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Cancer Research

प्री-क्लिनिकल ड्रग टेस्टिंग के लिए डिम्बग्रंथि के कैंसर रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड मॉडल

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65068
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Washington University of Medicine in St. Louis

Summary

हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसका उपयोग रोगी-व्युत्पन्न डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनोइड के साथ चिकित्सीय दवा परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

डिम्बग्रंथि के कैंसर एक घातक स्त्री रोग संबंधी कैंसर है और संयुक्त राज्य अमेरिका में महिलाओं के बीच कैंसर की मौत का पांचवां प्रमुख कारण है। स्वास्थ्य देखभाल को आगे बढ़ाने और रोगी के परिणामों में सुधार के लिए नई दवा उपचार विकसित करना महत्वपूर्ण है। ऑर्गेनोइड इन-विट्रो त्रि-आयामी बहुकोशिकीय लघु अंग हैं। डिम्बग्रंथि के कैंसर के रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड (पीडीओ) मॉडल दवा स्क्रीनिंग के लिए इष्टतम हो सकते हैं क्योंकि वे दो-आयामी सेल संस्कृति मॉडल की तुलना में ब्याज के ऊतकों को अधिक सटीक रूप से पुन: व्यवस्थित करते हैं और रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोग्राफ्ट की तुलना में सस्ती हैं। इसके अलावा, डिम्बग्रंथि के कैंसर पीडीओ चर ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट और आनुवंशिक पृष्ठभूमि की नकल करते हैं जो आमतौर पर डिम्बग्रंथि के कैंसर में मनाया जाता है। यहां, एक विधि का वर्णन किया गया है जिसका उपयोग डिम्बग्रंथि के कैंसर ऊतक और जलोदर से प्राप्त पीडीओ पर पारंपरिक और उपन्यास दवाओं का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। एक ल्यूमिनेसेंस-आधारित एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) परख का उपयोग व्यवहार्यता, विकास दर और दवा संवेदनशीलता को मापने के लिए किया जाता है। पीडीओ में ड्रग स्क्रीन 7-10 दिनों में पूरी की जा सकती है, जो ऑर्गेनॉइड गठन और दवा उपचार की दर पर निर्भर करती है।

Introduction

हालांकि दुर्लभ, डिम्बग्रंथि के कैंसर सबसे घातक स्त्री रोग संबंधी कैंसर 1,2 में से एक है। नए उपचार विकसित करने में एक चुनौती यह है कि डिम्बग्रंथि का कैंसर विषम है, और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट रोगियों के बीच बहुत भिन्न होता है। इसके अतिरिक्त, कई डिम्बग्रंथि के कैंसर प्लैटिनम आधारित कीमोथेरेपी और पाली (एडीपी-राइबोज) पोलीमरेज़ अवरोधकों के प्रतिरोध का विकास, अधिक से अधिक चिकित्सीय विकल्प 3,4,5 के लिए की आवश्यकता पर प्रकाश डाला.

एक दृष्टिकोण जो नए चिकित्सीय की पहचान करने में उपयोगी हो सकता है, वह रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड (पीडीओ) का उपयोग कर रहा है। ऑर्गेनोइड कई सेल प्रकारों के त्रि-आयामी क्लस्टर हैं जो इन विट्रो "मिनी-ऑर्गन"6,7,8,9,10में स्वयं-व्यवस्थित और बनते हैं। Organoids महत्वपूर्ण ऊतक आकृति विज्ञान और जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल11,12 recapitulate कर सकते हैं. पहले ऑर्गेनोइड में से कुछ चूहों और मनुष्यों 8,9,13 दोनों से आंतों, गैस्ट्रिक और कोलन कैंसर कोशिकाओं से प्राप्त किए गए थे। लंबे समय तक रहने वाले ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों को मूत्राशय, बृहदान्त्र, पेट, अग्न्याशय, मस्तिष्क, रेटिना और यकृत14,15,16सहित सौम्य और घातक ऊतकों की एक विस्तृत श्रृंखला से स्थापित किया गया है। हम पहले डिम्बग्रंथि के कैंसर ट्यूमर और जलोदर नमूने17 से पीडीओ स्थापित करने के तरीकों का प्रदर्शन किया. पीडीओ आणविक विशेषताओं, सेलुलर तंत्र, और उपन्यास दवा उपचार 18,19,20 का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पीडीओ दवा स्क्रीनिंग के लिए पारंपरिक दो आयामी प्राथमिक सेल संस्कृतियों पर कई फायदे हैं। हालांकि प्राथमिक दो आयामी संस्कृतियों दवा स्क्रीन के लिए एक कम लागत विधि कर रहे हैं, प्राथमिक सेल संस्कृतियों एकल कोशिका प्रकार हैं और ट्यूमर 21,22,23 के तीन आयामी वास्तुकला की कमी. फिर भी, पीडीओ एक कीमती संसाधन हैं, और चिकित्सीय दवा स्क्रीनिंग में उनके उपयोग को अनुकूलित करने के लिए लागत प्रभावी प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है।

