких как катионы Cu (II) и Fe (III). В некоторых случаях загрязнение Cu2+ приводит к низкому радиохимическому выходу. Поэтому очень важно следить за тем, чтобы все контейнеры и наконечники для пипеток не были загрязнены. Кроме того, в этом методе U87MG использовали для посева опухоли. Несмотря на то, что экспрессия PD-L1 в ксенотрансплантатах U87MG была подтверждена в предыдущих исследованиях, ее экспрессия варьируется у разных животных. Таким образом, абсолютное поглощение индикатора в опухолях U87MG варьировало у разных мышей. Для обеспечения эффективного поглощения индикаторов в опухолях для ПЭТ-сканирования необходимо отобрать животных с соответствующим размером опухоли (500мм3 < объема < 100мм3).
Одним из ограничений [68Ga]DPA является то, что сродство связывания DPA с PD-L1 относительно низкое по сравнению с некоторыми другими пептидами-мишенями PD-L1, такими как WL12, что делает его неподходящим для опухолей с относительно низкой экспрессией PD-L126,47. Дальнейшая модификация D-пептида улучшит его специфическую связывающую способность. Кроме того, для усиления визуализирующего эффекта [68Ga]DPA формулировка стратегии инъекции может быть оптимизирована, например, путем одновременного введения немеченого DPA перед [68Ga]DPA для блокирования неспецифических сайтов связывания54,55,56.
В заключение, в этом исследовании был разработан неинвазивный метод в режиме реального времени для отслеживания распределения PD-L1 во всем организме живых животных с использованием [68Ga]DPA в качестве радиоиндикатора. Результаты показали относительно высокое сродство к специфическому связыванию in vivo , благоприятную стабильность и отличную способность визуализации [68Ga]DPA, что позволяет предположить, что [68Ga]DPA-PET является перспективным подходом для визуализации опухолей с гиперэкспрессией PD-L1. Кроме того, этот метод также может быть применен для лечения PD-L1-положительных опухолей при мечении DPA другими радионуклидами, такими как 177Lu и 225Ac. Таким образом, метод радиомечения DPA не только преодолевает ограничения ИГХ-зависимой диагностики, но и предоставляет новый вариант лечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Конкурирующие интересы не декларируются.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Некоммерческим фондом Центрального научно-исследовательского института Китайской академии медицинских наук (No 2022-RC350-04) и Инновационным фондом медицинских наук CAMS (No 2021-I2M-1-026, 2022-I2M-1-026-1, 02120101, 02130101 и 2022-I2M-2-002).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) | Merck | 60239-18-1 | 68Ga chelation |
| 3,3-diaminobenzidine (DAB) Kit | Sigma-Aldrich | D7304-1SET | Immunohistochemistry |
| anti-PD-L1 monoclonal antibody | Wuhan Proteintech | 17952-1-ap | Immunohistochemistry: primary antibody |
| BMS202 | Selleck | 1675203-84-5 | Competitive binding assay: inhibitor |
| BSA | Merck | V900933 | Immunofluorescent : blocking |
| DAPI | Merck | D9542 | Immunofluorescent: staining of nucleus |
| Dichloromethane (DCM) | Merck | 34856 | Solvent |
| DIPEA | Merck | 3439 | Peptide coupling |
| EDC·HCl | Merck | E6383 | Activation of DOTA |
| FBS | Gibco | 10099 | Cell culture: supplement |
| FITC-conjugated anti-human IgG Fc Antibody | Biolegend | 409310 | Immunofluorescent: secondary antibody |
| FITC-conjugated anti PD-L1 antibody | Biolegend | 393606 | Flow cytometry: direct antibody |
| HCTU | Energy Chemical | E070004-25g | Peptide coupling |
| HRP labeled goat anti-rabbit antibody | Servicebio | GB23303 | Immunohistochemistry: secondary antibody |
| Hydroxysuccinimide (NHS) | Merck | 130672 | Activation of DOTA |
| MeCN | Merck | PHR1551 | Solvent |
| Morpholine | Merck | 8.06127 | Fmoc- deprotection |