यह लेख ज्ञात या उम्मीदवार दवाओं के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए डिम्बग्रंथि के कैंसर पीडीओ का उपयोग करने के लिए इन विट्रो विधि में वर्णन करता है। जबकि पीडीओ का उपयोग कर वर्तमान मध्यम और उच्च throughput दवा स्क्रीन महंगा स्वचालित वितरण उपकरणों24,25,26 की आवश्यकता होती है, इस लागत प्रभावी विधि आसानी से उपलब्ध बुनियादी प्रयोगशाला की आपूर्ति और एक मानक 96 अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप (चित्रा 1 ए) में एक एटीपी-आधारित सेल व्यवहार्यता परख का उपयोग करता है. इस विधि उपन्यास डिम्बग्रंथि के कैंसर दवाओं के प्रारंभिक परीक्षणों की सुविधा प्रदान करेगा बड़ा स्क्रीन27,28 करने के लिए स्केलिंग से पहले. हालांकि डिम्बग्रंथि के कैंसर पीडीओ का उपयोग यहां किया जाता है, इस विधि को अन्य कैंसर ऑर्गेनॉइड मॉडल पर लागू किया जा सकता है।

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Protocol

इस शोध के लिए मानव नमूनों के संग्रह को वाशिंगटन यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था। 18 वर्ष से अधिक आयु के सभी पात्र रोगियों में उच्च श्रेणी के सीरस डिम्बग्रंथि के कैंसर का निदान या अनुमानित निदान था और वे सूचित सहमति प्रदान करने के इच्छुक और सक्षम थे। प्राथमिक या मेटास्टैटिक साइटों से ट्यूमर ऊतक, जलोदर और फुफ्फुस द्रव के अलावा, देखभाल के समय सहमति वाले रोगियों से प्राप्त किए गए थे।

1. व्यवहार्यता परख के लिए स्थापित पीडीओ का चयन

नोट: आमतौर पर, ये ऑर्गेनोइड पहले पांच मार्ग के भीतर होते हैं। जैसा कि पहले वर्णित है, डिम्बग्रंथि के कैंसर पीडीओ तहखाने झिल्ली निकालने (बीएमई) जैसे कल्ट्रेक्स या मैट्रिगेल17 ( सामग्री की तालिकादेखें) में प्राथमिक सेल निलंबन को निलंबित करके बनते हैं।

  1. पीडीओ परख का सबसे अच्छा दक्षता के लिए 24-72 घंटे का एक कथित दोहरीकरण समय होना चाहिए. पासिंग/चढ़ाना के बाद ऑर्गेनोइड बनने में लगने वाले दिनों की संख्या का नेत्रहीन निर्धारण करके कथित दोहरीकरण समय का अनुमान लगाएं।
    नोट: हमारे अनुभव में, ऑर्गेनोइड जो बनाने में तीन दिन से अधिक समय लेते हैं, उनका उपयोग इस विकास अवरोध परख के लिए नहीं किया जा सकता है।
  2. दवाओं की पहचान करें और परीक्षण करने के लिए सांद्रता की एक श्रृंखला का चयन करें (उदाहरण के लिए, कार्बोप्लाटिन, 0-50 माइक्रोन, सामग्री की तालिकादेखें)।
  3. प्लेट सेटअप निर्धारित करें। इस परख तीन प्रतियों में किया जाएगा, दवाओं और सांद्रता है कि एक प्लेट पर परीक्षण किया जा सकता है की संख्या सीमित.
    नोट: परख करने से पहले चयनित पीडीओ लाइनों को ध्यान से देखा जाना चाहिए। स्थापित डिम्बग्रंथि के कैंसर पीडीओ ट्यूमर की तरह नवोदित आकार(चित्रा 1बी)के साथ बहुकोशिकीय ठोस और खोखले गोले बनाते हैं। पीडीओ आकृति विज्ञान, जीनोमिक प्रोफाइल, आदि, परख29-33 प्रदर्शन करने से पहले रोगी के नमूने (जब संभव) की तुलना में किया जाना चाहिए. डिम्बग्रंथि के कैंसर पीडीओ प्राथमिक और मेटास्टैटिक ट्यूमर के नमूनों और जलोदर17 से उत्पन्न किया जा सकता है।

2. व्यवहार्यता परख के लिए अभिकर्मक तैयारी

  1. बेस मीडिया: उन्नत DMEM/F12 में, 1% (v/v) पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1x ग्लूटामैक्स, और 1% (v/v)HEPES17 जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. पहले प्रकाशित रिपोर्ट17 निम्नलिखित डिम्बग्रंथि के कैंसर organoids के लिए अग्रिम Organoid मीडिया तैयार.

3. ऑर्गेनोइड का चढ़ाना (~ दिन -2)

नोट: दवाओं को जोड़ने से 1-3 दिन पहले यह कदम उठाया जाना चाहिए। शुरुआत से पहले, सभी अभिकर्मकों (बेस मीडिया, एडवांस ऑर्गेनॉइड मीडिया, और ऑर्गेनॉइड पृथक्करण अभिकर्मक; सामग्री की तालिकादेखें) को पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। बीएमई को बर्फ के पानी के स्नान में पिघलाएं।

  1. ब्याज के organoids 70% -90% संगम कर रहे हैं कि क्या पुष्टि करने के लिए एक brightfield खुर्दबीन का प्रयोग करें.
    नोट: भविष्य के संदर्भ के लिए ऑर्गेनोइड की छवियों को सहेजने की अनुशंसा की जाती है।
  2. गर्म बेस मीडिया के 1-2 एमएल को अच्छी तरह से युक्त ऑर्गेनोइड और पिपेट को यंत्रवत् रूप से बीएमई युक्त ऑर्गेनोइड को अलग करने के लिए ऊपर और नीचे जोड़ें। पूरे समाधान को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब17 में स्थानांतरित करें।
    नोट: आमतौर पर, मीडिया का 1-2 एमएल बीएमई को ठीक से पतला करने के लिए पर्याप्त है। एक ही रोगी और मार्ग के ऑर्गेनोइड को जोड़ा जा सकता है।
  3. 5-10 एस के लिए भंवर आगे कोशिकाओं को अलग करने के लिए, और कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए 1107 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र.
  4. एक एकल चैनल विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें और त्यागें. 1 एमएल ऑर्गेनॉइड पृथक्करण अभिकर्मक ( सामग्री की तालिकादेखें) में ऑर्गेनोइड को फिर से निलंबित करें और 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए सेते हैं.
    1. यदि शेष बीएमई की वजह से गोली अभी भी जिलेटिनस है, तो बेस मीडिया का एक अतिरिक्त 1 एमएल, 5-10 एस के लिए भंवर जोड़ें, और सेंट्रीफ्यूजेशन दोहराएं।
  5. आरटी पर 5 मिनट के लिए 1107 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें और बेस मीडिया के 1 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
  6. एक स्वचालित सेल काउंटर ( सामग्री की तालिकादेखें) या एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके प्रत्येक पीडीओ संस्कृति में कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
  7. 25% बेस मीडिया और 75% बीएमई के 10 माइक्रोन प्रति 20,000 कोशिकाओं पर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। मीडिया में ऑर्गेनोइड को निलंबित करके और बीएमई के साथ मिश्रण करके ऐसा करें।
  8. एक काले अपारदर्शी 96-अच्छी प्लेट के एक कुएं में पुन: निलंबित बीएमई + पीडीओ कोशिकाओं की एक 3 माइक्रोन बूंदों को प्लेट करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। बूंदों को प्रत्येक कुएं के केंद्र में रखें। प्रत्येक दवा एकाग्रता को तीन प्रतियों में प्लेट करें।
    नोट: चूंकि सेल व्यवहार्यता परख ल्यूमिनेसेंस-आधारित है, इसलिए पृष्ठभूमि से बचने के लिए काले अपारदर्शी प्लेटों का उपयोग करना सबसे अच्छा है। पारदर्शी प्लेटों परख के दौरान organoids कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन प्लेटों के नीचे luminescence को मापने से पहले अपारदर्शी टेप के साथ कवर किया जाना चाहिए.
  9. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में थाली सेते हैं.
  10. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए अग्रिम Organoid मीडिया के 100 माइक्रोन जोड़ें. 24-72 घंटे के लिए थाली सेते हैं (माना पीडीओ दोहरीकरण समय के अनुसार निर्धारित करें). रिक्त के रूप में उपयोग के लिए एक खाली अच्छी तरह से अग्रिम ऑर्गेनॉइड मीडिया के 100 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: लक्ष्य ऑर्गेनोइड को बनाने की अनुमति देना है।
  11. वैकल्पिक: विकास दर विश्लेषण के लिए, एक अलग प्लेट में अतिरिक्त ट्रिपल पीडीओ प्लेट। यह समय = 0 पर कोशिकाओं की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा और धारा 5 में वर्णित व्यवहार्यता परख का उपयोग कर 0 दिन पर परख किया जाना चाहिए.