| NMP | Merck | 8.06072 | Solevent |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Fixation of tissues |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture: buffer |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 10378016 | Cell culture: supplement |
| RIA tube | PolyLab | P10301A | As tissue sample container |
| RPMI-1640 medium | Gibco | 11875093 | Cell culture: basic medium |
| Sodium acetate | Merck | 1.06264 | Salt for buffer |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Cell culture: dissociation agent |
| U87MG cell line | Procell Life Science & Technology Co | CL-0238 | Cell model |
| Equipment | |||
| 68Ge/68Ga generator | Isotope Technologies Munich, ITM | Not applicable | Generation of [68Ga] |
| Autogamma counter | Perkin Elmer | Wizard2 | Detection of radioactivity |
| Confocal fluorescent microscopy | Keyence | Observation of immunofluorescent results | |
| Flow cytometer | Becton Dickinson, BD | LSRII | Monitoring the PD-L1 positive cells |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | SHIMAZU | LC-20AT | Purification of DPA peptide |
| PET scanner | Siemens Medical Solutions | Inveon MultiModality System | PET imaging |
| Optical microscopy | Nikon | Eclipse E100 | Observation of immunohistochemistry results |
| Solid phase peptide synthesizer | Promega Vac-Man Laboratory Vacuum Manifold | LOT#11101 | Synthesis of DPA-DOTA peptide |
| Software | |||
| ASIPro | Siemens Medical Solutions | Not applicable | Analysis of PET-CT results |
| FlowJo | Becton Dickinson, BD | FlowJo 7.6.1 | Analysis of the flow cytometer results |
| Inveon Acquisition Workplace (IAW) | Siemens Medical Solutions | Not applicable | Management of PET mechine |
| Prism | Graphpad | Prism 8.0 | Analysis of the data |
References
- Doroshow, D. B., et al. PD-L1 as a biomarker of response to immune-checkpoint inhibitors. Natire Reviews Clinical Oncology. 18 (6), 345-362 (2021).
- Krutzek, F., Kopka, K., Stadlbauer, S. Development of radiotracers for imaging of the PD-1/PD-L1 axis. Pharmaceuticals. 15 (6), 747 (2022).
- Topalian, S. L., Drake, C. G., Pardoll, D. M. Immune checkpoint blockade: a common denominator approach to cancer therapy. Cancer Cell. 27 (4), 450-461 (2015).
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Xiao, Z., et al. PEIGel: A biocompatible and injectable scaffold with innate immune adjuvanticity for synergized local immunotherapy. Materials Today Bio. 15, 100297 (2022).
- Teng, M. W. L., Ngiow, S. F., Ribas, A., Smyth, M. J. Classifying cancers based on T-cell infiltration and PD-L1. Cancer Research. 75 (11), 2139-2145 (2015).
- Dolled-Filhart, M., et al. Development of a companion diagnostic for pembrolizumab in non-small cell lung cancer using immunohistochemistry for programmed death ligand-1. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 140 (11), 1243-1249 (2016).
- Meng, X. J., Huang, Z. Q., Teng, F. F., Xing, L. G., Yu, J. M. Predictive biomarkers in PD-1/PD-L1 checkpoint blockade immunotherapy. Cancer Treatment Reviews. 41 (10), 868-876 (2015).
- Hakozaki, T., Hosomi, Y., Kitadai, R., Kitagawa, S., Okuma, Y. Efficacy of immune checkpoint inhibitor monotherapy for patients with massive non-small-cell lung cancer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 146 (11), 2957-2966 (2020).
- Haslam, A., Prasad, V. Estimation of the percentage of US patients with cancer who are eligible for and respond to checkpoint inhibitor immunotherapy drugs. Jama Network Open. 2 (5), 192535 (2019).
- Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S.
- Zhang, L., et al. Recent developments on PET radiotracers for TSPO and their applications in neuroimaging. Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (2), 373-393 (2021).
- Sun, J., et al. Imaging-guided targeted radionuclide tumor therapy: From concept to clinical translation. Advanced Drug Delivery Reviews. 190, 114538 (2022).