4. दिन 0 पर व्यवहार्यता परख के लिए दवाओं के अलावा

नोट: दिन 0 उस दिन को संदर्भित करता है जब दवाओं को पूरी तरह से गठित ऑर्गेनोइड में जोड़ा जाता है।

  1. वांछित सांद्रता के लिए अग्रिम ऑर्गेनॉइड मीडिया में चयनित दवाओं को पतला करें। कमजोर पड़ने 1.5 एमएल ट्यूबों में या मीडिया बांटने के लिए एक बहु चैनल विंदुक के उपयोग के लिए अनुमति देगा जो 96 अच्छी तरह से थाली, एक पूर्व सेट अप में बनाया जा सकता है.
    नोट: दवाओं को निर्माता द्वारा सुझाए गए विलायक में फिर से निलंबित किया जाना चाहिए, जैसे कि डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड। इस अध्ययन के लिए, एडवांस ऑर्गेनॉइड मीडिया में कार्बोप्लाटिन के निम्नलिखित कमजोर पड़ने वाले थे: 1, 5, 10, 25, 50 और 75 माइक्रोन।
  2. एक एकल या बहु चैनल विंदुक के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से से मीडिया निकालें, स्पर्श या पीडीओ / बीएमई छोटी बूंद को परेशान नहीं सावधान किया जा रहा है.
  3. प्रत्येक अच्छी तरह से अग्रिम ऑर्गेनॉइड मीडिया और वांछित दवा (ओं) के 100 माइक्रोन जोड़ें। तीन नियंत्रण कुओं के लिए ताजा मीडिया जोड़ने के लिए सुनिश्चित करें.
    नोट: दवा सांद्रता अलग-अलग होगी और वैज्ञानिक प्रश्न और कार्रवाई के दवा तंत्र पर निर्भर करेगी। क्या सांद्रता का उपयोग करने का निर्णय लेते समय, हम तुलनीय 2 डी सेल लाइनों (जैसे, अमर डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल लाइनों) में पहले से स्थापित दवा सांद्रता के साथ शुरू करते हैं। ऑर्गेनोइड पर कोई मनाया प्रभाव नहीं होने पर सांद्रता बढ़ाने की आवश्यकता हो सकती है।
  4. मीडिया और दवाओं को आवश्यकतानुसार ताज़ा करें (चरण 4.1-4.3 दोहराएं)। मीडिया को ताज़ा करने की आवश्यकता होगी या नहीं परख की लंबाई, दवा की जैविक गतिविधि और दवा के आधे जीवन पर निर्भर करता है। एक सप्ताह से अधिक परख के लिए, मीडिया को कम से कम एक बार ताज़ा करने की आवश्यकता होगी।

5. रीडआउट के लिए व्यवहार्यता परख समाप्त करना (~ दिन 7)

नोट: यह कदम 7-10 दिनों पर किया जा सकता है। परख लंबाई आधा जीवन और दवाओं के pharmacodynamics परीक्षण किया जा रहा है के अनुसार निर्धारित किया जाना चाहिए.