- Xu, M., et al. Preclinical study of a fully human Anti-PD-L1 antibody as a theranostic agent for cancer immunotherapy. Molecular Pharmaceutics. 15 (10), 4426-4433 (2018).
- Niemeijer, A. N., et al. Whole body PD-1 and PD-L1 positron emission tomography in patients with non-small-cell lung cancer. Nature Communications. 9 (1), 4664 (2018).
- Mayer, A. T., et al. Practical immuno-PET radiotracer design considerations for human immune checkpoint imaging. Journal of Nuclear Medicine. 58 (4), 538-546 (2017).
- Lv, G., et al. PET Imaging of tumor PD-L1 expression with a highly specific nonblocking single-domain antibody. Journal of Nuclear Medicine. 61 (1), 117-122 (2020).
- Li, D., et al. Immuno-PET imaging of 89Zr labeled anti-PD-L1 domain antibody. Molecular Pharmaceutics. 15 (4), 1674-1681 (2018).
- Lesniak, W. G., et al. PD-L1 detection in tumors using [(64)Cu]Atezolizumab with PET. Bioconjugate Chemistry. 27 (64), 2103-2110 (2016).
- Kristensen, L. K., et al. CD4(+) and CD8a(+) PET imaging predicts response to novel PD-1 checkpoint inhibitor: studies of Sym021 in syngeneic mouse cancer models. Theranostics. 9 (26), 8221-8238 (2019).
- Christensen, C., Kristensen, L. K., Alfsen, M. Z., Nielsen, C. H., Kjaer, A. Quantitative PET imaging of PD-L1 expression in xenograft and syngeneic tumour models using a site-specifically labelled PD-L1 antibody. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 47 (5), 1302-1313 (2020).
- Bensch, F., et al. 89Zr-atezolizumab imaging as a non-invasive approach to assess clinical response to PD-L1 blockade in cancer. Nature Medicine. 24 (12), 1852-1858 (2018).
- Gonzalez Trotter, D. E., et al. In vivo imaging of the programmed death ligand 1 by 18F PET. Journal of Nuclear Medicine. 58 (11), 1852-1857 (2017).
- Lv, G., et al. Promising potential of a 18F-labelled small-molecular radiotracer to evaluate PD-L1 expression in tumors by PET imaging. Bioorganic Chemistry. 115, 105294 (2021).
- Miao, Y., et al. One-step radiosynthesis and initial evaluation of a small molecule PET tracer for PD-L1 imaging. Bioorganic & Medicinal Chemical Letters. 30 (24), 127572 (2020).
- Kumar, D., et al. Peptide-based PET quantifies target engagement of PD-L1 therapeutics. The Journal of Clinical Investigation. 129 (2), 616-630 (2019).
- Powles, T., et al. MPDL3280A (anti-PD-L1) treatment leads to clinical activity in metastatic bladder cancer. Nature. 515 (7528), 558-562 (2014).
- Herbst, R. S., et al. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature. 515 (7528), 563-567 (2014).
- Marciscano, A. E., Gulley, J. L. Avelumab demonstrates promise in advanced NSCLC. Oncotarget. 8 (61), 102767-102768 (2017).
- Vaddepally, R. K., Kharel, P., Pandey, R., Garje, R., Chandra, A. B. Review of indications of FDA-approved immune checkpoint inhibitors per NCCN guidelines with the level of evidence. Cancers. 12 (3), 738 (2020).
- Antonia, S. J., et al. Durvalumab after chemoradiotherapy in stage III non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 377 (20), 1919-1929 (2017).
- Wang, D. Y., et al. Fatal toxic effects associated with immune checkpoint inhibitors: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 4 (12), 1721-1728 (2018).
- Sgouros, G., Bodei, L., McDevitt, M. R., Nedrow, J. R. Radiopharmaceutical therapy in cancer: clinical advances and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (9), 589-608 (2020).
- (US) M. M. M, et al. Macrocyclic inhibitors of the pd-1/pd-l1 and cd80(b7-1)/pd-l1 protein/protein interactions. United States patent. , US-2017260237-A1 (2014).
- Chatterjee, S., et al. Rapid PD-L1 detection in tumors with PET using a highly specific peptide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 258-263 (2017).