  1. व्यवहार्यता परख अभिकर्मकों अंधेरे में कमरे के तापमान तक पहुँचने के लिए अनुमति दें. पिघलना समय को कम करने के लिए रात भर (अंधेरे में) 4 डिग्री सेल्सियस पर अभिकर्मकों की दुकान.
  2. सेल संस्कृति इनक्यूबेटर से परख प्लेट निकालें और यह 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान के अनुकूल करने के लिए अनुमति देते हैं. प्लेट को अंधेरे में अभ्यस्त नहीं होना पड़ता है।
  3. प्रत्येक अच्छी तरह से (200 माइक्रोन की कुल मात्रा के लिए) व्यवहार्यता परख अभिकर्मक ( सामग्री की तालिकादेखें) के 100 माइक्रोन जोड़ें, और 5 मिन (80 आरपीएम) के लिए प्लेट-शेकर पर रखें। प्रकार के बरतन से थाली निकालें और कमरे के तापमान पर एक अतिरिक्त 25 मिनट के लिए सेते हैं. सुनिश्चित करें कि प्लेट हमेशा पन्नी या एक अपारदर्शी बॉक्स के साथ कवर करके प्रकाश से सुरक्षित है।
  4. बायोलुमिनेसेंस प्लेट रीडर चालू करें और आई-कंट्रोल सॉफ्टवेयर खोलें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  5. Connect to के अंतर्गत: साधन का नाम, अनंत 200Pro चुनें.
  6. Luminescence और डिफ़ॉल्ट स्क्रिप्ट का चयन करें।
  7. ड्रॉप-डाउन मेनू से, प्लेट प्रकार [BD96fb_Falcon-BD] Falcon 96 Flat Black चुनें।
  8. निर्धारित करें कि प्लेट के हिस्से के तहत संबंधित कुओं को पढ़ने और हाइलाइट करने के लिए कौन से कुएं हैं।
  9. स्क्रीन के बाईं ओर माप के तहत, प्लेट के हिस्से के नीचे Luminescence खींचें और छोड़ें।
  10. ल्यूमिनेसेंस मापदंडों का चयन करें: क्षीणन: कोई नहीं; एकीकरण समय: 1000 एमएस; व्यवस्थित समय: 0 एमएस।
  11. प्लेट से कवर निकालें और इसे प्लेट रीडर में लोड करें। शुरू करने के लिए स्टार्ट दबाएं।
  12. पूरा होने पर, डेटा निर्यात करें और सहेजें।

6. डेटा विश्लेषण

  1. प्रतिशत सेल व्यवहार्यता की गणना करें।
    1. ब्लैंक करेक्टेड रीडिंग के लिए हर कुएं से "रिक्त" घटाएं। अगला, तीन नियंत्रण कुओं औसत से नियंत्रण औसत की गणना.
    2. प्रत्येक कुएं में व्यवहार्य कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना करने के लिए निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करें: (प्रायोगिक अच्छी तरह से / नियंत्रण औसत) x 100
    3. विश्लेषण सॉफ्टवेयर में परिणामी डेटा ग्राफ ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. विकास दर (जीआर) मेट्रिक्स की जांच करें।
    1. प्रकाशित रिपोर्ट34 के अनुसार जीआर मेट्रिक्स की मैन्युअल रूप से गणना करें।
    2. वैकल्पिक रूप से, मीट्रिक35 उत्पन्न करने के लिए ऑनलाइन जीआर कैलकुलेटर (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें। दिन 0 माप का उपयोग "cell_count_time0" के रूप में करें, जो अनुपचारित पीडीओ की वृद्धि दर को दर्शाता है।
    3. डेटा और ग्राफ़ निर्यात करें।

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Representative Results

ये परिणाम कीमोथेरेपी दवा कार्बोप्लाटिन के लिए दो पीडीओ की प्रतिक्रिया को दर्शाते हैं, जिसका उपयोग डिम्बग्रंथि के कैंसर के इलाज के लिए किया जाता है। ऑर्गेनोइड ट्यूमर बायोप्सी (पीडीओ # 1) और जलोदर (पीडीओ # 2) से प्राप्त हुए थे। इन ऑर्गेनोइड को उनके कथित दोहरीकरण समय (1-2 दिन) और रूपात्मक उपस्थिति (कई बड़े ऑर्गेनोइड के गठन) के आधार पर चुना गया था। पीडीओ # 1 और पीडीओ # 2 दोनों को दिन -2 पर, मार्ग दो पर चढ़ाया गया था, और कार्बोप्लाटिन को दिन 0 पर जोड़ा गया था। हमने एडवांस ऑर्गेनॉइड मीडिया में पतला निम्नलिखित कार्बोप्लाटिन सांद्रता का परीक्षण किया: 1, 5, 10, 25, 50 और 75 माइक्रोन। 7 दिन पर प्रयोग के समापन पर, व्यवहार्यता परख अभिकर्मक थाली में जोड़ा गया था, और परिणामों का विश्लेषण किया गया. चित्रा 2 ए कार्बोप्लाटिन उपचार के बाद जीवित कोशिकाओं के प्रतिशत को दर्शाता है।

इसके बाद, डेटा का विश्लेषण करने के लिए ऑनलाइन जीआर कैलकुलेटर का उपयोग किया गया था। सेल गिनती डेटा की अनुपस्थिति में, व्यवहार्यता परख में मापा ल्यूमिनेसेंस मूल्यों का उपयोग किया गया था। जीआर मेट्रिक्स निर्यात करने के बाद, जीआर मूल्यों को रेखांकन किया गया था, जो एक एकल कोशिका विभाजन34 के लिए सामान्यीकृत उपचारित और अनुपचारित स्थितियों में कथित वृद्धि दर के बीच अनुपात हैं। इन मूल्यों को तब कार्बोप्लाटिन सांद्रता (चित्रा 2बी)के खिलाफ प्लॉट किया गया था। तालिका 1 जीआर मेट्रिक्स को सारांशित करती है, जिसमें संबंधित नियंत्रण और उपचारित सेल दोहरीकरण समय और जीआर एरिया ओवर द कर्व (जीआरएओसी) शामिल है, जो34 परीक्षण किए गए कार्बोप्लाटिन सांद्रता की एक श्रृंखला पर खुराक-प्रतिक्रिया वक्र को एकीकृत करता है। किसी विशेष दवा के प्रति संवेदनशीलता जीआर50 मूल्य की व्याख्या करके निर्धारित की जा सकती है, जिस एकाग्रता पर दवा का आधा अधिकतम प्रभाव होता है। उदाहरण के लिए, पीडीओ # 1 के लिए जीआर50 मान पीडीओ # 2 (4.85 माइक्रोनबनाम 0.97 माइक्रोन) की तुलना में बहुत अधिक है, यह दर्शाता है कि पीडीओ # 1 पीडीओ # 2 की तुलना में प्लैटिनम कीमोथेरेपी के लिए अधिक प्रतिरोधी है।

Figure 1
चित्रा 1: दवा स्क्रीनिंग से पहले रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स। (ए) पीडीओ दवा स्क्रीन के लिए प्रायोगिक रूपरेखा। पीडीओ लाइन के दोहरीकरण समय और दवा जोखिम समय को देखते हुए, प्रयोगात्मक योजना को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। (बी) दो डिम्बग्रंथि के कैंसर पीडीओ लाइनों (# 1 और # 2) के प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवियां (40x)। स्केल बार = 50 माइक्रोन। संक्षिप्ताक्षर: पीडीओ = रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: कार्बोप्लाटिन उपचार के बाद डिम्बग्रंथि के कैंसर पीडीओ के प्रतिनिधि परिणाम। (ए) दो पीडीओ लाइनों को सात दिनों के लिए कार्बोप्लाटिन की बढ़ती सांद्रता के साथ इलाज किया गया था। एक्स-अक्ष कार्बोप्लाटिन एकाग्रता दिखाता है; वाई-अक्ष ऑर्गेनोइड (कोई कार्बोप्लाटिन) को नियंत्रित करने के लिए सामान्यीकृत जीवित कोशिकाओं का% प्रदर्शित करता है। परख दो जैविक प्रतिकृतियों के साथ तीन प्रतियों में पूरा किया गया। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन को निरूपित करती हैं। (बी) जीआर-वैल्यू ग्राफ लॉगरिदमिक कार्बोप्लाटिन एकाग्रता (एक्स-एक्सिस) और जीआर मान (वाई-एक्सिस) का प्रतिनिधित्व करता है। ये मान ऑनलाइन जीआर कैलकुलेटर में उत्पन्न किए गए थे। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का संकेत देती हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