- De Silva, R. A., et al. Peptide-based 68Ga-PET radiotracer for imaging PD-L1 expression in cancer. Molecular Pharmaceutics. 15 (9), 3946-3952 (2018).
- Lesniak, W. G., et al. Development of [18F]FPy-WL12 as a PD-L1 specific PET imaging peptide. Molecular Imaging. 18, 1536012119852189 (2019).
- Zhou, X., et al. First-in-humans evaluation of a PD-L1-binding peptide PET radiotracer in non-small cell lung cancer patients. Journal of Nuclear Medicine. 63 (4), 536-542 (2022).
- Hu, K., et al. Developing native peptide-based radiotracers for PD-L1 PET imaging and improving imaging contrast by pegylation. Chemical Communications. 55 (29), 4162-4165 (2019).
- Liu, H., et al. A novel small cyclic peptide-based 68Ga-Radiotracer for positron emission tomography imaging of PD-L1 expression in tumors. Molecular Pharmaceutics. 19 (1), 138-147 (2022).
- Rabideau, A. E., Pentelute, B. L. A D-amino acid at the N-terminus of a protein abrogates its degradation by the N-end rule pathway. ACS Central Science. 1 (8), 423-430 (2015).
- Uppalapati, M., et al. A potent D-protein antagonist of VEGF-A is nonimmunogenic, metabolically stable, and longer-circulating in vivo. ACS Chemical Biology. 11 (4), 1058-1065 (2016).
- Garton, M., et al. Method to generate highly stable D-amino acid analogs of bioactive helical peptides using a mirror image of the entire PDB. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1505-1510 (2018).
- Jia, F. J., et al. D-amino acid substitution enhances the stability of antimicrobial peptide polybia-CP. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (10), 916-925 (2017).
- Carmona, G., Rodriguez, A., Juarez, D., Corzo, G., Villegas, E. Improved protease stability of the antimicrobial peptide Pin2 substituted with D-amino acids. Protein Journal. 32 (6), 456-466 (2013).
- Feng, Z., Xu, B. Inspiration from the mirror: D-amino acid containing peptides in biomedical approaches. Biomolecular Concepts. 7 (3), 179-187 (2016).
- Hu, K., et al. Whole-body PET tracking of a d-dodecapeptide and its radiotheranostic potential for PD-L1 overexpressing tumors. Acta Pharmaceutica Sinica. B. 12 (3), 1363-1376 (2022).
- Qiu, X. Y., et al. PD-L1 confers glioblastoma multiforme malignancy via Ras binding and Ras/Erk/EMT activation. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864, 1754-1769 (2018).
- Hu, K., et al. Development of a stable peptide-based PET tracer for detecting CD133-expressing cancer cells. ACS Omega. 7 (1), 334-341 (2021).
- Jin, Z. -H., et al. Radiotheranostic agent 64Cu-cyclam-RAFT-c(-RGDfK-)4 for management of peritoneal metastasis in ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 26 (23), 6230-6241 (2020).
- Hu, K., et al. Harnessing the PD-L1 interface peptide for positron emission tomography imaging of the PD-1 immune checkpoint. RSC Chemical Biology. 1 (4), 214-224 (2020).
- Hu, K., et al. PET imaging of VEGFR with a novel 64Cu-labeled peptide. ACS Omega. 5 (15), 8508-8514 (2020).
- Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
- Zhao, J., et al. Concurrent injection of unlabeled antibodies allows positron emission tomography imaging of programmed cell death ligand 1 expression in an orthotopic pancreatic tumor model. ACS Omega. 5 (15), 8474-8482 (2020).
- Moroz, A., et al. A preclinical assessment of 89Zr-atezolizumab identifies a requirement for carrier added formulations not observed with 89Zr-C4. Bioconjugate Chemistry. 29 (10), 3476-3482 (2018).
- Nedrow, J. R., et al. Imaging of programmed cell death ligand 1: impact of protein concentration on distribution of anti-PD-L1 SPECT agents in an immunocompetent murine model of melanoma. Journal of Nuclear Medicine. 58 (10), 1560-1566 (2017).