उपचार नियंत्रण कक्ष दोहरीकरण समय उपचारित सेल दोहरीकरण समय जीआर50 GR_AOC
पीडीओ #1 कार्बोप्लाटिन 0.744 0.112 4.85 1.28
पीडीओ #2 कार्बोप्लाटिन 0.972 0.0532 0.97 1.51

तालिका 1: जीआर कैलकुलेटर में उत्पन्न नियंत्रण कक्ष दोहरीकरण समय, उपचारित सेल दोहरीकरण समय, जीआर 50 और GR_AOC मूल्यों को दर्शाती तालिका। संक्षिप्ताक्षर: पीडीओ = रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स, जीआर = वृद्धि दर, GR_AOC = वक्र पर वृद्धि दर क्षेत्र।

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Discussion

यह लेख एक विधि का वर्णन करता है जिसका उपयोग डिम्बग्रंथि के कैंसर पीडीओ पर पारंपरिक या उपन्यास दवाओं के चिकित्सीय प्रभावों का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। पीडीओ मॉडल में व्यवहार्यता परख करने से पहले शोधकर्ताओं को कई मुद्दों पर विचार करना चाहिए।

सबसे पहले, व्यवहार्यता परख में उपयोग करने के लिए पीडीओ का चयन करते समय, किसी को अपनी आवश्यकताओं के लिए आदर्श ऑर्गेनॉइड प्रकार (ट्यूमर बनाम जलोदर) और मार्ग संख्या निर्धारित करनी चाहिए। हमारे अनुभव में, जलोदर-व्युत्पन्न पीडीओ अधिक तेजी से बढ़ते हैं और ट्यूमर-व्युत्पन्न पीडीओ की तुलना में उत्पन्न करना आसान होता है। क्योंकि यह परख विकास दर पर निर्भर करती है, ऐसे ऑर्गेनोइड का उपयोग करना जो बनने/बढ़ने में लंबा समय लेते हैं, मुश्किल हो सकता है। हमने केवल 4 दिनों से कम के दोहरीकरण समय के साथ पीडीओ लाइनों का सफलतापूर्वक उपयोग किया है।

दूसरा, इस अध्ययन में अपारदर्शी काले 96 अच्छी तरह से प्लेटों का इस्तेमाल किया गया. चूंकि एटीपी व्यवहार्यता परख ल्यूमिनेसेंस-आधारित है, पारदर्शी कुएं सिग्नल की तीव्रता को कम करेंगे और सिग्नल संदूषण उत्पन्न करेंगे। अपारदर्शी दीवार वाली, पारदर्शी नीचे प्लेटें परख के दौरान ऑर्गेनोइड के दृश्य के लिए अनुमति देती हैं और सेल आकृति विज्ञान में उपचार-प्रेरित परिवर्तनों की निगरानी में मदद कर सकती हैं। हालांकि यह लागत से संबंधित एक ताकत है, इस परख की एक सीमा एक 96 अच्छी तरह से थाली, जो नमूने और दवाओं है कि एक साथ मूल्यांकन किया जा सकता है की संख्या सीमित का उपयोग कर रहा है.

तीसरा, चढ़ाया कोशिकाओं की संख्या ध्यान से विचार किया जाना चाहिए और व्यवहार्यता परख के लिए अनुकूलित. पीडीओ लाइनों की परिवर्तनीय वृद्धि दर के कारण यह विशेष रूप से सच है; बहुत कम कोशिकाएं ऑर्गेनोइड नहीं बनाएंगी, और बहुत सी कोशिकाएं ऑर्गेनॉइड अतिवृद्धि का कारण बनेंगी। कोशिकाओं के समान वितरण को सुनिश्चित करने के लिए, एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग किया गया था और उसी बीएमई-टू-मीडिया अनुपात (75:25) को बनाए रखा गया था। बीएमई का यह उच्च प्रतिशत सुनिश्चित करता है कि परख की संपूर्णता के लिए बूंदें जम जाएं। यहां, बीएमई की 3 माइक्रोन बूंदों को कुएं के केंद्र में रखा गया था। यद्यपि छोटी बूंद का आकार बढ़ाया जा सकता है, हम पूरे कुएं को कोटिंग करने के खिलाफ सावधानी बरतते हैं। पूरे कुएं को कोटिंग करने से ऑर्गेनोइड कुएं के किनारों में बस जाएंगे, जो दोनों उनके समग्र विकास को बाधित करेंगे और व्यवहार्यता परख परिणामों को प्रभावित करेंगे। छोटी बूंद का ऑफ-सेंटर प्लेसमेंट तब तक ठीक है जब तक कि यह कुएं के किनारों को नहीं छूता है।

चौथा, आत्म-पाइपिंग मानव त्रुटि का परिचय देता है, लेकिन इसे विस्तार पर ध्यान देने और अतिरिक्त नियंत्रण कुओं को शामिल करने से दूर किया जा सकता है।

अंत में, परख की लंबाई ध्यान से चुना जाना चाहिए. दवाओं के लंबे समय तक संपर्क पीडीओ की व्यवहार्यता को प्रभावित करेगा, कार्रवाई के दवा तंत्र से स्वतंत्र। इस कारण से, कम से कम पांच दिनों में दवा सांद्रता की एक श्रृंखला का परीक्षण करना महत्वपूर्ण है। यह तय करना महत्वपूर्ण है कि क्या मीडिया को लंबी अवधि के लिए बदलने की आवश्यकता होगी क्योंकि विकास कारकों के कम स्तर दवाओं के प्रभाव को बाधित करेंगे36. परख के दौरान मीडिया को बदलने की आवश्यकता होगी या नहीं, यह जांचने के लिए, किसी को दिन 0 और दिन 7 नियंत्रणों के परिणामों की तुलना करने की आवश्यकता है। अनुपचारित पीडीओ नियंत्रण लगातार परख भर में बढ़ने के लिए जारी रखना चाहिए.

चूंकि पीडीओ जटिलता में आगे बढ़ना जारी रखते हैं और मूल के अपने ऊतकों को बेहतर ढंग से पुन: व्यवस्थित करते हैं, उनके उपयोग से दवा की खोज में सुधार होना चाहिए। हालांकि, पीडीओ एक कीमती संसाधन बने रहने की संभावना है और उनके उपयोग को संरक्षित और अनुकूलित करने के लिए लागत प्रभावी तरीकों की आवश्यकता होती है। मध्यम और उच्च-थ्रूपुट तकनीकों के विपरीत, इस प्रोटोकॉल का उपयोग आसानी से उपलब्ध सामग्री और उपकरणों के साथ कम लागत पर ज्ञात और उपन्यास यौगिकों का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। अंत में, इस विधि को विभिन्न कैंसर ऑर्गेनॉइड मॉडल के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा पुरस्कार संख्या R01CA243511 के तहत समर्थित किया गया था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करे। लेखक अपनी संपादकीय टिप्पणियों के लिए डेबोरा फ्रैंक को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Plastic Tubes
15 mL Plastic Tubes
96 well Flat Black Plates MidSci 781968
Advance Organoid Media  see Graham et al 2022 (Jove)
Advanced DMEM/F12 Thermo Fisher 12634028
Automated Cell Counter Thermo Fisher AMQAX1000
Brightfield Microscope
Carboplatin  Teva Pharmaceuticals USA NDC 00703-4246-01
CellTiter-Glo 3D Viability  Promega G9681
Cultrex R & D Systems 3533-010-02
DMSO Sigma Aldrich D2650-100ML
Glutamax Life Technologies 35050061
GR Calculator  http://www.grcalculator.org Online calculator
GraphPad Prism GraphPad Software, Inc.
HEPES Life Technologies 15630080
Matrigel Corning 354230
Microsoft Excel Microsoft
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140122
Plate Rocker
Sterile P10, P200, and P1000 Barrier Sterile Pipette Tips
Sterile P10, P200, and P1000 Pipettes
Tecan Infinte 200Pro Plate Reader; i-Control Software Tecan
TrypLE Thermo Fisher 12605010 Organoid dissociation reagent

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References

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Fashemi, B. E., van Biljon, L., Rodriguez, J., Graham, O., Mullen, M., Khabele, D. Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing. J. Vis. Exp. (199), e65068, doi:10.3791/65068 (2023).

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